碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物，它是以溶菌酶为模板分子，1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体和N-叔丁基丙烯酰胺为混合功能单体，丙烯酰胺修饰碳纳米管为基质，pH9的Tris-HCl缓冲溶液为反应体系，在交联剂、引发剂和催化剂作用下制得的对溶菌酶具有选择性识别能力的表面分子印迹聚合物。本发明的模板分子与功能单体复合时作用位点更多，作用力更强，在分子印迹聚合物的制备过程中可以形成更有效的识别位点，因此对溶菌酶的印迹效果和选择性吸附能力更好。

说明书

技术领域

本发明属于化学与材料领域，涉及一种碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物及其制 备方法。

背景技术

分子印迹技术是一种模拟抗原-抗体相互作用，采用人工合成方法获得空间结构和 结合位点与模板分子相匹配的聚合物的技术。首先，模板分子与功能单体之间产生互补 的相互作用形成复合物，然后在交联剂作用下，在模板-单体复合物周围发生本体聚合 反应形成聚合物，最后在一定条件下除去聚合物中的模板分子，即可得到具有与模板分 子匹配的特定空间结构空穴和识别位点的选择性分子识别材料，即通常所说的分子印迹 聚合物。与天然的生物大分子识别系统相比，合成的分子印迹聚合物有着构象预定性、 特异识别性、长期稳定性以及实施简便性等优点，已被广泛用于色谱分离、固相萃取、 模拟酶催化以及传感器等诸多领域。然而，由于作为印迹模板的蛋白质本身存在体积庞 大、结构复杂、可结合位点多以及构象不稳定等问题，迄今为止，针对蛋白质等生物大 分子的印迹仍然面临着巨大挑战。

表面分子印迹技术是最近发展起来的一种构建在基质表面上的分子印迹方法。该方 法是在聚合溶液中引入基质或将聚合溶液涂覆在基质上，使模板分子和功能单体的聚合 反应发生在基质表面以形成分子印迹聚合物薄膜，从而使分子识别位点暴露在基质表 面。表面分子印迹技术可以克服传统包埋法存在的空间位阻大的问题，使模板分子能够 自由地进出基质表面聚合物中的特异性识别位点。同时，由于基质具有较强的机械稳定 性，因此可以有效调节聚合物的强度以适应实际应用的需要。以碳纳米管为基质，采用 预组装或自组装的方法对其表面进行修饰，然后在其表面接枝一层分子印迹聚合物薄 膜，可以制备出一系列具有不同识别位点和空腔结构的碳纳米管表面分子印迹聚合物， 从而解决蛋白质分子印迹聚合物合成和识别中存在的技术问题。

离子液体是由有机阳离子和无机阴离子组成的在室温或近于室温下呈液态的有机 盐，具有无毒、低温不挥发、对水和空气稳定、溶解性好、稳定性高、极性强、成膜性 能好以及易于改性的优点。离子液体由于分子结构和化学性质的独特性，在分离科学领 域的应用很广，如用作液液萃取的溶剂，固相萃取的吸附剂、色谱柱的涂层材料以及分 子印迹聚合物的致孔剂、助溶剂和功能单体。在众多离子液体中，咪唑型离子液体是研 究最多也是应用最广的离子液体。由于咪唑离子液体具有特殊的咪唑阳离子和无机阴离 子结构，在与蛋白质等生物大分子复合时可以提供较强的与之互补的多重相互作用，包 括静电、氢键和π-π堆积作用。N-叔丁基丙烯酰胺在分子印迹聚合物的制备和识别过程 中能够提供较强的疏水相互作用。因此，以亲水性的离子液体以及疏水性的N-叔丁基 丙烯酰胺为混合功能单体，通过调节两种功能单体的配比以得到与模板蛋白质在空间结 构和作用力上高度匹配的分子印迹聚合物，应用前景良好。

发明内容

本发明的目的在于提供一种碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物及其制备方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

