对WT1 mRNA的表达量进行定量的方法

摘要

本发明提供一种用于简便且在短时间内灵敏度良好地对人WT1的mRNA的表达量进行定量的方法，该方法可用于对白血病、实体癌等癌症的诊断和对骨髓移植时期的确定。该方法使用一步式RT-PCR法对人WT1 mRNA的表达量进行定量，其特征在于，使人WT1 mRNA及持家基因(mRNA)的逆转录反应及延伸反应同时且于同一容器内连续进行。

说明书

技术领域

本发明涉及一种对人WT1的mRNA的表达量进行定量的新方 法，该方法可用于对白血病、实体癌等癌症的诊断和对骨髓移植时 期的确定。

背景技术

肾母细胞瘤-1(Wilms tumor gene-1，以下称为“WT1”。)基 因是于1990年被Call等人鉴定为小儿肾母细胞瘤的致病基因的基因 (非专利文献1)。此后，还有报道显示WT1 mRNA不仅在小儿肾 母细胞瘤中高水平表达，而且在实体癌细胞株(例如胃癌细胞株、 大肠癌细胞株、肺癌细胞株及乳癌细胞株)等实体癌细胞中也高水 平表达(非专利文献2)。目前认为，WT1基因是不仅与小儿肾母 细胞瘤有关、并且还与多种癌症有关的癌相关基因。

Call等人报道了WT1 mRNA在白血病细胞株K562细胞及 CCRF-CEM细胞中的表达(参见非专利文献1)，Miwa等人报道称， 经Northern印迹分析发现，在22例急性髓细胞白血病(acute myeloid  leukemia，以下称为“AML”。)中的15例中有WT1 mRNA的表 达(非专利文献3)。另外，Inoue等人报道称，在AML的初诊时 在100％(45/45)的病例中均观察到WT1 mRNA表达。此外，还有 报道称：诊断时的WT1 mRNA表达量与预后有关(非专利文献5)； 即使通过治疗使得WT1 mRNA表达量一度转为阴性，但在复发时其 将再度升高(非专利文献6)；并且，复发时的WT1 mRNA表达量 较之诊断时的表达量有所增加(非专利文献7)。

如上所述，鉴于WT1基因以单一基因的形式在AML患者中高 频度出现，以及通过治疗转为阴性后、在复发时再度升高等事实， WT1基因因可在AML的治疗中用作为微小残留病灶(minimal  residual disease，以下亦称为“MRD”)的监测标志物，故而一直以 来已作为体外诊断用医药品而被贩售。

作为人WT1 mRNA的测定方法，以往已知有以β-肌动蛋白为基 准的竞争定量法(专利文献1)。但是，该测定方法不仅需要将WT1 mRNA与β-肌动蛋白的mRNA分开测定，而且还必须进行所谓的两 步式RT-PCR法(在逆转录反应完成后再进行延伸反应)，因此非 常耗费时间。

此外，作为另一种测定人WT1 mRNA的方法，专利文献2公开 了针对WT1 mRNA的一步式RT-PCR法。但是，在该方法中，需要 另行测定持家基因表达量(其用于对WT1基因表达量进行校正)， 因此较为繁杂。

专利文献

专利文献1：日本特开平11-89599号公报

专利文献2：日本特开平11-89596号公报

非专利文献

非专利文献1：Call,K.M.et al.,Cell 1990；60:509-520.

非专利文献2：Jpn.J.Cancer Res.1999；90:194-204.

非专利文献3：Miwa,H.,et al.,Leukemia 1992；6:405-409.

非专利文献4：Inoue,K.,et al.,Blood,1994,84(9),3071-3079.

非专利文献5：Blood 1997；90:1217-1225.

非专利文献6：Blood 1996；88:2267-2278.

非专利文献7：Blood 1996；88:4396-4398.

