作为血管疾病和妊娠并发症的生物标记的NT-proCNP

摘要

本发明涉及预后和/或诊断对象中血管相关疾病及特别是妊娠相关血管疾病的方法。本发明基于发现在人和动物对象中血管疾病事件阳性预测与循环的标记NTproCNP(也称作NT-CNP)浓度存在正相关性。此外，本发明基于发现在妊娠期间发生血管相关不利事件与母体循环中循环的标记NTproCNP的浓度之间也存在正相关性。

说明书

相关申请和引入参考

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发明领域

本发明涉及预后和/或诊断对象中的血管相关疾病特别是妊娠相关血管疾病的方法。

发明背景

血管疾病、包括与妊娠并发症相关或促成妊娠并发症的血管疾病通常在对象中检测不到。因此，需要改良的方法以早期预测风险对象中的血管疾病，并且优选在疾病发生之前。尽管已鉴别了预测冠状动脉病或卒中的一些风险因子，包括高血压、高脂血症、家族史、糖尿病和吸烟，血管事件在高达30％不具有这些不利风险因子的对象中发生。尽管这些血管疾病表现的状况被最佳管理，但是血管事件在出现后持续发生(每年10-20％对象)。这些事实提出了更好了解血管疾病及改良的检测和监测手段的需求。

例如，预测对象中血管疾病风险的生物标记通过在发生威胁器官功能的病理学变化和/或妊娠期间不利事件发生之前鉴别对象而改善治疗前景，由此会使得对风险对象的特异治疗个体化。

C型利尿钠肽(CNP)属于对于保持心血管体内稳态是重要的利尿钠肽家族。与心脏激素ANP和BNP不同，CNP在广泛组织中表达，包括中枢神经系统、生殖系统、骨骼和血管内皮的组织。对内皮CNP的调节仍不太了解，但是体外研究提示一系列细胞因子，包括TGFβ和其它生长因子如PDGF和FGF。

CNP局部起作用并且在来源处快速降解，但是CNP基因表达产物可以在血浆中测量。相反，C型利尿钠肽的氨基末端前肽在血浆中不被快速降解，因此提供了测量体内组织CNP产生的新方法(Prickett TCR et al.(2001)Biochemical and Biophysical Research Communications 286(3):513-517).

就发明人所知，仅有一项研究，其中检查了CNP和/或NTproCNP肽水平与内皮功能及发生动脉硬化的血管风险的相关性。在该项研究中，117位老年男性被选择以建立血管疾病风险，较低NTproCNP浓度与较高血管风险评分及受损的内皮功能相关(Vlachopoulos C et al(2010)Atherosclerosis211(2):649-55)。这些发现与血管系统中的较低CNP(由血浆中肽的较低浓度反映)使对象倾向于动脉硬化的观点一致。相反，本发明人发现与该唯一早期研究相反，事实上血浆NTproCNP增加与血管风险相关。

另外，先前未检测CNP浓度特别是NTproCNP浓度在妊娠背景中的作用，特别是在妊娠期间发生血管相关不利事件的妊娠对象中的作用。

发明概述

本发明基于如下前提：NTproCNP是对象中血管疾病的生物标记及另外其是预测妊娠对象中的血管相关不利事件风险的生物标记。特别地，本发明基于如下发现：在对象中血管疾病事件的阳性预测与人和动物中的循环的标记NTproCNP(也称为NT-CNP)的浓度之间存在正相关。另外，本发明基于如下发现：在妊娠期间血管相关不利事件的发生与母体循环中循环的标记NTproCNP的浓度之间也存在正相关。

在一个实施方案中，本发明提供了预测成人对象获得血管疾病的风险的方法，包括：

(i)测量来自对象的生物学样品中的N-末端前C型利尿钠肽(N-terminal pro-C-type natriuretic peptide，NTproCNP))，及

(ii)将测量的NTproCNP水平与来自合适对照群体的参照区间相比较，其中与对照群体相比，NTproCNP的循环水平增加预示获得血管疾病的风险增加，并且进一步地，其中所述测量步骤包括检测NTproCNP与选择性结合NTproCNP的结合剂之间的结合。

在一个实例中，所述方法进一步包括步骤(iii)当发现所述对象与来自对照群体的循环的NTproCNP的水平相比具有增加的循环的NTproCNP时给予对象治疗方案。

在进一步的实例中，所述方法进一步包括测量来自对象的第一个生物学样品中的NTproCNP水平，及测量第二个生物学样品中的NTproCNP水平，其中所述第二个生物学样品取自与第一个样品相同的对象但是是在后来时间取样，以及比较所述第一个和第二个样品中的NTproCNP水平，其中第一个和第二个样品间NTproCNP循环水平的增加表示获得血管疾病的风险增加。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断成人对象中血管疾病的方法，包括：

(i)测量来自对象的生物学样品中的N-末端前C型利尿钠肽(NTproCNP)，及

(ii)将测量的NTproCNP水平与来自合适对照群体的参照区间相比较，其中与对照群体相比，NTproCNP的循环水平增加预示血管疾病，并且进一步地，其中所述测量步骤包括检测NTproCNP与选择性结合NTproCNP的结合剂之间的结合。

在一个实例中，所述方法进一步包括步骤(iii)当发现所述对象与来自对照群体的循环的NTproCNP水平相比具有增加的循环的NTproCNP时给予对象治疗方案。

在任一实施方案的进一步实例中，可以测量生物学样品中的NTproCNP一次以上。例如，可以在若干小时、天、周、月或年的时间测量一次、两次、三次、四次、五次、10次、15次等。

在进一步的实例中，所述方法包括测量来自对象的第一个生物学样品中的NTproCNP水平，及测量第二个生物学样品中的NTproCNP水平，其中所述第二个生物学样品取自与第一个样品相同的对象但是是在后来时间取样，以及比较所述第一个和第二个样品中的NTproCNP水平，其中第一个和第二个样品之间NTproCNP循环水平的增加指示血管疾病的发生和/或血管疾病的持续。第一个和第二个样品之间的时间典型是由临床医生决定。这可以是例如若干分钟、小时、天、周、月或年。

在另一个实施方案中，本发明提供了诊断成年对象中动脉硬化的方法，包括：

(i)测量来自对象的生物学样品中的N-末端前C型利尿钠肽(NTproCNP)，及

(ii)将测量的NTproCNP水平与来自合适对照群体的参照区间相比较，其中与对照群体相比，NTproCNP的循环水平增加指示动脉硬化，并且进一步地，其中所述测量步骤包括检测NTproCNP与选择性结合NTproCNP的结合剂之间的结合

在一个实例中，所述方法进一步包括步骤(iii)当发现所述对象与对照群体中的循环NTproCNP水平相比具有增加的循环NTproCNP时给予对象动脉硬化治疗方案。

本发明中“合适对照群体”是指已知血管信息的性别和年龄匹配的对象。对照群体用于提供合适的参照区间(reference interval)，由此比较测量的NT-CNP水平。

本发明中“血管疾病”可以选自如下一或多种：冠状动脉病(CAD)、急性冠脉综合征(ACS)、不稳定型心绞痛、心肌梗塞；急性冠脉缺血综合征、血栓性卒中；短暂性缺血性发作(TIA)、外周动脉疾病(PAD)、深静脉血栓形成(DVT)、动脉硬化、动脉粥样硬化、心房颤动、导管血栓性闭塞；血栓性闭塞和再闭塞和任何血管的动脉血栓形成，以及妊娠相关血管疾病。

在一个实例中，血管疾病是冠状动脉病。在另一个实例中，血管疾病是动脉硬化。在另一个实例中，血管疾病是动脉粥样硬化。

在另一个实施方案中，本发明提供了预测妊娠对象获得妊娠相关血管疾病的风险的方法，包括：

(i)测量来自妊娠对象的生物学样品中的N-末端前C型利尿钠肽(NTproCNP)，及

(ii)将NTproCNP的测量水平与来自合适妊娠对象对照群体的参照区间相比较，

其中与对照群体的参照区间相比，测量的NTproCNP循环水平增加预示获得妊娠相关血管疾病，并且进一步地，其中所述测量步骤包括检测NTproCNP与选择性结合NTproCNP的结合剂之间的结合。

在一个特定实例中，所述方法强力预示在妊娠期间妊娠相关血管疾病的发生。在进一步实例中，所述方法预测妊娠相关血管事件发生的阳性预测值为至少78％。换句话说，78％的显示增加的NTproCNP水平的病例将经历妊娠相关血管事件。

在一个特定实例中，妊娠相关血管疾病是不利事件，其可发生在妊娠(怀孕)期间的妊娠雌性对象中或者发生在发育的胎儿中。根据本发明这种病症可以选自加速的胎儿生长、胎儿生长迟缓、流产、胎盘早剥、先兆子痫(妊娠高血压)、高血压、早产(包括自发和先兆早产)、产前产后出血、高血糖症、脐血管疾病、胎盘生长疾病和HELLP综合征或者这些的任何组合。在一个实例中，胎盘生长疾病是子宫内生长受限(IUGR)。在另一个实例中，胎盘生长疾病是马蹄绒毛组织炎、缺血或胎盘灌注不足。

评估这种不利事件的方法是本领域技术人员已知的。这种方法学包括超声、多普勒扫描、测量血压、验血和/或羊膜穿刺。

本发明“妊娠对象对照群体”是指具有无并发性/正常妊娠的处在妊娠同期的年龄匹配的对象。对照群体用于提供合适的参照区间，以比较测量的NTproCNP水平。在一个实例中，对照对象不患有选自以下的一或多种病症：肾功能受损、慢性肝病、代谢性骨病或慢性心脏病，因为这些病症牵涉人工升高NTproCNP水平。

在一个实例中，在怀孕20-24周确定NTproCNP测量。在另一个实例中，在怀孕24周确定NTproCNP测量。

在一个实例中，NTproCNP血浆浓度>13.3pmol/L预示在对象中不利事件发生。

在另一个实施方案中，本发明提供了预测妊娠对象获得妊娠相关血管疾病的风险的方法，包括：

(i)在第一个时间点测量来自妊娠对象的生物学样品中的N-末端前C型利尿钠肽(NTproCNP)水平，及

(ii)在第二个时间点测量来自相同对象的生物学样品中的NTproCNP水平，

其中第一个和第二个时间点之间NTproCNP循环水平增加预示妊娠相关血管疾病，并且进一步地，其中所述测量步骤包括检测NTproCNP与选择性结合NTproCNP的结合剂之间的结合。

在一个特定实例中，妊娠相关血管疾病是上述不利事件。

在一个实例中，所述第一个时间点是在怀孕24周之前，第二个时间点是在怀孕24周或之后。

在另一个实例中，所述第一个时间点是大约怀孕20周，第二个时间点是大约怀孕24周、28周、32周或36周。

在另一个实例中，当第一个和第二个时间点间隔4周时，循环NTproCNP水平增加至少大约25-33Δ％(变化百分比)预示对象中妊娠相关血管疾病或不利事件发生。

应理解本文所用术语"Δ％"是给定变量(即NTproCNP水平或浓度)的变化百分比。Δ％是通过取NTproCNP终浓度及减去NTproCNP初始浓度并且将这个值除以NTproCNP初始浓度而确定，其中结果以百分比表示。因此，非限制性例子是，从初始NTproCNP浓度13pmol/L增加4pmol/L代表31％变化。

为清楚起见，增加至少大约25-33Δ％包括例如25、26、27、28、29、30、31、32、33Δ％(％变化)，及它们之间的分数。

在另一个实例中，所述方法进一步包括在进一步的时间点测量生物学样品中的NTproCNP。优选地，这包括以4周间隔比较样品间NTproCNP浓度，其中差异>4pmol/L预示对象中的不利事件。