本发明所提供的碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物，它是以溶菌酶为模板分子， 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体和N-叔丁基丙烯酰胺为混合功能单体，丙烯酰 胺修饰碳纳米管为基质，pH9的Tris-HCl缓冲溶液为反应体系，在交联剂、引发剂和催 化剂作用下制得的对溶菌酶具有选择性识别能力的表面分子印迹聚合物。

优选地，所述丙烯酰胺修饰碳纳米管、溶菌酶、N-叔丁基丙烯酰胺、1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体的重量比依次为(20～40)∶(15～25)∶(30～120)∶(160～400)。

进一步优选地，所述丙烯酰胺修饰碳纳米管、溶菌酶、N-叔丁基丙烯酰胺、1-烯丙 基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体的重量比依次为30∶18∶(80～100)∶(180～220)。

优选地，所述交联剂为N,N’-亚甲基双丙烯酰胺。

进一步优选地，所述交联剂与丙烯酰胺修饰碳纳米管的重量比为3.3～5∶1。

优选地，所述引发剂为过硫酸铵。

优选地，所述催化剂为N,N,N',N'-四甲基乙二胺。

本发明进一步提供一种制备碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物的方法，它包括以 下步骤：

1)将15～25mg溶菌酶溶于30mL pH9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入30～120mg N- 叔丁基丙烯酰胺和160～400mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅 拌2h；

2)加入20～40mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入60～200mg N,N’-亚 甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15-20分钟；

3)加入20-40mg过硫酸铵，50-100μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧 15-20分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌12-48h；

4)将固液两相分离，对固相产物采用pH9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤3-5次，再用 超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，即得。

优选地，所述方法包括以下步骤：

1)将18mg溶菌酶溶于30mL pH9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入80～100mg N-叔丁 基丙烯酰胺和180～220mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；

2)加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入100～150mg N,N’-亚甲 基双丙烯酰胺，通氮气除氧15-20分钟；

3)加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15-20分 钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌12-48h；

4)将固液两相分离，对固相产物采用pH9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤3-5次，再用 超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，即得。

优选地，所述丙烯酰胺修饰碳纳米管是对羧基化碳纳米管进行表面化学修饰得到 的，所述羧基化碳纳米管的管径≤8nm，长度为20～30μm，羧基含量为3.86wt％，纯度 >95％，表面化学修饰的方法是：称取0.6g羧基化碳纳米管，加入60mL二氯亚砜和10滴 二甲基甲酰胺，70℃回流24h，溶剂蒸干后，继续加入3g丙烯酰胺和50mL二甲基甲酰 胺，超声溶解10min，于45℃回流24h，产物用超纯水洗至中性，60℃烘干。

本发明的有益效果是：

1)由于引入了极性的1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体和疏水性的N-叔丁基 丙烯酰胺两种功能单体，使得模板分子与功能单体复合时作用位点更多，作用力更强， 在分子印迹聚合物的制备过程中可以形成更有效的识别位点。因此，对溶菌酶的印迹效 果和选择性吸附能力比只以离子液体为功能单体制备的分子印迹聚合物更好。

2)由于碳纳米管的比表面积大，机械强度高，形成的印迹薄膜铺展于碳纳米管的 表面，呈现出多孔的网状结构，使暴露在表面的印迹位点更多，空间位阻更小，模板分 子洗脱更完全，吸附更迅速，印迹效果更好，选择性吸附能力更强。

3)由于聚合反应在pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中进行，溶菌酶表面暴露的带负电荷 氨基酸能够与离子液体的咪唑阳离子通过静电、氢键和π-π堆积作用形成稳定性更高的 复合物，从而在碳纳米管表面形成更多对溶菌酶具有特异性识别能力的有效印迹位点。