发明内容

如前所述，作为对WT1基因表达量进行定量的方法，已知的方 法存在需要大量时间且较为繁杂的问题，需要开发出能够简便地在 短时间内对人WT1基因表达量进行定量的方法。因此，本发明的目 的在于，提供一种能够简便地且在短时间内对WT1 mRNA进行定量 的新方法。特别地，本发明的目的在于，通过同时对人WT1 mRNA 和持家基因两者的表达量进行定量，提供能够简便地在短时间内对 WT1 mRNA进行定量的新方法。

本申请的发明人为解决上述课题而进行了锐意研究，结果发现， 通过使作为目的基因的WT1基因(mRNA)和作为校正用基因的持 家基因(mRNA)的逆转录反应及延伸反应同时且于同一容器内连续 进行(一步法)，可以简便地且在短时间内对作为目标的人WT1 mRNA的表达量进行定量。并且，本申请的发明人确认了通过使用 该一步式RT-PCR法，能够以比两步式RT-PCR法(其中分开对目 的基因和校正基因进行扩增)更为简便的方式、并且在与两步式 RT-PCR法几乎为同等程度的短时间内以更高的灵敏度检测出目的 基因。

本发明是基于上述发现完成的，包括下述实施方式。

(I)对人WT1 mRNA的表达量进行定量的方法

(I-1)对人WT1 mRNA的表达量进行定量的方法，其是使用 一步式RT-PCR法对人WT1 mRNA的表达量进行定量的方法，其特 征在于，使人WT1 mRNA及持家基因(mRNA)的逆转录反应及延 伸反应同时且于同一容器内连续进行。

(I-2)如(I-1)所述的方法，其中，持家基因为GAPDH mRNA。

(I-3)如(I-1)或(I-2)所述的方法，其中，在对人WT1 mRNA 的PCR扩增中使用：

(a)包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由 序列号4表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组(primer  set)；或

(b)包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由 序列号10表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组。

(I-4)如(I-1)或(I-2)所述的方法，其中，在对人WT1 mRNA 的PCR扩增中使用：

(a’)包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和 由序列号4表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标 记的由包含序列号5表示的碱基序列构成的探针；或

(b’)包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和 由序列号10表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经 标记的由序列号11表示的碱基序列构成的探针。

(I-5)如(I-3)或(I-4)所述的方法，其中，在对人WT1 mRNA 的PCR扩增中还使用：

(c)包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由 序列号7或12表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组。

(I-6)如(I-3)或(I-4)所述的方法，其中，在对人WT1 mRNA 的PCR扩增中还使用：

(c’)包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和 由序列号7或12表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组， 及经标记的由序列号8表示的碱基序列构成的探针。

(II)用于对人WT1 mRNA的表达量进行定量的实时PCR用试剂盒

(II-1)用于对人WT1 mRNA的表达量进行定量的实时PCR 用试剂盒，包含：

(a)包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由 序列号4表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组；或

(b)包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由 序列号10表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组。

(II-2)用于对人WT1 mRNA的表达量进行定量的实时PCR 用试剂盒，包含：

(a’)包含由序列号3表示的碱基序列构成的正向PCR引物和 由序列号4表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经标 记的由序列号5表示的碱基序列构成的探针；或

(b’)包含由序列号9表示的碱基序列构成的正向PCR引物和 由序列号10表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组，及经 标记的由序列号11表示的碱基序列构成的探针。

(II-3)如(II-1)或(II-2)所述的用于对人WT1 mRNA的表 达量进行定量的实时PCR用试剂盒，还包含：

(c)包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和由 序列号7或12表示的碱基序列构成的反向PCR引物的引物组。

(II-4)如(II-1)或(II-2)所述的用于对人WT1 mRNA表达 量进行定量的实时PCR用试剂盒，还包含：

(c’)包含由序列号6表示的碱基序列构成的正向PCR引物和 由序列号7或12表示的碱基序列构成的反向PCR引物组成的引物 组，及经标记的由序列号8表示的碱基序列构成的探针。

根据本发明的方法，可以提供一种比以往的WT1 mRNA表达量 的定量方法操作更简便、所需劳力更少、并且能在更短的时间内进 行测定的WT1 mRNA表达量的定量方法。另外，根据本发明的方法， 还能够以比以往使用两步式RT-PCR法的测定方法更高的灵敏度进 行测定。更具体而言，通过使用本发明的方法或本发明的实时PCR 用试剂盒，能够简便地且在短时间内灵敏度良好地对人WT1 mRNA 的表达量进行定量。