术语“测量生物学样品中的NTproCNP”是指使得能确定样品中的NTproCNP肽水平或浓度的方法学。在一个实例中，NTproCNP浓度表示为pmol/L。在另一个实例中，NTproCNP浓度表示为变化百分比(Δ％)。术语NTproCNP浓度或NTproCNP水平可以互换使用。

在本发明任何方法的一个实例中，生物学样品是体液。在另一个实例中，体液选自血浆、血液、血清、尿、滑液、脑脊液、淋巴、精液、羊水、阴道分泌物或任何其它体液。在一个特定实例中，生物学样品是循环血浆。

在另一个实施方案中，本发明还提供了预测非妊娠对象在妊娠期间获得妊娠相关血管疾病的风险的方法，包括：

(i)在妊娠前第一个时间点测量来自对象的生物学样品中的NTproCNP；

(ii)在妊娠期间第二个时间点测量来自相同对象的生物学样品中的NTproCNP；

(iii)比较第一个和第二个时间点NTproCNP的测量水平，其中第一个和第二个时间点NT-CNP循环水平的变化预示妊娠期间妊娠相关血管疾病，进一步地，其中所述测量步骤包括检测NTproCNP与选择性结合NTproCNP的结合剂之间的结合。

在一个实例中，在从怀孕4周直至20周的任何时间点测量的第一个时间点和第二个时间点间循环水平或浓度没有显著降低预示对象妊娠相关血管疾病或不利事件。在进一步实例中，第二个时间点可以取自怀孕8、12、16或20周，但是不排除取样点在怀孕5、6、7、9、10、11,13、14、15、17、18和/或19周。在另一个实例中，第二个时间点相应于妊娠筛查访问，其典型是在大约怀孕12周进行。

在另一个实例中，第一个和第二个时间点间NTproCNP循环水平增加预示妊娠相关血管疾病。在一个实例中，第二个时间点在至少怀孕24周。在另一个实例中，第二个时间点在至少怀孕28周、32周或36周。

在另一个实例中，所述方法可以包括在妊娠期间一或多个进一步时间点测量NTproCNP。例如，在妊娠期间可以进行1、2、3、4、5、7、8次测量。在进一步实例中，间隔4周的连续测量间>4pmol/L差异预示妊娠相关血管疾病。在另一个实例中，其中第一个和第二个时间点间隔4周时怀孕期间循环NTproCNP水平中至少大约25-33Δ％(变化百分比)的增加预示对象中的妊娠相关血管疾病或不利事件发作。

在一个特定实例中，妊娠相关血管疾病是如上所述的不利事件。

根据本文描述的任何方法，所述方法可以进一步包括将合适治疗方案给予对象的步骤。特别地，应该在发现对象与对照群体中的循环NTproCNP血浆浓度相比具有增加的循环血浆NTproCNP浓度时或者在第一个和第二个时间点间血浆循环NTproCNP浓度增加时将治疗方案给予对象。

对象的合适治疗是本领域技术人员熟悉的。这种治疗方案可以包括给予合适的药物，例如如下所述的抗血管药物。替代治疗方案可以包括卧床休息或者诱导胎儿分娩。

在另一个实施方案中，本发明还提供了监测妊娠对象妊娠相关血管疾病的发生和/或进展的方法，所述方法包括：

(i)测量来自对象的第一个生物学样品中的NTproCNP水平；

(ii)测量第二个生物学样品中的NTproCNP水平，其中所述第二个生物学样品取自与第一个样品相同的对象但是是在后来的时间点取样，以及

(iii)比较所述第一个和第二个样品中的NTproCNP测量水平，其中第一个和第二个样品之间NTproCNP水平的增加预示妊娠相关血管疾病的发生和/或现有妊娠相关血管疾病的进展，并且其中第一个和第二个样品之间NTproCNP水平的降低预示无并发性妊娠和/或妊娠相关血管疾病的恢复/改善。

在一个实例中，所述方法进一步包括，当发现对象在第一个和第二个样品间具有增加的NTproCNP水平时，给予对象合适的治疗方案。在一个实例中，治疗方案包括治疗对象的妊娠糖尿病。在另一个实例中，治疗方案包括治疗对象的先兆子痫。在另一个实例中，治疗方案包括治疗胎儿。在一个实例中，治疗胎儿包括手术。

在本发明任何方法的一个实例中，测量步骤包括检测NTproCNP与选择性结合NTproCNP的结合剂之间的结合。在一个实例中，结合剂是抗体或抗原结合片段。在一个实例中，抗体是单克隆抗体或抗原结合片段。在一个实例中，NTproCNP的结合用固定化在固相上的抗体或抗原结合片段进行测量。

在一个实例中，监测妊娠对象的妊娠相关血管疾病发展的方法可以包括进一步的测量来自对象的生物学样品中CNP水平的步骤。本发明人发现相比于妊娠期间无不利事件的妇女，在具有不利事件的妇女中胎盘CNP和NTproCNP增加。在一个实例中，样品是胎盘组织。在另一个实例中，样品是绒毛膜绒毛样品(CVS)。或者，如果妊娠对象已示出具有高循环NTproCNP，则可以进一步取CVS样品，测量CNP水平，其可以提醒产科医生可能需要进一步测试或治疗或者妊娠期间更频繁监测妊娠对象。

在本发明任一方法的一个实例中，对象是人或非人灵长目动物。在另一个实例中，对象是人。在一个实例中，对象可以正在进行血管疾病或妊娠相关血管疾病的治疗方案。当发现和平均对照水平/参照区间有显著偏差时，临床医生可以相应修改治疗方案。例如，NTproCNP可以作为他汀类药物治疗的血管效果的指数。他汀类药物(HMG-CoA还原酶抑制剂)已被广泛用于临床实践用于降低胆固醇，胆固醇参与动脉粥样硬化的发生。通过监测对象中随时间的NTproCNP水平，NTproCNP循环水平中的任何变化均可以被临床医生使用以调节给予对象治疗疾病的他汀类药物的剂量和/或频率。

在另一个实施方案中，本发明提供了监测成年对象对使用抗血管药物或疗法的治疗的反应性的方法，所述方法包括：

(i)测量来自对象的第一个生物学样品中的NTproCNP水平；

(ii)测量第二个生物学样品中的NTproCNP水平，其中第二个生物学样品取自相同对象；及

(iii)比较所述第一个和第二个样品中的NTproCNP水平，

其中第一个和第二个样品间NTproCNP水平增加指示对抗血管药物或疗法的反应不良，及其中第一个和第二个样品间NTproCNP水平的降低指示对抗血管药物或疗法的反应良好。

本实施方案的对象可以是妊娠或非妊娠对象。

在一个实例中，第一个和第二个样品间循环NTproCNP水平至少大约25-33Δ％(变化百分比)的增加指示对抗血管疗法的反应不良。在另一个实例中，第一个和第二个样品间循环NTproCNP水平至少大约25-33Δ％(变化百分比)的降低指示对抗血管疗法的反应良好。在另一个实例中，第一个和第二个样品取样间隔4周。

在一个实例中，所述方法进一步包括，根据NTproCNP循环水平的相应增加或降低，增加或降低给予对象的抗血管疗法的剂量和/或频率。

在一个实例中，第一个样品在给予任何抗血管药物或其组合之前取样，第二个样品在给予任何抗血管药物或其组合之后取样。在另一个实例中，第一个和第二个样品均是在给予任何抗血管药物或其组合之后取样。第一个和第二个样品的取样及NTproCNP的测量典型地由临床医生决定。取样间的时间也可以由临床医生决定，并且根据被给予对象的抗血管疗法可以是例如若干分钟、小时、天、周、月或年。

在一个实例中，抗血管药物或疗法选自但不限于HMG-CoA还原酶抑制剂、抗高血脂药物、内皮生长因子药物(例如抗VEGF抗体如贝伐珠单抗)、抗微管药物(例如vinblasine、紫杉醇、BTO-956)、超声(如WO 08/042855所述)、融合多肽(如US 7618943所述)、含吲哚化合物(如WO 04/099139所述)、血管成形术、支架、抗凝剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、磷酸二酯酶抑制剂(PDE抑制剂)、β-阻断剂、硝酸盐、血管紧张素II受体阻断剂(ARB)、钙通道阻断剂(CCB)、α-阻断剂、α-β-阻断剂、血管扩张药，或它们的任何组合。

根据对象是否妊娠，给予的抗血管药物或疗法类型取决于临床医生。例如，在妊娠对象中，可以给予疗法以增加血流到子宫。例如，可以给予对象PDEv抑制剂如Viagra或Cialis或CNP激动剂。因此，在另一个实施方案中，本发明还提供了监测成年对象对PDEv抑制剂或CNP激动剂治疗的需求或反应性。

在另一个实施方案中，本发明提供了测量得自具有或处于获得血管疾病包括妊娠相关血管疾病的风险的对象的生物学样品中NTproCNP水平的试剂盒，所述试剂盒包括选择性结合NTproCNP并且可以在结合NTproCNP时被定量测量的结合剂。试剂盒可以用于测量妊娠和非妊娠对象中的NTproCNP水平。在另一个实例中，对象是成年对象。

在一个实例中，得自对象的生物学样品选自血液、血浆、血清、尿、滑液、脑脊液、淋巴、精液、阴道分泌物、羊水或任何其它体液。

在一个实例中，结合剂通过层析、氧化/还原、荧光、发光、质量、分子量、放射性或它们的任意组合而测量。

本发明还提供了选择性结合NTproCNP的NTproCNP结合剂用于预测成年对象获得血管疾病的风险。

本发明还提供了选择性结合NTproCNP的NTproCNP结合剂用于诊断成年对象中的血管疾病。

本发明还提供了选择性结合NTproCNP的NTproCNP结合剂用于监测成年对象对抗血管药物治疗的反应性。

本发明还提供了选择性结合NTproCNP的NTproCNP结合剂用于预测妊娠对象获得妊娠相关血管疾病的风险。

本发明还提供了选择性结合NTproCNP的NTproCNP结合剂用于监测妊娠对象妊娠相关血管疾病的发展。

本发明还提供了NTproCNP结合剂在制备用于预测成年对象获得血管疾病的风险的药物中的用途。

本发明还提供了NTproCNP结合剂在制备用于诊断成年对象中血管疾病的药物中的用途。

本发明还提供了NTproCNP结合剂在制备用于监测成年对象对抗血管药物治疗的反应性的药物中的用途。

本发明还提供了NTproCNP结合剂在制备用于预测妊娠对象获得妊娠相关血管疾病的风险的药物中的用途。

本发明还提供了NTproCNP结合剂在制备用于监测妊娠对象妊娠相关血管疾病的发展的药物中的用途。

附图描述

图1显示了来自基因/cDNA测序研究的公布的预测proCNP氨基酸序列。对比了牛、绵羊、人、小鼠、大鼠和猪proCNP序列。

图2显示在男性(L)和女性(R)中血浆NTproCNP(A和B)及CNP(C和D)随着年龄的变化。粗线：中位值；线5^th和95^th百分位数。

图3显示血浆NTproCNP浓度与男性身高的相关性，r＝-0.27,p<0.001(A)，及女性r＝-0.32,p<0.001(B)。

图4显示在年龄为21-80岁健康志愿者中血浆NTproCNP浓度与肌酸酐之间的相关性，r＝0.56,p<0.001。线条，通过最小二乘法拟合的回归线。

图5显示人类志愿者(H.vol)和冠状动脉病(CAD)群组(cohort)分别通过血管风险因子和涉及的血管数目分层。每个条的数据点数目展示在每个条中。数据显示为平均值±SEM。