以上这些优良的性能使其在溶菌酶识别、分离和纯化领域具有很好的应用前景，同 时也为解决其它蛋白质分子印迹聚合物合成和识别中存在的问题奠定了基础。

附图说明

图1：实施例1-11碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物合成路线示意图。

图2：实施例12-19碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物合成路线示意图。

图3：1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸功能单体含量对碳纳米管表面溶菌酶分子印迹 聚合物和空白分子印迹聚合物吸附效果的影响曲线图。

图4：1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸功能单体含量不同的分子印迹聚合物和空白分 子印迹聚合物的扫描电镜图。(a)功能单体200mg分子印迹聚合物；(b)功能单体200mg 空白分子印迹聚合物；(c)功能单体300mg分子印迹聚合物；(d)功能单体300mg空 白分子印迹聚合物。

图5：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂含量不同的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚 合物对溶菌酶的吸附量(以1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸为功能单体的聚合体系)。

图6：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂含量不同的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚 合物的扫描电镜图。(a)交联剂80mg分子印迹聚合物；(b)交联剂80mg空白分子印 迹聚合物；(c)交联剂100mg分子印迹聚合物；(d)交联剂100mg空白分子印迹聚合 物；(e)交联剂150mg分子印迹聚合物；(f)交联剂150mg空白分子印迹聚合物。

图7：N-叔丁基丙烯酰胺和1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸功能单体摩尔比不同的分 子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附量。

图8：N-叔丁基丙烯酰胺和1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸摩尔比不同的分子印迹聚 合物和空白分子印迹聚合物的扫描电镜图。(a)功能单体摩尔比20％：80％分子印迹聚 合物；(b)功能单体摩尔比20％：80％空白分子印迹聚合物；(c)功能单体摩尔比40％： 60％分子印迹聚合物；(d)功能单体摩尔比40％：60％空白分子印迹聚合物；(e)功 能单体摩尔比50％：50％分子印迹聚合物；(f)功能单体摩尔比50％：50％空白分子印 迹聚合物。

图9：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂含量不同的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚 合物对溶菌酶的吸附量(以N-叔丁基丙烯酰胺和1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸为功能单 体的聚合体系)。

图10：N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂含量不同的分子印迹聚合物和空白分子印迹 聚合物的扫描电镜图(以N-叔丁基丙烯酰胺和1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸为功能单体 的聚合体系)。(a)交联剂100mg分子印迹聚合物；(b)交联剂100mg空白分子印迹聚 合物；(c)交联剂150mg分子印迹聚合物；(d)交联剂150mg空白分子印迹聚合物；(e) 交联剂200mg分子印迹聚合物；(f)交联剂200mg空白分子印迹聚合物。

图11：合成的碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物对溶菌酶 的等温吸附曲线。

图12：以1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体和N-叔丁基丙烯酰胺为混合功能单 体合成的分子印迹聚合物对溶菌酶和细胞色素C的选择性吸附能力。

图13：功能单体、交联剂以及合成的碳纳米管表面溶菌酶分子印迹和空白印迹聚合 物的红外光谱图。(a)N-叔丁基丙烯酰胺；(b)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺；(c)1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸；(d)分子印迹聚合物(离子液体功能单体)；(e)空白分子印迹聚合 物(离子液体功能单体)；(f)分子印迹聚合物(混合功能单体)；(g)空白分子印迹聚 合物(混合功能单体)。

图14：功能单体以及合成的碳纳米管表面溶菌酶分子印迹和空白印迹聚合物的热重 分析图。

具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。表1为实施例1～19 分子印迹聚合物合成过程中各反应物的用量表。

1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，购自上海成捷化学有限公司；丙烯酰胺修 饰的碳纳米管，是对羧基化碳纳米管进行表面化学修饰得到的，羧基化碳纳米管购自中 国科学院成都有机化学有限公司，管径≤8nm，长度20～30μm，羧基含量3.86wt％，纯 度>95％。表面化学修饰的方法是：称取0.6g羧基化碳纳米管，加入60mL二氯亚砜和 10滴二甲基甲酰胺，70℃回流24h，溶剂蒸干后，继续加入3g丙烯酰胺和50mL二甲 基甲酰胺，超声溶解10min，于45℃回流24h，产物用超纯水洗至中性，60℃烘干。