由此定量得到的人WT1 mRNA表达量，是对白血病或实体癌的 发病和复发的诊断、及预后判断、以及骨髓移植时期的确定来说有 用的指标。

附图简述

图1表示以各种浓度(图中，1：2.5×10⁵个拷贝/测试，2：2.5×10⁴个拷贝/测试，3：2.5×10³个拷贝/测试，4：2.5×10²个拷贝/测试，5： 2.5×10¹个拷贝/测试)的WT1 RNA标准品为对象、单独扩增WT1 mRNA时的WT1 mRNA扩增曲线(实施例1)。

图2表示以各种浓度(图中，1：1.0×10⁸个拷贝/测试，2：1.0×10⁷个拷贝/测试，3：1.0×10⁶个拷贝/测试，4：1.0×10⁵个拷贝/测试，5： 1.0×10⁴个拷贝/测试)的GAPDH RNA标准品为对象、单独扩增 GAPDH mRNA时的GAPDH mRNA扩增曲线(实施例1)。

图3表示以各种浓度(图中，1：2.5×10⁵个拷贝/测试，2：2.5×10⁴个拷贝/测试，3：2.5×10³个拷贝/测试，4：2.5×10²个拷贝/测试，5： 2.5×10¹个拷贝/测试)的WT1 RNA标准品为对象、同时对WT1 mRNA 和GAPDH mRNA进行扩增时的WT1 mRNA扩增曲线(实施例1)。

图4表示以各种浓度(图中，1：1.0×10⁸个拷贝/测试，2：1.0×10⁷个拷贝/测试，3：1.0×10⁶个拷贝/测试，4：1.0×10⁵个拷贝/测试，5： 1.0×10⁴个拷贝/测试)的GAPDH RNA标准品为对象、同时对WT1 mRNA和GAPDH mRNA进行扩增时的GAPDH mRNA扩增曲线(实 施例1)。

图5表示对通过下述方法得到的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳 的结果，所述方法为：作为引物及探针，使用(A)表8所示的序列 组(sequence set)(序列组B)、及使用(B)表9所示的序列组(比 较组(comparative set))，分别实施一步式RT-PCR法(其中同时 对WT1 mRNA和GAPDH mRNA进行扩增)。

具体实施方式

(I)对人WT1 mRNA的表达量进行定量的方法

本发明的方法是使用一步式RT-PCR法对人WT1 mRNA的表达 量进行定量的方法。

如前所述，作为本发明的测定对象的WT1基因，是被鉴定为小 儿肾母细胞瘤致病基因的、含有3037bp的基因，其已在NCBI中作 为“Homo sapiens Wilms tumor 1(WT1),transcript variant D,mRNA” 被登记(NM_024426.4)。其碱基序列示于序列表中的序列号1。

在本发明方法中作为测定对象的被测试样，只要含有上述人 WT1 mRNA，则没有特别限定，例如，可以使用通过已知方法对可 能含有WT1 mRNA的试样(来自人的细胞、组织、血液、痰液、粪 便、尿等的生物试样等)进行处理而得到的总RNA试样或mRNA 富集的试样等。RNA试样可以以水溶液的形式使用，或者在吸附或 固定化于适当的固相(solid phase)上的状态下进行使用。作为总 RNA量，每100μL反应液含0.01ng～1μg是合适的。

持家基因(housekeeping gene)是指与细胞分化无关地在任何细 胞中均始终表达的、虽不发挥特殊功能但具有这些细胞存活所必需 的作用的基因，例如，可举出编码RNA合成酶、能量代谢酶(energy  metabolizing enzymes)、核糖体蛋白质、细胞骨架蛋白质等的基因。 具体地，可举出编码GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)、β-肌动蛋白、β2-微球蛋 白、HPRT1(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1，hypoxanthine  phosphoribosyltransferase 1)等的基因。用于本发明中的持家基因， 优选为在利用RT-PCR的扩增中不与作为测定目标的人WT1基因竞 争的基因，例如，优选为与人WT1基因的碱基序列同源性低的序列。 上述持家基因优选为GAPDH基因。