图6显示在正常和并发性妊娠中的系列母体血浆NTproCNP(A)和CNP(B)浓度。数值是平均值(±SEM)。在每个图的最左边还示出在健康的年龄匹配的非妊娠女性中的数值(实心方块)。

图7示出在正常(n＝17)和并发性妊娠(n＝21)中在20周和36周的NTproCNP的母体血浆浓度。数据显示为平均值±SEM。

图8示出在具有胎盘病理学的患者中血浆NTproCNP浓度的升高。实心符号表示出与正常妊娠(实心圆，平均值±SEM n＝11)中的系列变化相比病理学事件的时间。

图9显示在怀孕24周的NTproCNP测量对于预测妊娠并发症的灵敏性和特异性。

详细描述

一般性描述

术语“和/或”例如“X和/或Y”应理解为是指“X和Y”或者“X或Y”，及应认为对这两种含义或任一种含义提供了明确支持。

在本说明书中，单词“包含”应理解为包含指定的元件、整数或步骤，或者元件组、整数组或步骤组，但是不排除任何其它元件、整数或步骤，或者元件组、整数组或步骤组。

在本说明书中，除非特别指出或上下文要求，提及单一步骤、组合物、步骤组或组合物组时，应理解为涵盖一个及多个(即一或多个)这些步骤、组合物、步骤组或组合物组。

本领域技术人员将意识到本文描述的本发明除了特别描述的之外可以进行改变和修改。应理解本发明包括所有这种改变和修改。本发明还包括在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，单独或全体，以及任何及所有组合或者任两或多个所述步骤或特征的组合。

本发明不限于本文描述的特定实施方案的范围，所述实施方案只是举例说明本发明。功能等价产物、组合物和方法明确包含在本发明范围内。

除非特别指出，本文的任何实施方案应准用于任何其它实施方案。

除非特别定义，本文所用所有技术和科学术语均具有本领域(例如在免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学及生物化学领域)技术人员通常理解的相同含义。

除非特别指出，本发明中利用的技术是为本领域技术人员熟知的标准方法。这种技术在文献中描述和阐述，如在J.Sambrook ef al.MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、T.A.Brown(editor),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,Volumes 1and 2,IRL Press(1991)、D.M.Glover and B.D.Hames(editors),DNA Cloning:A Practical Approach,Volumes 1-4,IRL Press(1995和1996)、及F.M.Ausubel ef al.,(editors),Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-lnterscience(1988，包括直至目前的更新)，EdHarlow and David Lane(editors)Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,(1988)以及J.E.Coligan ef al.,(editors)Current Protocols inImmunology,John Wiley&Sons(包括直至目前的所有更新)中描述。

选择的定义

如本文所用，术语“成人”对象由骨龄定义，即是指其线性生长已经停止的对象。在一个实例中，成人对象是生物学年龄≥20岁。

如本文所用，术语“生物学样品”包括生物学液体，选自血浆、血液、血清、尿液、滑液、脑脊液、淋巴、精液、羊水、阴道分泌物、或者任何其它体液。

如本文所用，术语“水平”是指NT-CNP的量/重量或者重量/重量。也意指涵盖表示为量/体积或者重量/体积的“浓度”。术语“循环水平”是指循环液体中存在的NT-CNP的量/重量或者重量/重量或者浓度。典型地，NTproCNP的浓度以pmol/L表示。

如本文所用，术语“CNP”是指C-型利尿钠肽，及指衍生自激素原(proCNP(1-103)的生物学活性肽，所述激素原是CNP基因NPPC的产物。已知的生物学活性肽包括CNP-53(proCNP(51-103)和CNP-22(proCNP(82-103))。在一个实例中，所述CNP是人CNP。

如本文所用，术语“NTproCNP”是指氨基末端前C-型利尿钠肽。其涵盖任何可区分地可检测的连续氨基酸序列，选自proCNP(1-81)中存在的氨基酸序列。该术语与可以与NTproCNP互换使用。在一个实例中，NTproCNP是人NTproCNP。

如本文所用，“参照区间”是指代表性浓度的统计带内的数字或者较高或较低浓度数字。参照区间典型得自不具有可导致循环NT-CNP水平人为升高的任何预先存在病症的对象。这些病症在本文别处论述。术语参照区间也可以是指来自对照对象样品的平均NTproCNP浓度。

如本文所用，术语“对象”是指人或非人灵长目动物。在一个实例中，所述对象是人。在另一个实例中，所述对象是妊娠人对象。

如本文所用，术语“妊娠”是指在女性子宫内受精及后代发育(胚胎或胎儿)的妊娠状态。

术语“怀孕”是指胚胎或胎儿在子宫内从受孕至出生的发育期。在人体，孕期为大约266天(大约38-40周)。

如本文所用，术语“结合剂”是指结合NTproCNP肽的任何分子，包括小分子、任何物种的抗体(无论是多克隆或是单克隆抗体)、抗原结合片段如Fab和Fab2、人源化抗体、嵌合抗体，或者以其它方式修饰的抗体，包括氨基酸取代和/或与其它肽或蛋白质(例如PEG)融合。也包括来自任何物种的受体或结合蛋白或者它们的修饰的形式。在一个实例中，结合剂特异性结合NTproCNP。

如本文所用，术语“特异性结合”是指与结合剂与另外的物质反应或结合相比，结合剂更频繁、更快速地以更长持续时间和/或更强的亲和性与特定物质反应或结合。例如，特异性结合NTproCNP的结合剂与其结合不相关的蛋白质和/或其表位或免疫原性片段相比，以更高的亲和性、亲合力、更容易地和/或以更长的时间结合所述蛋白质或其表位或免疫原性片段。通过阅读这个定义也理解，例如特异性结合第一个靶(例如NTproCNP)的结合剂可以或不可以特异性结合第二个靶。如此，“特异性结合”不一定要求除外与另一分子的结合或者不可检测地结合。通常但非必需地，提及结合意味着特异性结合。

根据本发明，术语“血管疾病”是指循环系统的脉管或关于其的病理学。举例的病症包括冠状动脉病(CAD)；急性冠脉综合征(ACS)，包括不稳定型心绞痛和非ST抬高的心肌梗塞；急性冠脉缺血性综合征；首次或再发血栓性卒中；瞬时缺血性发作(TIA)；外周动脉疾病(PAD)；深静脉血栓形成(DVT)；动脉硬化；粥样斑，心房颤动；导管血栓性闭塞；血栓性闭塞和再闭塞；及任何血管的动脉血栓形成，包括一或多种这些病症。

如本文所用，术语“粥样斑”是指动脉壁的堆积和膨胀，通常是由巨噬细胞和/或细胞碎片组成，及含有脂质(例如胆固醇)、钙和纤维性结缔组织。粥样斑发生在动脉粥样硬化中，其是动脉硬化三种亚型之一，这三种亚型是动脉粥样硬化、Monckeberg动脉硬化和小动脉硬化。

如本文所用，术语“动脉粥样硬化”是指影响动脉血管的慢性血管炎症性疾病。其大部分是由于脂蛋白斑(包括血浆蛋白、胆固醇、甘油三酯、钙和瘢痕组织)沉积在动脉管壁上所致反应。

如本文所用，术语“动脉硬化”是描述中动脉或大动脉的任何硬化(及丧失弹性)的一般术语。该术语在过去称作“myoconditis”。

如本文所用，术语“冠状动脉病”是指一或多条冠状动脉的动脉粥样硬化。

术语“心脏病发作(心肌梗塞，AMI，MI)”是指其中一部分心脏的血液供应被中断的医学状况，通常大多是由于冠状动脉内的易损斑块破裂所致。心脏病发作也可以在冠状动脉暂时收缩或者严重痉挛时发生，有效地闭塞血液流向心脏。在任一情况中，所致的缺血或缺氧导致心脏组织损伤及潜在死亡。

如本文所用，“血栓性或血栓栓塞性事件”是指包括如下事件：心房颤动、急性冠脉综合征包括不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞、缺血性卒中、急性冠脉缺血性综合征、血栓形成、血栓栓塞、外周动脉疾病、深静脉血栓形成、任何血管的动脉血栓形成、导管血栓性闭塞、血栓性闭塞及再闭塞、短暂缺血发作、首次或再发缺血性卒中。

术语“TIA或短暂缺血发作”也称作“微卒中”，是指暂时中断血液流向脑。症状(警示迹象)与缺血性卒中相似，除外的是其在几分钟或几小时内消失。然而，TIA是严重卒中危险的重要指征，对象通常具有甚至未知的TIA。

术语“抗体”是指通过包含于至少一个可变区内的抗原结合位点能特异性结合靶如NT-CNP的免疫球蛋白分子。该术语包括四链抗体(例如两个轻链和两个重链)，重组或修饰的抗体(例如嵌合抗体、人源化抗体、灵长目动物源化(primatized)抗体、去免疫抗体、半抗体、双特异性抗体)及单一结构域抗体如结构域抗体和仅重链抗体(例如骆驼抗体或软骨鱼免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR))。抗体通常包含恒定结构域，其可以排列在恒定区或恒定区片段或可结晶片段(Fc)中。优选的抗体形式包含四链结构作为其基本单位。全长抗体包含共价连接的两个重链(～50-70kDa)及两个轻链(每个～23kDa)。轻链通常包含可变区和恒定结构域，在哺乳动物中是κ轻链或者λ轻链。重链通常包含可变区和一或两个恒定结构域，通过铰链区与另外的恒定结构域连接。哺乳动物的重链是如下类型之一：α、δ、ε、γ或μ。每个轻链与重链之一也共价连接。例如，两个重链和两个轻链通过链间二硫键及通过非共价相互作用连接在一起。链间二硫键的数目在不同类型抗体中可以变化。每个链具有一个N-末端可变区(V_H或V_L，其中每个长度为～110个氨基酸)及在C-末端的一或多个恒定结构域。将轻链的恒定结构域(C_L，其长度为～110个氨基酸)和重链的第一个恒定结构域(C_H，其长度为～330-440个氨基酸)排列并与之二硫键合。将轻链可变区与重链可变区排列。抗体重链可包含2或更多个另外的C_H结构域(如C_H2、C_H3等)及可包含一个铰链区，可以在C_H1与Cm恒定结构域之间鉴别。抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG_1、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂)或亚类。在一个实例中，抗体是鼠(小鼠或大鼠)抗体或灵长目动物(优选人)抗体。术语“抗体”不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，也包含变体、包含具有抗原结合位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、灵长目动物源化抗体、去免疫化抗体或者镶嵌(veneered)抗体。

术语“抗原结合片段”应是指保留结合NT-CNP、优选特异性结合NT-CNP的能力的任何抗体片段。该术语包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、单链抗体(SCA或SCAB)等。“Fab片段”由抗体分子的单价抗原结合片段组成，可以通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体分子产生由完整轻链和一部分重链组成的片段而产生。抗体分子的“Fab'片段”可以通过用胃蛋白酶处理完整抗体分子及随后还原反应产生由完整轻链和一部分重链组成的分子而获得。以此方式处理的每个抗体分子获得两个Fab'片段。抗体的“F(ab')2片段”由通过二硫键连接在一起的两个Fab'片段的二聚体组成，通过用胃蛋白酶处理完整抗体分子而不用随后的还原作用而获得。(Fab')₂片段。“Fv片段”是遗传工程化的片段，含有轻链可变区及重链可变区，表达为两个链。“单链抗体(SCA)”是遗传工程化的单链分子，含有轻链可变区和重链可变区，通过合适的柔性多肽接头连接。