表1实施例1～19的材料用量表

实施例1：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入200mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入100mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例2：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入300mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入100mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例3：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入350mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入100mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例4：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入400mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入100mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例5：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入400mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入60mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过 硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下 常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤 5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹 聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模 板分子溶菌酶。

实施例6：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入400mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入80mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过 硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下 常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤 5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹 聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模 板分子溶菌酶。

实施例7：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入400mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入150mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例8：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入400mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入200mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例9：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入400mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入250mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例10：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入400mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入300mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例11：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入400mg 1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管， 超声分散均匀，加入350mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg 过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件 下常温磁力搅拌48h。将固液两相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗 涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印 迹聚合物。空白分子印迹聚合物的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入 模板分子溶菌酶。

实施例12：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入35mg N-叔丁基丙 烯酰胺(溶于1mL乙醇中)和320mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温 下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入100mg N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲 基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌48h。将固液两 相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋 白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物。空白分子印迹聚合物 的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子溶菌酶。

实施例13：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入70mg N-叔丁基丙 烯酰胺(溶于1mL乙醇中)和240mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温 下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入100mg N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲 基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌48h。将固液两 相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋 白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物。空白分子印迹聚合物 的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子溶菌酶。

实施例14：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入87.5mg N-叔丁基 丙烯酰胺(溶于1mL乙醇中)和200mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常 温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入100mg N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲 基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌48h。将固液两 相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋 白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物。空白分子印迹聚合物 的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子溶菌酶。

实施例15：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入105mg N-叔丁基丙 烯酰胺(溶于1mL 乙醇中)和160mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常温 下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入100mg N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲 基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌48h。将固液两 相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋 白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物。空白分子印迹聚合物 的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子溶菌酶。

实施例16：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入87.5mg N-叔丁基 丙烯酰胺(溶于1mL 乙醇中)和200mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常 温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入60mg N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲 基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌48h。将固液两 相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋 白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物。空白分子印迹聚合物 的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子溶菌酶。

实施例17：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入87.5mg N-叔丁基 丙烯酰胺(溶于1mL 乙醇中)和200mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常 温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入80mg N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲 基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌48h。将固液两 相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋 白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物。空白分子印迹聚合物 的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子溶菌酶。

实施例18：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入87.5mg N-叔丁基 丙烯酰胺(溶于1mL乙醇中)和200mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常 温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入150mg N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲 基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌48h。将固液两 相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋 白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物。空白分子印迹聚合物 的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子溶菌酶。

实施例19：

将18mg溶菌酶溶于30mL pH 9的Tris-HCl缓冲溶液中，加入87.5mg N-叔丁基 丙烯酰胺(溶于1mL乙醇中)和200mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸离子液体，常 温下磁力搅拌2h；加入30mg丙烯酰胺修饰碳纳米管，超声分散均匀，加入200mg N,N’- 亚甲基双丙烯酰胺，通氮气除氧15分钟；加入40mg过硫酸铵，50μL N,N,N',N'-四甲 基乙二胺，继续通氮气除氧15分钟，然后在无氧条件下常温磁力搅拌48h。将固液两 相分离，对固相产物采用pH 9的Tris-HCl缓冲溶液洗涤5次，再用超纯水洗脱至无蛋 白质残留，冷冻干燥，得到碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物。空白分子印迹聚合物 的合成与洗脱方法与此相同，只是在合成过程中未加入模板分子溶菌酶。

图1为上述实施例1-11碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物合成示意图。首先， 溶菌酶与功能单体1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸通过静电、氢键和π-π堆积作用形成复 合物；功能单体、交联剂与丙烯酰胺修饰碳纳米管之间发生自由基引发聚合物反应，从 而将溶菌酶/功能单体复合物包裹在碳纳米管表面；洗脱出模板分子，碳纳米管表面留下 对溶菌酶具有特异性吸附能力的印迹位点。