GAPDH基因是作为“Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate  dehydrogenase(GAPDH),mRNA”被登记在NCBI中的基因(NM_002 046.3)。其碱基序列示于序列表中的序列号2。

作为本发明中一步式RT-PCR法(逆转录反应及延伸反应)所 使用的反应缓冲液，为适于使具有逆转录活性的酶显示活性的水溶 性缓冲液即可，例如，可举出pH7～10、优选pH8～9的缓冲液，例如 Tris缓冲液。此外，该缓冲液中还含有对具有逆转录活性的酶或DNA 聚合酶的活性而言为必需的各种离子。其中，Na离子、K离子可以 以盐的形式、以5～50mM的浓度被添加。Mg离子可以以盐的形式、 以1～10mM的浓度被添加。另外，根据需要，也可以配合表面活性 剂、牛血清白蛋白(BSA)、明胶等对具有逆转录活性的酶或DNA 聚合酶的活性具有促进作用或稳定化作用的试剂。此外，为抑制试 样中的RNA及RNA竞争物的分解，可以添加核糖核酸酶抑制剂。

作为具有逆转录活性的酶，可举出源自禽类成髓细胞瘤病毒 (avian myeloblastosis virus)的逆转录酶(AMV)、源自劳斯肉瘤 相关病毒(Rous-associated virus)的逆转录酶(RAV2)、源自莫洛 尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)的逆转录酶 (MMLV)、源自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的DNA聚合 酶(Tth)、源自热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的DNA聚合 酶(Bca)及前述各酶的衍生物，其中，Tth最适合于本发明。作为 Tth，可具体举出作为源自嗜热菌种Z05(Thermus species Z05)的热 稳定性酶(thermostable enzymes)的DNA聚合酶。需要说明的是， 这些酶可以从其本来的来源(original sources)纯化获得，也可以是 以基因工程方式生产的重组蛋白质。

反应液中添加有在cDNA合成及PCR中成为底物的4种三磷酸 脱氧核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP；本说明书中也将此4种 统称为“dNTP”)。另外，dNTP的全部或一部分在从引物合成的 DNA链能延伸的范围内可被替换为经修饰及/或经标记的dNTP。

在本发明中作为用于从靶RNA合成cDNA(逆转录反应及延伸 反应)的引物，是具有至少与靶RNA的碱基序列互补的碱基序列的 寡核苷酸，并且必须能在所采用的反应条件下退火到靶RNA上。作 为寡核苷酸的长度，可举出6～100个核苷酸，优选为10～30个核苷 酸。另外，也可以使用经修饰及/或经标记的引物。该引物可通过例 如已知的方法化学合成。另外，PCR中使用的引物必须至少能使以 来自靶RNA的cDNA为模板的DNA扩增得以进行。为此，该引物 是具有至少与模板cDNA的碱基序列互补的碱基序列的寡核苷酸， 并且必须能在所采用的反应条件下退火到该cDNA上。优选地，所 述寡核苷酸既在上述从靶RNA合成cDNA(逆转录反应及延伸反应) 的过程中作为引物起作用，还在以cDNA为模板的DNA扩增中作为 引物起作用。

作为适用于将本发明的目的基因即人WT1 mRNA逆转录为 cDNA、并进行延伸、扩增的引物组，可举出包括下述表1中所示的 (A1)正向引物及(A2)反向引物的引物组A，以及包括表2中所 示的(B1)正向引物及(B2)反向引物的引物组B。另外，表1及 表2中还一并示出了用于检测利用前述引物组扩增得到的人WT1基 因扩增产物的序列特异性结合探针((A3)探针、(B3)探针)。 需要说明的是，为使扩增产物的检测容易进行，上述探针优选为经 标记的。

另外，作为适用于将GAPDH mRNA(其可合适地用作本发明方 法中的持家基因)逆转录为cDNA、并进行延伸、扩增的引物组，可 举出包括下述表1中所示的(a1)正向引物及(a2)反向引物的引 物组A，以及包括表2中所示的(b1)正向引物及(b2)反向引物 的引物组B。另外，表1及表2中还一并示出了用于检测利用前述 引物组扩增得到的人GAPDH基因扩增产物的序列特异性结合探针 ((a3)探针、(b3)探针)。需要说明的是，为使扩增产物的检 测容易进行，上述探针优选为经标记的。