C-型利尿钠肽前体

利尿钠肽前体C(preproCNP)，由基因NPPC编码的蛋白质，将其裂解为22个氨基酸的C-型利尿钠肽(CNP)，以及proCNP和NTproCNP。利尿钠肽包含3个结构相关分子的家族：心房利尿钠肽(ANP)、脑利尿钠肽(BNP)和C-型利尿钠肽(CNP)。

CNP已经示出在调节线性生长中起重要作用(见例如本发明人的US7,919,255)。将其在生长平板中产生并在多种组织中表达，包括血管内皮、心脏组织、循环血液元件、胃和生殖组织。遗憾地，在健康对象中，一旦线性生长已经停止，实际上没有可检测的CNP存在于循环中，因为其被细胞有效隔离和/或代谢。因此，如果有可能的话，CNP的检测接近于最常用的分析方法的检测限度。

CNP作为前体蛋白合成，其在从细胞中释放之前经历蛋白酶解加工。CNP的氨基末端前肽(NTproCNP)是proCNP的裂解产物，与CNP等摩尔量产生。NTproCNP由本发明人发现并鉴定(Prickett TCR et al(2001)Biochemical and Biophysical Research Communications vol 286(3):513-517)。血液中NTproCNP的水平可能反映出CNP生物合成的速度。

NTproCNP的血浆浓度受肾清除和/或代谢影响。在成人中当肾功能降低至正常30％以下时，观测到其浓度增加。中等或严重肾衰竭对象中NT-CNP水平的解释可因此提供了是人工增加的结果。因此，临床医生应意识到确定对象是否具有任何预先存在的肾衰竭。在这种对象中，对于临床医生适合的是应用可以确定的校正因子，例如通过测量血清肌酸酐(常用的肾功能指标)确定。因此，临床医生基于NTproCNP与肌酸酐的比率可确定校正因子。由于已知正常成人对象中NTproCNP与肌酸酐的浓度之间的关系，可以基于年龄和性别确定这个比率(NT CNP/肌酸酐)的参照范围并用此确定对象中的血管危险。

NTproCNP的血浆浓度也受肝硬化及慢性肝病的影响。对患有慢性肝病的193个患者的研究发现升高的NTproCNP水平表示不利的预后(Koch Aet al(2012)Clin Biochem 45(6):429-35)。因此，其将适合于临床医生确定对象是否患有任何已存在的慢性肝病。

NTproCNP的血浆浓度也受代谢性骨病的影响，特别是其中代谢性骨病表现为增加的骨转换。在具有预先存在的代谢性骨病的对象中，NTproCNP水平可以人为增加。

NTproCNP的血浆浓度也受严重心脏疾病(缺血性心脏疾病或充血性心力衰竭)的影响。在已有心脏疾病的这种对象中，NTproCNP水平可以人为增加。

理想地，在评定对象之前，临床医生需要采集对象的全面病史，可包括检查一或多种上述疾病(肾功能、肝功能、心脏功能、骨状况)。在发现对象患有一或多种上述疾病的情况中，所述疾病在实施本发明的任何方法之前应理想地被处理。例如，许多肾脏疾病可以治疗以获得正常肾功能。也期望对象中NTproCNP浓度在肾功能正常化时期内正常化，以便期望本发明的方法比在肾脏疾病正常化之前提供更精确的结果。或者，临床医生可以应用如上述的校正因子。

NTproCNP的结合剂

通过检测NTproCNP与选择性结合NTproCNP的结合剂之间的结合测量体液样品中的NTproCNP。用于本发明方法中的结合剂优选与例如ANP和BNP具有低交叉反应性。结合剂可包括抗体或抗原结合片段如Fab和F(ab)2，使用抗原性NTproCNP肽或其片段作为免疫抗原而制备。多肽或片段也可以与所述载体偶联。在一个实例中，结合剂是抗体。抗体可以是单克隆或多克隆抗体。产生多克隆和单克隆抗体及其片段的方法为本领域熟知(例如见Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York 1988)。由于特异性原因，目前优选单克隆抗体。意识到人源化抗体在体外测定中不是必需的。

NT-CNP的商业化抗体和/或测定NT-CNP的试剂盒也可以用于本发明的方法中。这种商业化抗体的合适的实例包括以试剂盒形式提供的多克隆绵羊抗NT-CNP(Biomedica Gruppe)、来自antibodies online的前C-型利尿钠肽(ProCNP)EIISA试剂盒(目录号ABIN418357)及来自Gentaur MolecularProducts的抗体及试剂盒，以及得自epitomics或invitrogen的抗体。本领域技术人员熟知商业可获得的抗体的采购与获得。

在一个实例中，抗体是针对抗原性NTproCNP肽产生的。在一个实例中，抗原性NTproCNP肽包含合适大小的proCNP(1-81)的部分连续序列以使得针对所述肽可以产生抗体及其它免疫分子。在另一个实例中，抗原性NTproCNP肽包含来自proCNP(1-81)的至少六个连续氨基酸。这通常提供了特异性氨基酸检测的足够表位。然而，在一些情况中，必需具有至少8个氨基酸以为肽检测方法提供足够的特异性。

在另一个实例中，应用来自proCNP(1-81)的至少15个连续氨基酸。对于产生抗体的最佳能力，可应用proCNP(1-81)自身。可用于产生抗体的其它肽例如包括proCNP(1-50)、proCNP(1-81)和proCNP(51-81)。在一些情况中也可以使用proCNP(1-103)，因为产生的抗体可以与proCNP(1-81)和proCNP(1-50)肽交叉反应。可用于本发明中的肽在本文统称为NTproCNP。本发明还包括NTproCNP肽的功能等价变体的应用。

人proCNP(1-103)及其它已知哺乳动物proCNP序列的全长氨基酸序列在图1中示出。

在另一个实例中，抗原性NTproCNP肽包含NT-CNP(1-50)，本发明人已经证实其是在人体中循环的主要NT-CNP肽或其功能片段或代谢物。proCNP(1-81)和proCNP(51-81)及其代谢物也是可用的。很可能循环NTproCNP水平或浓度反映出机体组织和体液中CNP水平。

在另一个实例中，抗原性肽包含proCNP(3-15)。在另一个实例中，抗原性肽包含proCNP(15-32)、proCNP(26-42)或proCNP(38-50)。

单克隆抗体可以通过已知方法产生。这些方法包括Kohler et al(1975)Nature 256(5517):495-7所述免疫学方法以及Huse et al(1989)246(4935):1275-81所述重组DNA方法。也涵盖使用重组噬菌体抗体系统产生单链可变抗体片段及随后突变(如位点特异性诱变)或链移位以产生NTproCNP肽的抗体。

产生多克隆抗体的常规方法在Harlow and Lane(如前)中详细描述。简言之，该方案需要用分离的NTproCNP肽在一些间隔时间免疫选择的动物宿主如兔、山羊、猴、绵羊、大鼠或小鼠(通常为兔)，在放血和收集血液之前进行一或多次检测验血。通过离心从凝固血液分离血清。可以使用ELISA或放射免疫测定竞争测定或等价方法检测血清中多克隆抗体的存在。

特异于proCNP(1-15)、proCNP(36-50)和proCNP(67-81)的抗体可以在第一次将这些或相似的肽与大蛋白质如牛血清白蛋白或牛甲状腺球蛋白缀合之后以使其成为免疫原性而产生。偶联可以通过使用任何蛋白质交联剂实现，包括例如常用的戊二醛、碳二亚胺或N-(e-马来酰亚胺-己酰氧)琥珀酰亚胺酯(MCS)-提供半胱氨酸残基加入肽序列中，之后偶联。以每月一次的间隔将这些缀合物注射进兔、绵羊、小鼠或其它物种中，2周后收集血液样品，这样使得能够产生来自小鼠脾的多克隆抗体或单克隆抗体。

例如，可以处死上述小鼠宿主并取出其脾。然后分离信使RNA(mRNA)及从mRNA产生cDNA，使用抗体可变区的重链和轻链的特异性引物及聚合酶链反应(PCR)扩增进行。重链和轻链的DNA序列通过接头序列结合，以保证正确的读框。然后将DNA构建体插入载体中，例如质粒或噬菌体或病毒中，以转化进宿主中。在一个实例中，载体是噬菌体。

合适的宿主可以选自原核生物、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。在一个实例中，使用原核宿主，优选大肠杆菌。噬菌体产生病毒衣壳，抗体片段在所述衣壳上表达，噬菌体展示文库。可以筛选噬菌体展示文库中对特定抗原具有适当亲和性的抗体片段。可以多次筛选文库，通过蛋白质工程技术对抗体构建体可进行修饰，如定向诱变技术和链改组技术，所有这些均在本领域技术人员能力范围内。

结合剂的检测

本发明包括检测系统的使用，包括NTproCNP与结合剂的结合及检测结合的物质的量。一个相似的方案是检测样品中未结合的结合剂的量，以获得未结合的或结合的NTproCNP的指示。这种可选方法列入本发明范围内作为直接检测结合的结合剂的量的功能性可选择方案。本领域技术人员将意识到当样品体积已知时，样品中NTproCNP的浓度可易于从样品中NTproCNP的量计算。

可用于本发明中的抗体特别可用于免疫测定中以确定样品中NTproCNP的存在和/或量。由于不同抗体的可变的结合亲和性，本领域技术人员将意识到测量值相比样品中NTproCNP的量的标准结合曲线应针对特定抗体确立以使得可以确定样品中NTproCNP的量。这种曲线用于确定样品中NTproCNP的真实量。换言之，需要对使用的每个结合剂确定参照区间。

样品材料包括但不限于细胞、细胞膜和生物学液体。在本发明中，通常生物学液体选自全血、血浆、血清或尿。在一个实例中，样品在体外检测。

特异于NTproCNP肽的免疫测定需要产生特异性结合NTproCNP肽的抗体。在一个实例中，抗体识别proCNP(1-15)内的氨基酸。在另一个实例中，抗体识别proCNP(3-15)内的氨基酸。这些抗体虽然特异于NTproCNP肽，但是具有广泛的NTproCNP特异性。可用于本发明的抗体结合四种肽proCNP(1-50)、proCNP(1-81)、proCNP(51-81)和proCNP(1-103)或其代谢物中的一或多种。抗体可用于构建具有广泛特异性的免疫测定，如在下文的竞争性结合测定中或者用于在夹心测定中与下文所述其它抗体联合使用以产生特异于三种肽的每一种或其它NTproCNP肽的测定。本领域技术人员将意识到非竞争性测定也是可能的。后者夹心测定的抗体包括特异于proCNP(1-15)、proCNP(36-50)、proCNP(67-81)、proCNP(15-32)、proCNP(26-42)或proCNP(10-21)内的氨基酸序列的那些抗体。

本发明的方法可以使用本发明提供的试剂盒进行。本发明提供了测量生物学样品中NTproCNP水平的试剂盒。所述试剂盒包含选择性结合NTproCNP的结合剂，其可以基于与NTproCNP的结合而定量测量。结合剂如上文描述。

在另一个实例中，也可以使用指示剂。指示剂可用于ELISA和RIA方法中。

多克隆和单克隆抗体可用于竞争性结合或夹心测定中。在这个方法的一个实例中，将液体样品与抗体接触，及同时或相继与标记的NTproCNP肽或者含有由所述抗体识别的表位的修饰的肽接触。