图2为上述实施例12-19碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物合成示意图。与实 施例1-12相比，在实施例13-20中除了加入极性的1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸作为 功能单体外，还加入了疏水性的N-叔丁基丙烯酰胺作为混合功能单体。因此溶菌酶在 与这两种功能单体复合时，作用位点更多，作用力更强，得到的分子印迹聚合物吸附性 能和印迹效果有可能更强。

图3为上述实施例1-4加入不同含量1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸功能单体合成的 分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附量。由图可知，随着离子液体的 增加，空白分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附量显著下降，而分子印迹聚合物先下降后增 加。当离子液体含量为200-350mg(功能单体/模板分子比约为11-19)时，空白分子印 迹聚合物对溶菌酶的吸附量大于分子印迹聚合物，而当离子液体的含量达到400mg(功 能单体/模板分子比约为22)时，分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附量明显高于空白分子 印迹聚合物，其印迹因子可以达到2.1，选择性吸附能力增强。

图4为上述实施例1-2加入200和300mg 1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸功能单体合 成的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物的扫描电镜图。从图中可以看出，分子印迹 聚合物和空白分子印迹聚合物的表面形貌存在很大差异，对于分子印迹聚合物，溶菌酶 的加入改善了碳纳米管的分散性，碳纳米管表面形成的聚合物涂层光滑，呈明显的网状 结构，而空白分子印迹聚合物，由于分散性不太好，碳纳米管表面形成的聚合物有板结 现象。

图5为上述实施例4-11加入不同含量N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂合成的分子印 迹聚合物和空白分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附量。从图中可以看出，当交联剂的含量 为60mg时，没有印迹效果；当交联剂的含量为80-250mg时，分子印迹聚合物对溶菌 酶的吸附量明显高于空白分子印迹聚合物，印迹效果显著；而当交联剂增加到300-350 mg时，印迹效果丧失。交联剂的功能是通过自由基引发聚合反应将模板分子/功能单体 复合物固定下来，去除模板后，形成稳定的空间结构。交联剂的量可以影响分子印迹聚 合物空间结构的柔韧性和刚性，当交联剂的量过多时，大量印迹位点被包埋在聚合物的 内部，而当交联剂的量较少时，由于分子印迹聚合物的柔性太大，在其表面形成的印迹 位点非常有限。因此，合理的交联剂量可以使分子印迹聚合物具有最佳的柔韧性，使模 板蛋白既能顺利从印迹孔穴中洗脱出来，又能快速扩散进入印迹孔穴，同时减少非特异 性结合，获得最佳印迹效果。在本发明中，最佳的交联剂用量为100mg，其印迹因子可 以达到4.5。

图6为上述实施例6，4，7加入80，100和150mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂 合成的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物的扫描电镜图。从图中可以看出，随着交 联剂的增加，碳纳米管表面的聚合物涂层逐步增厚，当交联剂的量达到150mg时，由 于生成的聚合物涂层较厚，已经看不出明显的碳纳米管形貌，因此印迹效果与交联剂为 100mg时相比反而有所下降。

图7为上述实施例4，12-15加入不同摩尔比N-叔丁基丙烯酰胺和1-烯丙基-3-甲基 咪唑六氟磷酸功能单体合成的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附 量。由图可知，当N-叔丁基丙烯酰胺和1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸的摩尔比为50％： 50％时，合成的分子印迹聚合物印迹效果最好，印迹因子为1.6。除此之外，与只用离 子液体作为功能单体合成的分子印迹聚合物相比，N-叔丁基丙烯酰胺的加入，增加了 溶菌酶中疏水性氨基酸与功能单体之间的相互作用，因此总的吸附量增加。