探针的标记方法有RI法和非RI法，优选使用非RI法。非RI 法可举出荧光标记法、生物素标记法、化学发光法等，优选使用荧 光标记法。作为荧光物质，只要能够与核酸的碱基部分结合，则没 有特别限定，可以使用花菁染料(Cy DyeTM系列的Cy3、Cy5等)、 罗丹明6G试剂、N-乙酰氧基-N-2-乙酰氨基芴 (N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorene)及其碘衍生物等。

[表1]

序列组A

^*：表示人WT1基因(NM_024426.4：序列号1)的区域。

^**：表示人GAPDH基因(NM_002046.3：序列号2)的区域。

[表2]

序列组B

^*：表示人WT1基因(NM_024426.4：序列号1)的区域。

^**：表示人GAPDH基因(NM_002046.3：序列号2)的区域。

本方法中使用的RNA标准品可通过已知的方法制作。例如，可 参照“Proceedings of the National Academy of Sciences of the United  States of America(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，第87卷，第2725～2729 页(1990)”、“Clinical Chemistry(Clin.Chem.)，第41卷，第819～825 页(1995)”、“Blood，第82卷，第1929～1936页(1993)”等 中的记载进行制作。

具体而言如下所述。向作为扩增对象的双链DNA序列加上作为 RNA合成酶(例如T7RNA聚合酶等)的反应起点的启动子序列， 制成作为RNA合成模板的DNA序列。向反应容器内加入RNA聚合 酶、含有RNA启动子序列的双链DNA、核苷三磷酸，于37℃反应 30分钟～2小时，由此合成与RNA启动子下游的模板DNA互补的单 链RNA。

作为本发明中使用的一步式RT-PCR法的反应操作及反应条件， 没有限制，可列举如下。

向反应容器内加入含有例如cNTP、Mg盐、核糖核酸酶抑制剂、 具有逆转录活性的酶、引物等的反应液，在反应开始前于4℃以下 冷藏。向该反应容器中添加可能含有欲测定的人WT1 mRNA的被测 试样及持家基因(例如GAPDH mRNA)，以温度为50～70℃(优选 为55～65℃)、时间为2～30分钟左右(优选为2～10分钟左右)的条 件多次反应，从而合成cDNA(逆转录反应)。接着，于90～99℃ 加热10秒～2分钟左右，使RNA-cDNA复合体变性(热变性)。进 而，实施2～50个的下述温度反应循环，由此扩增来自靶RNA的DNA 片段，每个温度反应循环由90～99℃下的热变性、45～65℃下的退火 反应、以及60～80℃下的DNA延伸反应构成。另外，为提高灵敏度 及/或特异性而实施嵌套式PCR(nested PCR)时，可以将用于第1 阶段、第2阶段的PCR的引物从开始时就一起添加进反应容器，连 续地实施两个阶段的PCR。在该情况下，用于第1阶段PCR的引物 量必须要少于用于第2阶段PCR的引物量，前者优选为后者的1/100 以下。

根据上文说明的本发明方法，不仅可以通过在同一容器内进行 的一步式RT-PCR法来简便地测定人WT1 mRNA的表达量，并且还 能够以比两步式RT-PCR法(其中分开实施目的基因的RT-PCR和 持家基因的RT-PCR)更高的灵敏度来检测人WT1 mRNA的表达量 (如实施例2所示)。换言之，根据本发明的方法，即使是对人WT1 mRNA表达量为低浓度的试样，也能够进行高精度检测。

该方法可以通过使用下文说明的实时PCR试剂盒来简便实施。

(II)用于对人WT1 mRNA表达量进行定量的实时PCR用试剂盒

本发明的RT-PCR用试剂盒的特征在于，包含用于对人WT1 mRNA进行RT-PCR法的引物组、和用于对持家基因(优选为GAPDH  mRNA)进行RT-PCR法的引物组两者。该试剂盒还可以含有用于对 通过RT-PCR法扩增得到的人WT1 mRNA的扩增产物及持家基因的 扩增产物进行检测的探针。