标记可以是放射性成分如¹²⁵I、¹³¹I、³H、¹⁴C，或者非放射性成分，其可以通过时间分辨荧光、荧光、荧光偏振、发光、化学发光或者生色方法测量。这些化合物包括铕或其它锕系元素、吖啶酯、荧光素或者放射性材料如上述那些，其可以通过放射性计数、测量发光或荧光输出、吸光度等直接测量。所述标记也可以是可间接测量的任何成分，如生物素、地高辛或者酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。这些标记可以许多方式间接测量。例如可以将辣根过氧化物酶与底物如邻苯二胺二盐酸化物(OPD)和过氧化物保温以产生可以测量其吸光度的有色产物，或者与鲁米诺和过氧化物保温以产生可以在光度计中测量的化学发光。生物素或地高辛可以与与其强力结合的结合剂反应，例如抗生素蛋白强力结合生物素。这些结合剂转而可共价结合或连接可测量标记如辣根过氧化物酶或者如上述其它直接或间接测量的标记。这些标记及上述那些可以与肽或蛋白质附着，在合成期间通过与标记直接反应或者通过使用常用的交联剂如MCS和碳二亚胺，或者通过加入螯合剂。

在与抗体接触后，通常在4℃接触18-25小时，或者在30℃-40℃接触1-240分钟，与结合剂(抗体)结合的标记的肽与未结合的标记的肽分离。在溶液相测定中，分离可以通过加入与固相颗粒如纤维素或磁性材料偶联的抗γ球蛋白抗体(二抗)而完成。二抗是在与用于一抗不同的物种中产生的并结合一抗。所有一抗因此均通过二抗结合所述固相。这个复合物通过离心或磁性吸引从溶液中取出，使用与其结合的标记测量结合的标记的肽。从游离标记中分离结合的其它选项包括免疫复合物形成，其从溶液中沉淀，通过聚乙二醇或者使游离标记的肽与炭结合而沉淀抗体，以及通过离心滤物从溶液中取出。分离的结合或游离相中的标记通过合适方法如上述那些方法测量。

竞争性结合测定也可以设定为固相测定，其易于进行及因此比上述那些方法优选。这种类型的测定使用具有孔的平板(通常为ELISA或免疫测定平板)、固体珠或管的表面。一抗吸附于或共价结合于平板、珠或管的表面，或者通过吸附或共价结合于平板的二抗γ球蛋白或抗Fc区抗体间接结合。将样品和标记的肽(如上述)一起或相继加入平板，在使得样品中NTproCNP与标记的肽之间抗体结合竞争的条件下保温。未结合的标记的肽随后可被吸出，漂洗平板剩下与平板附着的抗体结合的标记的肽。然后标记的肽可以使用上述技术测量。

就特异性、速度和更大的测量范围而言，更优选夹心测定。在这种类型的测定中，使过量的NTproCNP的一抗通过吸附、共价结合附着于ELISA平板的孔、珠或管，或者如上述通过抗Fc或γ球蛋白抗体以进行固相竞争结合测定。将样品液体或提取物与附着于固相的抗体接触。由于抗体是过量的，因此这个结合反应通常是快速的。将NTproCNP的二抗与一抗同时或相继也与样品保温。选择这个二抗以与NTproCNP上与一抗的结合位点不同的位点结合。这两个抗体反应产生来自样品的NTproCNP夹在所述两个抗体之间的夹心。二抗通常用如上述易于测量的化合物标记以进行竞争性结合测定。或者，与二抗特异性结合的标记的三抗可以与样品接触。在洗去未结合的材料之后，结合的标记的抗体可以通过针对竞争性结合测定所述方法测量。在洗去未结合的标记的抗体之后，结合的标记可以根据针对竞争性结合测定所述量化。

也可以使用浸渍(dipstick)测定。这些测定为本领域熟知。其例如是可应用附着特异性抗体的小颗粒如金或有色乳胶颗粒。可以将待测量的液体样品加入预加载所述颗粒的膜或试纸条的一端，并使其沿着条带移动。样品中的抗原与颗粒的结合修饰了所述颗粒结合捕获位点的能力，其沿着条带含有所述颗粒的结合剂如抗原或抗体。导致颜色发生的有色颗粒在这些位点的积聚依赖于样品中竞争抗原的浓度。其它浸渍方法可应用与纸或膜条带共价结合的抗体以捕获样品中的抗原。随后的反应应用与酶如辣根过氧化物酶偶联的二抗及与底物保温以产生有色的、荧光或化学发光输出，使得可以量化样品中的抗原。

在一个实例中，使用对proCNP(1-15)具有特异性的抗体。在另一个实例中，使用对proCNP(3-15)具有特异性的抗体。

血管疾病中NTproCNP的应用

NTproCNP及本文描述的结合剂在预后或诊断血管疾病的测定中的应用对于早期检测例如冠心病或妊娠相关血管疾病及不利事件的发生具有重要意义。所述方法为临床医生提供了对可能潜在处于血管疾病危险中或者现有血管疾病恶化的对象进行分级的能力。此外，本发明的方法为临床医生提供了一种监测对象对其现有治疗的反应性的手段。例如，通过测量对象中随着时间的NTproCNP水平，临床医生可以监测对象对于他汀类药物治疗或者溶血栓药治疗的反应。此外，关于妊娠对象，本发明的方法提供了确定对象在妊娠期间处于获得血管相关疾病的危险及因此需要产科医师更频繁监测的手段。

本领域技术人员将意识到对于上述实施方案在不偏离本发明一般范围的前提下可以进行多种改变和/或修改。本发明的实施方案因此在所有方面被认为是举例说明的而非无限制性的。

方法与对象标准

健康志愿者对象

参与者是健康成人(n＝242)，年龄21-80岁，从新西兰的Canterbury的选举名册中募集。针对定义这些分析物的实验性正常范围之目的研究的在16个健康成人中CNP形式测量结果也加入数据集中(共258)。

排除具有肾病、缺血性心脏病(IHD)和/或充血性心力衰竭(CHF)病史的对象。长期药物摄取包括非类固醇抗炎剂、止痛剂、降压药、降脂药、抗抑郁药和质子泵抑制剂。在研究的258个对象中，110个对象无药物摄取。研究由新西兰Upper South B Regional Ethics Committee许可，所有参与者在登记之前均给予知情同意。

在取血样时，记录自己报告的医学和家族史及当前药物治疗的详细资料。对象的血管危险分值通过本文限定的危险因子总数计算：吸烟史、高血压或脂质失调。测量身高和体重。然后将静脉血样品抽取进入EDTA采集管(Becton-Dickinson,Plymouth,UK)中，在采集的10分钟内置于冰水中并离心(2800g离心10分钟)。然后将抽吸的血浆贮存在-80℃直至测量CNP和NTproCNP及肌酸酐。

冠状动脉疾病对象

使用如下包含标准募集由Ghristchurch医院或Auckland City医院许可的患者：缺血性胸部不适加上一或多个如下症状：1)ECG改变(在至少3个导联上出现ST段压低或抬高至少0.5mm，T-波倒置至少3mm，或者左束支传导阻滞)，2)心脏标记水平升高，3)冠状病史，或者4)年龄至少65岁的糖尿病或血管疾病患者。如果患者具有严重的共病率限制其生命预期低于3年，则排除这样的患者。在计划跟踪临床访问时记录人体测量和临床特性以及临床事件，调查表、患者注意事项及National Health InformationServices及医院患者管理系统数据库。患者随访平均2.8年(0.1-6.9年)。研究符合Declaration of Helsinki and Title 45,U.S.Code of Federal Regulations,Part 46论述的原理并且由New Zealand Multi-region Ethics Committee许可。每个参与患者提供书面知情同意书。

募集的对象的总数为2144人。其中在1643个对象中在陈述时进行冠状动脉血管造影术。在105个对象中见到冠状动脉是正常的。在剩余的对象中，异常(增厚和不规则，由于斑块所致狭窄)经鉴别为典型的动脉粥样硬化血管退行性改变。涉及的动脉数分为四级之一(0，无异常；1、2、3级血管异常)，以及评分用作冠状动脉动脉硬化的指数。

在获取指数后及在首次门诊随访时(血管造影术后5-56天)，抽取静脉血样置于EDTA采集管中(Becton-Dickinson,Plymouth,UK)，在采集10分钟内置于冰水中并离心(2800g，10分钟)。将抽吸的血浆贮存于-80℃直至测量CNP和NTproCNP。测量身高和体重。

妊娠对象

年龄在20-40岁的健康非妊娠女性及用于妊娠数值参考的数值在表1中示出。

表1：年龄匹配的非妊娠健康志愿者中的血浆NTproCNP(pmol/L)。

对象年龄(岁)NTproCNP(pmol/L)CNP(pmol/L)

n121.524.20.64n221.816.00.37n323.121.30.51n424.019.4n524.413.80.6n625.314.30.75n726.514.50.85n827.011.60.94n929.112.20.74n1029.414.60.5n1131.510.60.34n1231.714.20.43n1332.017.41n1432.717.70.44n1533.015.21.17n1633.210.70.46n1735.816.20.56n1836.314.00.79n1936.619.50.65n2037.112.70.54n2137.325.40.64n2238.016.40.8n2338.113.20.64n2439.817.10.57n2540.79.60.59平均值31.415.70.65SD5.94.00.20

检验52个妊娠女性，其中母体血浆中CNP肽的系列测量在整个孕期进行并与产科结果相关。

设计研究以确定母体血浆中CNP(CNP和NTproCNP)肽浓度是否随着对(i)妊娠需要增加的环境中的血管不足和/或(ii)胎儿的受限制生长的适应性反应而增加。进一步地，设计研究以确定CNP肽增加与妊娠期间的不利产科事件之间是否存在相关性。

在2011-2013年在Christchurch进行所述研究。所有女性均接受由Department of Obstetrics，Christchurch Women's Hospital(CWH)工作人员监管的产科照护。CNP肽的所有测量均由Endolab Staff,CCERG，University ofOtago，Christchurch担任。所有研究均由New Zealand Upper South BRegional Ethics Committee许可。募集来自在Lead Maternity Carer初次就诊的健康妊娠女性，在获得知情同意后登记在册。

除外的包括如下：主要的结构或染色体胎儿异常或者可能与生长模式改变相关的任何母体状况如高血压、肾或自身免疫病或者预先存在的糖尿病。登记52个对象并在整个孕期进行研究，52个对象中有50个对象分娩健康婴儿。

在登记时，获得完整的体格检查和产科病史，以及关于药物治疗和吸烟史的详细资料。在登记时记录血压、身高、父亲身高、妊娠前母亲体重及母亲体重指数(BMI)的测量，基于产科病史、目前健康状况和常规血液检查(包括PAPPA和HCG)确定危险状态(不利事件的低或高危险)。这个回顾与随后的照护根据在CWH的产前保健的“最佳实践”机构的指导。

在登记时(12-25周)获取静脉血样检测血浆CNP形式、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)和CRH(促肾上腺皮质激素释放激素)及随后在怀孕20周开始间隔4周取血样。

标准生长参数的超声测量包括在登记时的12-13周及随后怀孕24、28、32和36周时的双顶径、头围和腹围、顶臀长和股骨长度。在24周，对所有对象进行子宫动脉多普勒扫描以帮助预测随后胎儿生长限制的危险。如下文所述更密切地监测具有异常扫描结果的那些对象。

除了作为这些指导一部分的常规扫描及常规血液检查之外，这项研究需要如下另外的程序(如果先前未实施)：在怀孕20、24、28、32和36周时的超声扫描；在怀孕24-36周间间隔4周的脐动脉多普勒扫描；在24周的子宫动脉多普勒扫描；及在登记时取血样检测母体血浆CNP和氨基末端前CNP(NTproCNP)(其中在大约16周)及在大多数对象中之后间隔4周进行。