图8为上述实施例12-14加入N-叔丁基丙烯酰胺和1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸 摩尔比为20％：80％，40％：60％和50％：50％合成的分子印迹聚合物和空白分子印 迹聚合物的扫描电镜图。从图中可知，增加混合功能单体中N-叔丁基丙烯酰胺的比例， 碳纳米管表面形成的分子印迹聚合物形貌得到较大的改善，当N-叔丁基丙烯酰胺占20％ 时，涂层表面有一定的板结现象，当N-叔丁基丙烯酰胺增加至40％和50％时，呈现出 多孔的网站结构。相反地，N-叔丁基丙烯酰胺的增加不能改善空白分子印迹聚合物的表 面形貌，由于碳纳米管的分散性不好，合成的聚合物板结现象依然严重。

图9为上述实施例14，16-19加入不同含量N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂合成的 分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附量。从图中可知，当交联剂的含 量为150mg时，分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附量明显高于空白分子印迹聚合物，印迹 因子约为2.3。

图10为上述实施例14，18-19加入100，150和200mg N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交 联剂合成的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物的扫描电镜图。从图中可知，交联剂 的含量对分子印迹聚合物的形貌影响显著，当交联剂为100，150mg时，碳纳米管表面 形成的聚合物呈多孔的网状结构，而当交联剂增加到200mg时，由于交联度太大，碳纳 米管表面生成的聚合物太厚，已经看不到碳纳米管的管状结构。交联剂为150mg时碳纳 米管表面涂层分布最均匀，网状结构最好，因此印迹效果也最好。

表2比较了不同含量N,N’-亚甲基双丙烯酰胺交联剂合成的分子印迹和空白印迹聚 合物的比表面积及其对溶菌酶的吸附量。从表中可以看出，对分子印迹聚合物而言，随 着交联剂的增加，其比表面积从44.48m²/g增加到105.68m²/g，其对溶菌酶的吸附量呈 先增大后减小的趋势，一方面，当交联剂较少时，所制备出的聚合物刚性不够，不能产 生足够多的印迹位点，因此材料的印迹效果不明显；另一方面，当交联剂过多时，由于 在功能单体/模板蛋白复合物表面形成的聚合物涂层太厚导致印迹位点包埋过深，反而降 低分子印迹聚合物的特异性吸附能力，呈现出的结果是吸附总量和印迹效果均下降。对 于空白印迹聚合物，随着交联剂的增加，其比表面积从48.88m²/g增加至117.43m²/g， 其对溶菌酶的吸附量总体来说呈增大趋势，当交联剂增加至100-200mg时，分子印迹 聚合物的比表面积比空白印迹聚合物小，但是在此区间内分子印迹聚合物对溶菌酶的吸 附量高于空白印迹聚合物，特别是当交联剂为150mg时，印迹因子达到2.3，印迹效果 明显。这些结果均表明分子印迹聚合对溶菌酶的吸附量大小由特异性吸附和非特异性吸 附共同决定，而空白印迹聚合物对溶菌酶的吸附量则主要取决于非特异性的物理吸附。

表2不同含量NNMBA交联剂合成的分子印迹和空白印迹聚合物的 比表面积和吸附量比较

图11为上述实施例4和实施例18合成的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物对 溶菌酶的等温吸附曲线。从图中可知，随着溶液中溶菌酶浓度增加，分子印迹聚合物和 空白分子印迹聚合物对溶菌酶的吸附量也随之增加，且分子印迹聚合物对溶菌酶的亲和 力明显高于空白分子印迹聚合物，这主要归因于碳纳米管表面形成的对溶菌酶具有特异 性识别能力的印迹位点。