作为试剂盒的一个例子，可举出下述试剂盒，所述试剂盒包含： 包含表1所示的“(A1)正向引物(序列号3)”及“(A2)反向 引物(序列号4)”的引物组A(其为用于对人WT1 mRNA进行 RT-PCR法的引物组)，及表1所示的“(A3)探针(序列号5)” (其为用于对使用前述引物组扩增得到的人WT1基因扩增产物进行 检测的序列特异性结合探针)；并且，所述试剂盒包含：包含表1 所示的“(a1)正向引物(序列号6)”及“(a2)反向引物(序列 号7)”的引物组A(其为用于对人GAPDH mRNA(其可合适地用 作持家基因)进行RT-PCR法的引物组)，及表1所示的“(a3) 探针(序列号8)”(其为用于对使用前述引物组扩增得到的人GAPDH 基因扩增产物进行检测的序列特异性结合探针)。

需要说明的是，为使扩增产物的检测容易进行，探针优选为经 标记的。

探针的标记方法有RI法和非RI法，优选使用非RI法。非RI 法可举出荧光标记法、生物素标记法、化学发光法等，但优选使用 荧光标记法。作为荧光物质，只要能够与核酸的碱基部分结合，则 没有特别限定，可以使用花菁染料(Cy DyeTM系列的Cy3、Cy5等)、 罗丹明6G试剂、N-乙酰氧基-N-2-乙酰氨基芴及其碘衍生物等。

作为试剂盒的另一个例子，可举出下述试剂盒，所述试剂盒包 含：包含表2所示的“(B1)正向引物(序列号9)”及“(B2)反 向引物(序列号10)”的引物组B(其为用于对人WT1 mRNA进行 RT-PCR法的引物组)，及表2所示的“(B3)探针(序列号11)” (其为用于对使用前述引物组扩增得到的人WT1基因扩增产物进行 检测的序列特异性结合探针)；并且，所述试剂盒包含：包含表2 所示的“(b1)正向引物(序列号6)”及“(b2)反向引物(序列 号12)”的引物组B(其为用于对人GAPDH mRNA(其可合适地用 作持家基因)进行RT-PCR法的引物组)，及表2所示的“(b3) 探针(序列号8)”(其为用于对使用前述引物组扩增得到的人 GAPDH基因扩增产物进行检测的序列特异性结合探针)。

本发明的RT-PCR用试剂盒，除含有上述成分以外，还可以含 有逆转录反应与PCR这两种反应所必需的各种成分(dNTP、Mg盐、 用于调节pH的缓冲成分等)、和具有逆转录活性的酶。此外，也可 以添加用于使酶稳定的成分、核糖核酸酶抑制剂等。

取必要量的上述反应液至适当的反应容器中，添加待测定的试 样，由此即可开始反应。因此，可以简便地实施对人WT1 mRNA表 达量的定量。特别地，在对多份被测试样进行人WT1 mRNA表达量 的定量时是有用的。另外，通过预先准备好已分注有单次所需量的 该反应液的反应容器，可以进一步改善操作效率。按照上述方法， 本发明的RT-PCR用试剂盒可以简便、迅速地对人WT1 mRNA的表 达量进行定量，且不存在交叉污染问题。作为该试剂盒，可举出含 有用于上述方法的各种试剂的试剂盒、含有上述本发明所使用的反 应液的试剂盒、含有分注有单次分量的该反应液的反应容器的试剂 盒等。该试剂盒作为各种检查用的试剂盒、尤其是临床诊断用的试 剂盒是特别有用的，可以广泛应用于白血病的检查、实体癌微小转 移的检查、微小残留病灶的检查、感染症的检查等。

实施例

以下给出实施例，更详细地说明本发明。但是，本发明并不限 于这些实施例。

[实施例1]

一步式多重RT-PCR的测定

(1)引物和探针的设计

以人WT1 mRNA作为测定对象的目的基因，选择GAPDH  mRNA作为对测定对象的表达量进行校正的内源性对照基因(校正 基因)，设计并合成能对各基因进行特异性扩增和检测的引物组及 探针。