抽取最终的血样检测母体血浆CNP形式、脐带血浆CNP形式、IGF-1胰岛素及产后立即的脂连素。在选择的情况中，对胎盘进行临床适合的肉眼和组织学检验，并切成扇形，如(Wyatt S et al(2005)26(5):372-9)所述并深度冷冻以进行随后的CNP肽测量。

高危妊娠对象

以两种方式募集高危妊娠对象。首先，一些(大多数)对象在第一次就诊时鉴别，使用充分定义的标准和常规体检发现。其次，在妊娠后期存在并发症的对象中募集。对于这项研究，通过一或多项如下迹象证实胎儿累及：1)异常胎儿生长的超声迹象，2)异常胎儿或子宫多普勒血流，及3)在不存在膜破裂时羊水过少。数据收集是如上述在登记时及之后进行。具有受损的子宫血流的对象(提供的抗性指数>95^th百分位数或者notched waveform)随后更密切监测，及在34周及根据临床需要进行另外的超声检查。随后如上述进行产后程序。

登记后的28个对象均具有一或多个不利事件，进行完研究方案。对于这项研究，不利事件定义为通过超声扫描检测的、要求进一步研究的异常，和/或急需专家会诊和住院的产科相关并发症。用于定义不利事件的终点在下表2中描述。

表2：用于定义不利产科事件的终点

不利产科事件分类

在CNP测量的可利用性之前通过研究组拟定组成不利事件的终点，并列于上表2。基于如下选择终点：(i)在产科实践中常见的胎儿母体福利威胁，及(ii)在孕期监测程序期间检测威胁的能力。在所述事件中，28个对象遇到这些预定的终点之一(C组，妊娠并发)。这些不利事件的详细描述、受所述事件影响的女性数目及首次呈现的事件的时间在表3中列出。剩余的(N组，正常妊娠)包含24个对象，其孕期无特别事件。特别地，这些对象无一经历表2中列出的任何终点。

表3:28个对象*中不利产科事件概要

事件孕龄**SGA(n＝8)24；24；25；32；32；36；41(T)；41(T)高BP(n＝10)12；12；14；24；24；30；36；36；37；38GDM(n＝4)28；28；28；24LGA(n＝3)36；39(T)；38先兆早产(n＝3)33；35；35早产(n＝2)33；36羊水过多(n＝3)29；37；39羊水过少(n＝3)32；37；38胎盘早剥(n＝2)22；23胎盘损伤(n＝1)23先兆子痫(n＝1)38HELLP综合征(n＝1)38畸形胎儿(n＝1)20(T)宫内胎儿死亡(n＝1)34

*一些对象具有一个以上的不利事件。括号内的数字是对象数。

^**当不利事件存在时的年龄(周)。

(T)表示分娩。

血浆测定

血浆肌酸酐通过Architect c8000分析仪(Abbott Laboratories,USA)确定并用于计算肾小球滤过率(eGFR)Levey AS et al(1999)1306):461-70)。血浆NTproCNP通过先前描述的放射性免疫测定测量(Prickett TCR et al(2001)Biochemical&Biophysical Research Communications 286(3):513-517；Prickett TCR et al(2005)Pediatric Research 200558(2):334-340)，使用如下改变：将100μl标准物或样品提取物与针对合成的人proCNP1-15产生的50μl初级兔抗血清(J39)预保温(稀释为1:6,000)并在4℃保温22-24小时。proCNP上的抗血清J39表位跨越氨基酸残基3-15。然后加入50μl放射性标记的追踪剂(1,500cpm)，在4℃进一步保温24小时。这个测定的检测限度是1.2pmol/L(在样品浓缩后是0.3pmol/L)。在14pmol/L，测定内和测定之间的变异系数分别是6.8％和8.4％。在这个测定中，与ANP前肽的交叉反应性<0.07％，与人BNP前肽的交叉反应性<0.4％。CNP也通过先前描述的放射性免疫测定测量(Yandie TG et al(1993)Peptides 14(4):713-716)，使用由Phoenix Pharmaceuticals,Belmont CA提供的商业CNP-22抗血清。在9pmol/L，测定内和测定之间的变异系数分别为3.8％和5.5％。检测限度为0.5pmol/L。CNP和NTproCNP SDS使用本发明人预先描述的参照范围确定(Olney RC et al(2012)Clin Endocrinol(Oxf)21Mar 2012doi:10.1111/j.1365-2265.2012.04392.x)。

在测定之前提取胎盘组织带(母体是蜕膜表面，胎儿是绒毛膜表面及中间带)(Yandie et al,如前)，之后如上述测量。数值以fmol/g提取的组织表示。

统计学分析

结果以中位数(四分位数间距，IQR)或者平均数加SD或SEM表示，如文本中所示。斯皮尔曼等级系数(Spearman rank coefficient)用于确定变量之间相关性，以r值表示。当p<0.05时，具有统计学意义。进行多变量线性回归分析，使用反向逐步方法考虑因子(backward stepwise approachconsidering factors)，通过单变量分析在r>0.2水平是有意义的。CNP和NTproCNP的参照范围曲线通过LMS程序(Cole TJ(1990)Eur J Clin Nutr44(1):45-60)评估，使用LMS Chart Maker软件(2.4版,Harlow PrintingLimited,South Shields,UK)进行。

实施例1在正常健康对照中的NTproCNP和CNP肽的分析

对象群体特征总结在表4中。绝大多数是高加索人(91.2％欧洲人、2.7％毛里人或太平洋岛人及6.1％是其它人种或未知)。与美国人口规范(McDowell MA et al(2008)National Health Statistics Reports 0:1-45)相比，成人身高相似，但是BMI显著较低(p<0.005)。在总组中，3个(自我报告的)血管风险因素(吸烟(n＝25个对象)、高血压(n＝51)、脂质失调(n＝32))中存在一或多个的为33％。在其余(67％)中不存在血管风险因素。3个对象有糖尿病(全部是2型)。

表4 正常对象的特征

IQR,四分位数间距

CNP形式及年龄和性别作用

个体对象中NTproCNP和CNP的血浆浓度显著相关(r＝0.32,p<0.001)。如图2所示，在男性中中位血浆NTproCNP和CNP下降，在50岁时到最低点，之后水平逐渐增加。在女性中，在30-50岁期间最初降低及50岁后中位值上升趋势均低于男性。在21-80岁年龄范围，NTproCNP(r＝0.24,p<0.001)和CNP(r＝0.49,p<0.001)均与年龄相关(表5)。

表5 与利尿钠肽形式的相关性

数据是Spearman相关系数。括号内数值是对象数

显著相关黑体示出。*p<0.05,**p<0.001

NTproCNP中位浓度在男性中高于在女性中(p<0.001)，而CNP在性别之间无差异(p＝0.3)(表6)。在每10岁中，男性中的中位血浆NTproCNP超过女性中的值，而在30-70岁，CNP在女性中较高。

表6 性别对利尿钠肽循环浓度的作用

女性男性PCNP(pmol/L)0.72(0.6-0.9)0.70(0.57-0.84)0.28NTproCNP(pmol/L)15.8(13.7-18.8)18.4(15.9-21.0)<0.001BNP(pmol/L)6.0(3.6-8.0)4.3(2.8-6.4)<0.05NTproBNP(pmol/L)20.8(11.1-33.9)12.3(7.6-20.0)<0.01

数值是具有四分位数间距的中位值

与身高和BMI的相关性

对于所有对象，NTproCNP与身高无相关性。但是，当单独分析性别时，在男性(r＝-0.27,pO.001)和女性(r＝-0.32,p<0.001)中成人身高显示与NTproCNP的负相关(图3)。CNP的相应r值在男性和女性中分别是-0.25(p<0.05)和-0.18(p<0.05)。未发现每种肽与BMI相关。

与肾功能的相关性

如图4所示，血浆NTproCNP与血浆肌酸酐强相关(r＝0.56,p<0.001)。CNP与肌酸酐的关联性不显著，但是两种肽均与eGFR显著负相关(p<0.001)表5)。

在逐步多元线性回归后，血浆肌酸酐、身高和性别保持与血浆NTproCNP的循环浓度独立相关，r＝0.59。在下述回归模型中变量的共线性是适度的，如方差膨胀因子<2.3所示。

NTproCNP＝25.17+(2.79x性别)-(15.34x身高)+(0.17x肌酸酐)

与血管风险因素的相关性

CNP和NTproCNP的血浆浓度均与许多存在的血管风险因素正相关(对于两者，分别为r＝0.22和0.14,p<0.05，表5)。对于单独高血压(高显著性危险因素)，51个报告了血压升高史。这些对象(除了8个接受治疗的对象之外的全部)均具有相比于无血压升高史的对象更高的中位数血浆NTproCNP水平[18(16-22)vs 16(14-19)pmol/L,p<0.01)]。

实施例2分析冠脉疾病对象中的CNP肽

粥样斑的冠脉累及程度与NTproCNP之间的相关分析示于图5。NTproCNP的平均值(括号中是SE)随着累及的血管数而显著增加(p<0.05)；无血管累及为18.3pmol/L(0.84)，1个血管累及为19.6pmol/L(0.37)，2个血管累及为21.3pmol/L(1.03)，3个血管累及为22.8(1.26)pmol/L。

实施例3妊娠对象中的母体血浆CNP肽

人口统计及临床数据

在登记时正常(N)妊娠和并发性(C)妊娠组之间针对母亲年龄(33.2和31.2岁)、身高(165和165cm)、BMI(24和26)、收缩压(111和113)或舒张压(70和68mm Hg)没有显著差异。N组中24个中的15个(64％)是未经产的，C组中28个中16个(57％)是未经产的。在登记时N组对象中24个中有15个(62％)评级为高风险，C组中28个中有21个(75％)评级为高风险。在28个C组对象中有3个诱导受孕，在24个N组对象中有1个诱导受孕。在N组和C组中分别记录有3个和4个对象自己报告吸烟。

血浆CNP肽

在N组和C组对象中母体血浆NTproCNP和CNP的系列变化示于图6。数据(平均值和SEM)作为就诊次数(1-6)相应于以周表示的最接近孕龄(分别为16、20、24、28、32和36周)而绘图。还示出了同龄健康未妊娠妇女的平均值和SEM(图6)。正常vs并发性妊娠在20周和36周的相应值示于图7。

注意到下述各点：

1.与N组相比，在C组中血浆NTproCNP值显著增加(ANOVA分析，p<0.001)。

2.尽管在16周数值无显著差异，但是在20周N组血浆NTproCNP下降而C组不下降。

3.N组NTproCNP值保持低于初始值直至32周。

4.在两组中，NTproCNP在28周后进一步增加，在C组中更显著。

5.参照表2和图6，在24周C组对象中显著升高的NTproCNP浓度发生在少于半数对象(28个中12个)被识别有不利事件的时间。

6.与健康非妊娠女性中的血浆NTproCNP值(表1)(15.7±0.8pmol/l,n＝25)相比，在N组中在怀孕20周时的数值显著降低(12.5±0.4pmol/l,n＝17,p＝0.001)。