对图11的等温吸附数据进行langmuir拟合，结果见表3。从表中可知，与只有1- 烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸功能单体的体系相比，以N-叔丁基丙烯酰胺和1-烯丙基-3- 甲基咪唑六氟磷酸混合功能单体合成的分子印迹聚合物的吸附容量更大，印迹效果更 好。这主要是因为作为印迹模板的溶菌酶表面存在多种作用位点，当其与功能单体复合 时，带负电的、极性的和含芳香基的氨基酸可以与1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸发生静 电、氢键和π-π堆积作用，疏水性的氨基酸可以与N-叔丁基丙烯酰胺发生疏水相互作用， 因此模板蛋白与功能单体之间的作用力更强，得到的分子印迹聚合物吸附容量和印迹效 果更好。

表3本发明合成的分子印迹聚合物和空白分子印迹聚合物 等温吸附数据的Langmuir拟合参数

图12比较了上述实施例18以1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸和N-叔丁基丙烯酰胺 为混合功能单体合成的分子印迹聚合物对溶菌酶和细胞色素C的选择性吸附能力。结果 显示，合成的碳纳米管表面溶菌酶分子印迹聚合物对溶菌酶、细胞色素C的印迹因子分 别为1.73和1.27，对细胞色素C的选择性因子为1.36。分子印迹对聚合物对细胞色素C 也存在一定的印迹效果，这主要是因为细胞色素C与溶菌酶的分子量和等电点非常接 近，导致少量的细胞色素C可以进入溶菌酶模板洗脱后留下的印迹孔穴中。这些结果表 明，本发明合成的分子印迹聚合物对溶菌酶具有较强的选择性吸附能力，若吸附体系中 存在细胞色素C等共存干扰蛋白时，分子印迹聚合物会优先选择吸附溶菌酶。

图13比较了功能单体、交联剂以及合成的碳纳米管表面溶菌酶分子印迹和空白印 迹聚合物的红外光谱图。从图中可以看出，分子印迹(d)和空白分子印迹聚合物(e)的 红外光谱特征峰几乎是重合的，说明两者的化学组成是一致的，溶菌酶已经洗脱完全。 同样地，从图中还可以看出，以离子液体(d)或混合功能单体(f)合成的分子印迹聚 合物的红外光谱也非常相似，这可以解释如下：功能单体1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸 (c)咪唑环的特征峰在1000～1750cm^-1范围内与N-叔丁基丙烯酰胺(a)和N,N’-亚甲 基双丙烯酰胺(b)重合，因此当参与自由基引发聚合反应时，其聚合物中咪唑环的特 征峰被掩盖。827cm^-1为离子液体六氟磷酸的特征峰，在合成的分子印迹和空白分子印 迹聚合物中均不明显，这可能是因为离子液体参与聚合反应后六氟磷酸阴离子仍然存留 在溶液中。

图14比较了功能单体以及合成的碳纳米管表面溶菌酶分子印迹和空白印迹聚合物 的热重分析图。从图中可知，1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸的失重主要发生在300～450 ℃之间，N-叔丁基丙烯酰胺的失重主要发生在50～120℃之间。采用相同方法合成的分 子印迹聚合物和空白印迹聚合物的失重趋势基本相同，说明碳纳米管表面形成的聚合物 厚度是一致的，分子印迹和空白印迹聚合物对溶菌酶的识别差异不能归因于涂层厚度， 而应归因于具有特异性识别能力的印迹孔穴的产生。对于以离子液体或混合功能单体合 成的分子印迹和空白分子印迹聚合物而言，从室温上升到100℃时发生第一次失重，质 量损失分别为13.24％和13.59％左右，主要来源于聚合物中水分的蒸发和部分N-叔丁基 丙烯酰胺的分解；在300～450℃之间发生第二次失重，质量损失分别为48.63％和71％左 右，主要源于聚合物中离子液体和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的分解，最后的残留物质主 要是碳纳米管。从图中我们还可以得知，相比于以离子液体为功能单体的合成体系而言， 当功能单体为1-烯丙基-3-甲基咪唑六氟磷酸和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺混合单体时，碳 纳米管表面形成的聚合物涂层更厚，这也是其吸附容量更大的一个原因。总的来说，合 成的分子印迹聚合物具有良好的热稳定性。