7.尽管血浆CNP低(<1pmol/l)并且接近于检测水平，在怀孕28周后C组中的浓度显著超过N组。

CNP值与特异性不利事件的关联

A.高血压

10个对象在怀孕中的一些时间点具有升高的收缩或舒张压。一另外的对象具有先兆子痫的所有标志，但是没有血压升高。具有HELLP综合征的这个对象因此在此被考虑，因为这个综合征中的血管疾病类似于在先兆子痫中观测到的。在10个具有升高血压的对象的5个中，未鉴别除异常血压之外的事件。这5个对象中的母体血浆NTproCNP示于表7A，与首次检测到异常血压时的孕龄(最近周数)一起示出。如表所示，在3个对象中血浆NTproCNP水平近似于在N组中所见的值，而在2个对象中，数值在晚期怀孕时增加。可以得出结论，发现收缩压大于等于140或者舒张压大于等于90本身不必然增加母体NTproCNP。与这些发现相反，10个具有升高血压的对象中有2个对象以及具有HELLP综合征的对象显示严重不利事件。他们的NTproCNP值也列于表7B中。

表7 在具有升高的血压的患者中的血浆NTproCNP浓度(pmol/L)。黑体字数值表示首次检测到升高的时间

在对象p51中，显示出正常指数，包括重复的正常血压水平和正常胎儿生长，在38.8周记录到突然的血压增加(157/100)，并且有先兆子痫迹象(尿蛋白增加及肝功测试异常)，需要紧急引产。母体血浆NTproCNP在20周时已经明显升高，并且持续进行性升高，在32周时达到29.2pmol/l，即先兆子痫变为临床明显之前6周。在对象p13中，血压在怀孕期间是正常的，但是在24周检测到胎儿生长降低。监测显示直到37周没有其它不利事件，在37周时突然发生HELLP综合征的临床特征，需要紧急剖腹。在这个对象中，血浆NTproCNP在28周升至20.7pmol/l，然后在36周为38pmol/l，即识别紧急情况前几周。在对象p14中，血压温和升高(在24周时为140/80)及在怀孕晚期，胎儿生长保持正常。但是在39周，在产前出血及出现胎儿窘迫迹象后需要紧急剖腹。未预料到地，出生时婴儿是生长受限的。在这个对象中，血浆NTproCNP在24周明显升高(22.6pmol/l)，在32周达到峰值27.5pmol/l。因此，在所有3个病例中，至少在标准监测程序进行关注之前几周，血浆NTproCNP均显著高于在N组中发现的那些水平。

B.宫内生长受限(小于胎龄，SGA)

鉴别了8个具有IUGR的新生儿(出生体重<5％)。在8个对象中的3个中(p15,p24，p56)，生长疾病是独立发现，而在5个对象中，生长受限与一或多个额外不利事件相关。这2个亚组的个体值和平均母体NTproCNP值示于表8。

表8 具有宫内生长受限的患者中的血浆NTproCNP浓度(pmol/l)

在具有独立的IUGR的3个对象中(表8A)，在32周NTproCNP值已增加到在N组观测到的水平以上。在其中1个对象中(p15)，在24周估计胎儿体重(EFW)是95^th百分位数，在第28和32周是50^th百分位数，在36周降至25^th百分位数。血浆NTproCNP从28周的13.5pmol/l突然升至32周的21.9pmol/l，并且在36周保持增加(22.7pmol/l)，尽管EFW保持在正常限之内。在出生时(41周)，出生体重(BW)<5^th百分位数。在第二个病例中(p24)，EFW在24周是20^th百分位数，在28周是40^th百分位数，在32-36周降至<5^th百分位数。在20-24周母体血浆NTproCNP值是正常的(13-14pmol/l)，但是在28周即检测到任何胎儿生长降低之前增加到17.3pmol/l。在第三个病例中(p56)，在24、28、32和36周EFW分别在10^th、20^th、35^th和20^th百分位数。此例中血浆NTproCNP接近于N组观测水平，直至从28周的11pmol/l升至32周和36周分别为16pmol/l和15.7pmol/l。这个增加与对发生IUGR的反应一致，在本例中仅在胎儿出生后检测到IUGR。总之，这些结果支持如下假设，即母体血浆NTproCNP的增加可以是胎儿生长降低的适应性反应。

C.加速生长(大于胎龄，LGA)

在27个病例中鉴别了3个出生时大的婴儿。在一个病例中(p1)，加速生长与GDM相关，在28周时鉴别了GDM，最初仅饮食治疗。在24周，EFW是90^th百分位数，在28周是80^th，在34周>95^th百分位数，在34周开始胰岛素治疗。母体NTproCNP水平从20周的15.4升至32-36周的18pmol/l。在第二个病例中(p62)，在24周EFW是85％，在28周增加至>95％并保持。在20-28周时血浆NTproCNP是13.2-15pmol/l，之后发现高得多的值(在32周和36周分别是21.6和23.2pmol/l)。这些关联性与如下观点一致，过度胎儿生长导致的需求可刺激CNP产生。第三个对象(p53)特别有指导性。这一32岁未经产的(即从未产过存活儿)被评估为低风险，直至33周怀孕仍是平稳妊娠，在33周因为先兆早产而紧急入院。她接受标准护理(卧床休息，静脉内硝苯地平，及倍他米松)，稍后出院继续积极(但高度压力的)职业生活，直至6周后平稳生产。在24周时EFW是10^th百分位数，在28周增加到50^th，在先兆早产时>95^th百分位数。在20周时血浆NTproCNP升高(24.5pmol/l)，到32周和36周分别显著增加至30.2和54.6pmol/l。加速胎儿生长(24周左右开始)和先兆早产组合加上过度压力职业生活，可能是导致母体血浆NTproCNP非常大增加的全部因素。在唯一的其它“无并发症”先兆早产情况中(p59)，其发生在35周，血浆NTproCNP也从10.7pmol/l升至36周的16.9pmol/l。

D.妊娠糖尿病(GDM)

4个妇女发生了GDM。一个示出加速胎儿生长，如上所述。在其余3个病例中(p6,p9,p31)，一个病例(p6)在28周发生GDM，此时开始二甲双胍治疗。EFW在24周是35％，在28周是40％，在32周是60％，此时加入胰岛素治疗。在此，血浆NTproCNP在16-24周升高(23.5-31.1pmol/l)，该水平在28周和32周即在糖尿病治疗开始后分别下降至15.8和13.4pmol/l。这种时间顺序提示妊娠期间发生糖尿病刺激CNP，随着母体葡萄糖水平恢复正常，CNP降低。在另一个对象中(p9)，在28周检测到糖尿病，在32周开始胰岛素治疗，此时鉴别到胎儿生长减缓(EFW<5^th百分位数)。在33周自发早产，产出生长受限婴儿。母体血浆NTproCNP在20周升高(17.1pmol/l)，之后降低至在28-32周为13-14pmol/l的水平，推测是应答母体血浆葡萄糖水平的校正。第三个对象(p31)为多囊卵巢综合征接受二甲双胍，但是在登记时停止这个治疗。在26周，诊断出GDM，在28周再次开始二甲双胍治疗。在36周左右她的血压升至172/117，此时她入院并用甲基多巴治疗以降低血压。没有先兆子痫迹象。在36.9周发生自发早产。在这个对象中EFW从25周的30％增加到32周的80％，随后在生产时降至30％。血浆NTproCNP从24周的14.4pmol/l升至28周的18.2pmol/l，然后在开始糖尿病治疗后在32周降至15.6pmol/l。注意，在36周所述水平增加很多(24.5pmol/l)，此时在生产前她的血压升高。这些发现一起强烈提示在怀孕期间未控制的糖尿病中NTproCNP增加，并且随着治疗而降低。这些观测进一步证实血压增加与血浆NTproCNP增加的关联性。

E.胎盘早剥

一个对象(p2)在28周出现早剥。直至24周妊娠相对平稳，在24周她因为阴道出血而入院。医嘱卧床休息，但是出院后大约2周(GA 28周)她重新入院，经超声波证实有胎盘早剥临床特征。给予倍他米松。在36周引产。胎盘史显示有陈旧边缘胎盘(膜后(retro-membranous))血肿，没有血管梗塞或母体血管病变迹象。在这个对象中，母体血浆NTproCNP是正常的(在16-24周为10-14.3pmol/l)。在28周，发现低值(8.6pmol/l)，相应于24小时前给予倍他米松。随后在32周值正常(12.8pmol/l)。因此，在这个对象中血浆NTproCNP是正常的，除了预期在高剂量糖皮质激素类之后抑制时间短。发现正常水平符合良性胎盘组织学及不存在血管损害如梗塞/缺血。

F.升高的NTproCNP与胎盘病理学的关联性

尽管在本研究中未被指定为终末点，但是检查母体CNP水平与胎盘组织学专家确定的解剖学发现的任何关联性是有益的。在4个对象中(p13,p51,p54p14)，胎盘组织学发现的详细报告可供分析。在这4个对象的3个中，发生与血压显著增加或HELLP综合征相关的严重(血管)不利事件。在所有3个病例中(p13,p14,p51)，有胎儿血管病变、斑片状马蹄绒毛组织炎(patchyvillitis)或血管化不良绒毛的迹象。在第4个对象中，注意到涉及绒毛的显著的胎盘钙化及绒毛发育不全迹象，与胎盘床灌注不足及母体缺氧一致。图8示出这4个对象以及第5个对象(p29)中母体血浆NTproCNP的变化，所述第5个对象在23周有创伤性胎盘出血/梗塞。平均值从20周的17.1pmol/l增加到24周的21.3，在36周升高到29.4pmol/l，比正常妊娠中发现的水平高得多。总之这些变化与在5个病例中的4个中客观观测到的胎盘血管病变相关。显著地，这些对象中的血浆NTproCNP在早至24周并且在识别任何血管疾病之前就升高。

CNP值与正常组中的临床发现的关联

将这组分类为正常是遵循这些妊娠无一显示任何预定终末点这个事实。因此重要的是检查母体NTproCNP与不是该研究终末点的可能事件的任何关联，例如在出生时不表现为生长疾病的胎儿生长速度的区间异常。因此回顾了下述亚组。

A.怀孕期间胎儿生长迟缓

使用任意定义(任何EFW<5％，或者所示生长的区间下降与在4周期间内定制的百分比点相比下降>20EFW)，回顾6个病例(p22,p26,p58,p60,p63,p66)。平均值列于表9。

表9 显示胎儿生长迟缓的区间的对象中的血浆NTproCNP(pmol/L)

数值与不具有胎儿生长区间下降的N组其余18个对象的没有显著不同。这些结果提示当妊娠其它均正常时，由定制EFW指数检测的相对小的区间下降不干扰母体血浆NTproCNP值。

B.胎儿生长中的加速增重

同样使用任意定义(任何EFW>95％，或者所示生长的区间增加与在4周期间内定制的百分比点相比升高>20EFW)，回顾5个病例(p20，21，55，61，67)。其中之一(p21)被认为是离群值(见下述)。表10示出这5个对象中的个体值和平均值。排除离群值，数值显示比不具有任何区间生长疾病的正常组中见到的更大的向上趋势(见下述及表11)。

表10 在显示加速胎儿生长的区间的对象中的血浆NTproCNP(pmol/l)

C.鉴别N组中不具有区间生长疾病或可能损害胎儿安宁(welfare)但不是终末点的其它因素的对象

为了定义绝对正常的怀孕，对母体NTproCNP值进行分析，排除(i)具有区间生长疾病的那些及(ii)在怀孕前或怀孕期间发生的可能损害胎儿母体健康的其它未预料事件的那些。在这些基础上，排除具有单条脐动脉的一个对象(p17)及承认具有急性化脓性阑尾炎的一个对象(p60)。还排除了一个对象(p21,在16周时NTproCNP为18.6pmol/l)，因为她的结果在N组所有其它对象的范围外。这个对象具有最高BMI(33，N组平均为24.3)，并且在登记时被评为高风险。她前2次妊娠均并发IUGR，其中一次导致胎儿在38周时于子宫中死亡。因为这些原因，该对象请求在37周怀孕时早期引产。因此，反常NTproCNP值、异常体重和她过去产科史充分支持排除。其余11个对象(p3,p5,p11,p12,p19,p20,p50,p52,p64,p68,p70)的平均值列于表11。注意，平均值低于分类为N组的24个对象的平均值。

表11 在不显示区间生长疾病或可能损害胎儿安宁的其它因素的N组女性中的血浆NTproCNP(pmol/l)

CNP肽在预测妊娠并发症中的应用

上述结果清楚显示血浆中母体NTproCNP浓度在后来进展经历不利事件的对象中异常增加。与目前采用的确定风险的许多测试不同，NTproCNP似乎应答多种不利事件而增加，不仅是那些影响胎儿生长或异常血压的不利事件。另外，增加发生在怀孕早期，通常在存在任何不利事件之前。尽管本文研究的对象总数少，但是已经很显然早至24周的NTproCNP血浆浓度就具有预测价值。在24周的测试的特异性和灵敏性由图10的ROC曲线示出。曲线下面积(AUC)是0.754，表明超过75％的在该时间点取样的对象可以被精确评估。对于使用13.3pM截断值的数值，阳性预测值是78％。使用“纯化的”正常组(表11中列出的11个对象，并且更可能代表社区中健康妊娠女性)，获得了甚至更好的风险分类。

结论

本研究发现与平稳正常怀孕相比，在其中不利产科事件威胁胎儿-母体健康的妊娠中早至20周的母体血浆NTproCNP浓度就显著增加(图6)。显著地，在大多数对象中母体NTproCNP的增加在首次不利事件迹象之前出现，并且可以早在20-24周就是明显的。

在平稳正常怀孕中，在怀孕20-24周时母体血浆NTproCNP浓度显著低于(p＝0.001)在同龄非妊娠健康对象中发现的NTproCNP浓度，但是在倾向于不利事件的对象中的NTproCNP水平类似地比非妊娠对象中的NTproCNP水平高。

数据显示母体血浆NTproCNP在正常和并发性妊娠中在怀孕28周后均进行性增加，在此时胎儿生长最快速增加，及因此需要母体循环(图6)。

使用在24周时母体血浆NTproCNP浓度预测不利事件的发生，发现NTproCNP浓度超过13.3pmol/L具有78％的阳性预测值，在24周时母体血浆NTproCNP浓度低于13pmol/l具有74％的阴性预测值。

最高母体NTproCNP浓度发生在基于血管疾病后来显示严重不利事件(先兆子痫、HELLP综合征、伴有独立不利事件的高血压)的对象中。令人感兴趣地，如果具有单一不利事件的对象然后发生第二个(但是不同的)不利事件，母体血浆NTproCNP的增加甚至更加显著。

当针对正常妊娠中的系列变化进行评价时(其中区间生长疾病和/或其它未预料到的事件被排除)，在任何怀孕时期在4周区间有超过4pmol/l变化与后续发生不利事件强相关。

由于在仅具有升高血压的对象中的母体血浆NTproCNP可能通常是正常的，而在那些进展为并发症的对象中数值增加，在怀孕任何时间点的母体NTproCNP水平可以用于区分处于更高风险的高血压对象。

关于胎儿生长，母体NTproCNP的增加在胎儿生长显著变化(降低或加速)之前或者与其同时。因此，在胎儿生长不良背景中升高的母体NTproCNP可以用于选择易于受益于目的在于改善对胎儿的血流的治疗的妊娠。

关于妊娠糖尿病(GDM)，在治疗之前对象中血浆NTproCNP增加，发现在校正治疗后降低。母体血浆NTproCNP的这些降低对于后者的干预是独特的，并且与通常在并发性妊娠中注意到的强向上倾斜相反。

另外，还发现在先兆早产发生之前血浆NTproCNP浓度增加。

母体NTproCNP的显著增加发生在组织学明显的胎盘灌注不足状态背景下，如缺血、梗塞、马蹄绒毛组织炎和胎儿血管病变。

相反，母体血浆CNP浓度是更加可变的，发现在怀孕28周之前，CNP水平(与NTproCNP不同)在发生不利事件之前不与对象相关。这可以通过在妊娠期间组织中CNP降解而解释。

考虑到以上，在正常妊娠中，血浆NTproCNP水平在早期怀孕中通常降低，典型地保持在低于同龄非妊娠女性的水平以下。这些变化可能是正常血管系统对已知发生在早期怀孕的降低的母体外周动脉抗性的反应。未显示这种独特的下降可能是处于不利事件风险的对象的特征。当妊娠期间发生并发症时CNP和NTproCNP肽的增加可能是i)对循环未满足妊娠带来的需求的适应性反应和/或ii)对异常胎儿生长的反应。

评论

本发明提供了强力证据证明血浆NTproCNP与血管风险、妊娠期间的不利事件及明显(已确立的)动脉硬化正相关。另外，在健康志愿者对象中，NTproCNP血浆水平在男性中高于女性，并且在年纪更大时增加，特别是在男性中，这个发现符合这些背景中公认的动脉硬化的流行。在健康志愿者组中未预料到的发现是血浆NTproCNP与男性和女性的成年身高显著性倒数相关，更矮的对象具有更高的水平。注意，统合分析表明在身材矮小对象中冠状动脉病的发生率增加。本发明人的观测—低身高、增加的血浆NTproCNP和血管风险提供了证据支持NTproCNP作为未来血管并发症的生物标记的作用。

在健康志愿者组中及在先前研究中(Schouten BJ et al(2011)32(4):797-804)，发明人发现血浆NTproCNP与血浆肌酸酐的强相关性。从血浆中肽的肾清除明显影响体循环中的浓度，并且在解释临床背景中的数值时需要被考虑。肾脏血管系统本身易于动脉硬化，其容易损害肾功能。累积效应(在肾脏动脉硬化血管内CNP产生增加及从血浆中NTproCNP肾清除降低)会增强血浆NTproCNP的升高，并且可以有助于后几十年观测到的增加(见图2)。

在具有增加的冠状动脉累及的对象中血浆NTproCNP浓度更高这个发现先前未有报道。结果强烈提示存在单向性增加，从不具有明显疾病(但是具有增加的血管风险)的那些对象中的低一些的数值随着粥样斑负荷增加而延伸到更高数值(图5)。随着血管累及增加而更高的浓度可以来自血管壁中增加的CNP基因表达(Casco VH et al(2002)Journal of Histochemistry&Cytochemistry 50(6)：799-809)或者来自随着内皮屏障被疾病损坏而进入到循环的肽流出增加(Jones GT et al(2005)42(3):237-46)。例如，在影响脑微血管系统的动脉硬化中，这一损坏损害血脑屏障并且促进蛋白质释放或进入。重要地，发明人最近研究显示体循环中CNP和NTproCNP浓度的突然增加在需要用于冠状动脉病的支架插入的对象中成功初次经皮冠脉干预后立即发生。这是首次清楚证实这些CNP肽从冠状动脉硬化血管流出可以事实上显著急剧升高体循环中的水平。未来研究中观测降低粥样斑的干预期间的血浆NTproCNP是重要的，包括那些与他汀类药物治疗相关的干预。最近的报道显示急性心肌梗塞本身加重动脉硬化(Dutta P et al(2012)Nature487(7407)。因此在心脏病发作后监测NTproCNP可以用于跟踪血管疾病的延伸，并且可以允许早期干预，目的在于预防血管损害的进展。

在当前研究中最令人惊奇的观测是涉及妊娠中血浆NTproCNP的。据发明人所知，先前未报道早期妊娠中的血浆NTproCNP(或其它CNP多肽)水平。先前研究(Stepan H et al(1998)Journal of Perinatal Medicine 26(1):56-8和Walther T et al(2004)Journal of Endocrinology 180(1):17-22)报道在中期和晚期怀孕中的血浆CNP与非妊娠女性中的值没有不同，在并发先兆子痫或者子宫内生长受限(IUGR)的妊娠中发现的CNP当与正常妊娠相比时也没有不同。有关母体血浆CNP浓度的当前发现是相似的。但是，通过测量血浆NTproCNP，出现了相当不同的画面。与在后期平稳生产的女性中的中期怀孕的低得多的水平相反，在后期发生不利事件的女性中发现高得多的值。另外，随着怀孕前进，在后一组中的浓度持续显著升高，而在正常妊娠中的升高不显著。这些差异不能归为降低的肾清除，因为两组的血浆肌酸酐没有不同。因此，在妊娠早期测量NTproCNP看起来具有鉴别风险女性的强大潜力，使得能改善病灶及更有效监测以及早期治疗干预的可能性。

其它显著发现涉及发明人随着时间在并发症病例中观测到的血浆NTproCNP值的波动。例如，在患有妊娠糖尿病的对象中的升高的水平在进行成功治疗后下降。在发生先兆子痫特征的对象中，数值随着血压升高而增加，并且在这两种情况中，胎盘CNP含量(母体区(maternal zone))比其他病例高3-5倍。这些结果指出至少在风险对象中在怀孕期间系列监测血浆NTproCNP的重要应用。显著地，在登记时被评为低风险(使用现有技术评估，包括妊娠相关胎盘蛋白PAPP-A)但是具有高血浆NTproCNP值的对象后来发生不利事件。

未预料到地，在显示高NTproCNP水平的对象中鉴别的不利事件的范围非常多样化，包括看起来不相关的病理学，如胎儿生长畸变、妊娠糖尿病、先兆早产、先兆子痫和胎盘成熟过度(placental hypermaturity)(见表4)。这个发现与目前使用的评估高风险妊娠的一些其它血液生物标记不同，所述标记例如为sflt-1(先兆子痫标记)(Myatt L et al(2009)Journal ofThrombosis and haemostasis 7(3):375-84)及其它利尿钠肽ANP和BNP(Sugulle M et al(2012)Hypertension 59(2):395-401)，它们可能仅反映心脏负荷。

看起来在一些处于高风险妊娠并发症的女性中甚至在受孕前血浆NTproCNP就升高到正常值以上。妊娠日益被看成代表对母体血管稳态的主要挑战(Myatt L et al,如前)。因此，怀孕中的不利事件可能是稍后生命中对血管威胁的易感性的第一个证据。例如，显示IUGR或先兆子痫的妊娠女性当与没有这些并发症的妊娠女性相比时处于发生缺血性心脏病(IHD)或卒中的增加风险中(Myatt L et al,如前)。总而言之，NTproCNP是血管易损性的标记这个当前发现在广泛的人类病理生理学中具有应用，并且符合预先存在的亚临床血管疾病可能在早期妊娠中表现这个概念。

最后，如适用于许多血液生物标记，成人中的血浆NTproCNP值可能受血管结构以外的因素影响。例如，肾损伤会通过降低从血浆清除而升高水平。升高的浓度也可能出现在熟知的心力衰竭中(Wright SP et al(2004)Hypertension 43(1):94-100)及出现在具有增加的骨周转(Schouten BJ et al(2012)Clinical endocrinology 76(6):790-6)和晚期肝硬化(Koch A(2012)Clinical Biochemistry 45(6):429-35)的对象中。但是，缺乏清醒时间下的昼夜变化或每日变化、缺乏摄食作用及针对收集和储存的相对稳定性均是阳性属性，其应该在实践中促进临床应用，特别是现在已建立的年龄性别相关的SDS范围。