为了同时对目的基因(人WT1 mRNA)和校正基因(GAPDH  mRNA)进行检测，如下制备了荧光标记探针。即，用FAM(6-羧 基荧光素)对用于检测目的基因的探针的5’末端进行标记，用HEX (6-六氯荧光素)对用于检测校正基因的探针的5’末端进行标记。 另外，使用ATTO-540Q(ATTO-TEC GmbH公司)作为淬灭染料 (quenching dye)，对各探针的3’末端进行标记。

本实施例中使用的引物及探针的序列示于表3。

[表3]

(2)标准品(WT1 mRNA、GAPDH mRNA)的制备

如下所述制备标准品。从表达WT1 mRNA及GAPDH mRNA的 白血病细胞株K562中提取RNA，以该RNA为模板，使用与WT1 mRNA的碱基序列互补的引物及与GAPDH mRNA的碱基序列互补 的引物实施RT-PCR，由此得到WT1 mRNA及GAPDH mRNA的一 部分碱基序列。将得到的WT1 mRNA序列及GAPDH mRNA序列克 隆进pT7blue质粒载体，并对大肠杆菌DH5α株进行转化。然后，对 该经转化的大肠杆菌进行培养，提取质粒DNA。使用限制性内切酶 EcoRI对质粒DNA中位于插入了WT1 mRNA序列及GAPDH mRNA 序列的部分之后的序列进行切断，得到直链状DNA。使用T7RNA 聚合酶(其识别质粒DNA所含有的T7启动子序列，以DNA为模板 合成RNA)合成WT1 mRNA及GAPDH mRNA的RNA序列。使用 TE缓冲液(其中含有50ng/μL的大肠杆菌转运RNA)对合成的RNA 进行稀释以防止其对反应容器的非特异性吸附，由此制备各基因 (WT1及GAPDH)的RNA标准品。

将如上所述制备的WT1 RNA标准品的浓度调整为2.5×10¹、 2.5×10²、2.5×10³、2.5×10⁴、2.5×10⁵个拷贝/测试。将GAPDH RNA 标准品的浓度调整为1.0×10⁴、1.0×10⁵、1.0×10⁶、1.0×10⁷、1.0×10⁸个拷贝/测试。

(3)RT-PCR反应

使用一步式RT-PCR法进行RT-PCR，所述一步式RT-PCR法中， 逆转录反应与PCR反应在1个管内连续进行。

(3-1)逆转录酶

使用了Z05DNA聚合酶(来自嗜热菌种Z05的热稳定酶，Roche  Diagnostics公司)

(3-2)反应条件

(a)逆转录反应和PCR反应

实施共计15分钟(55℃下5分钟，60℃下5分钟，65℃下5 分钟)的逆转录反应后，重复进行45个循环的PCR反应，每个循 环由92℃下15秒的热变性、60℃下40秒的退火、及DNA延伸反 应构成。

(b)试剂浓度

使反应液的体积为20μL，使其中的正向引物及反向引物的最终 浓度分别为0.2μM。探针的最终浓度为0.1μM。

(3-3)反应·测定装置

使用Applied Biosystems 7500快速实时PCR系统(Life  Technologies)实施RT-PCR。

(4)结果

(4-1)荧光扩增曲线的确认

确认了：(a)单独扩增WT1 mRNA时的WT1 RNA标准品的荧 光扩增曲线和扩增循环数；(b)单独扩增GAPDH mRNA时的 GAPDH RNA标准品的荧光扩增曲线和扩增循环数；及(c)同时扩 增WT1 mRNA和GAPDH mRNA时的WT1 RNA标准品和GAPDH  RNA标准品的荧光扩增曲线和扩增循环数。

图1表示(a)单独扩增WT1 mRNA时的、各种浓度的WT1 RNA 标准品的WT1 mRNA扩增曲线，图2表示(b)单独扩增GAPDH  mRNA时的、各种浓度的GAPDH RNA标准品的GAPDH mRNA扩 增曲线，图3表示(c)同时扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA时 的、各种浓度的WT1 RNA标准品的WT1 mRNA扩增曲线，图4表 示(d)同时扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA时的、各种浓度的 GAPDH RNA标准品的GAPDH mRNA扩增曲线。单独扩增WT1 mRNA时及同时扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA时的、各种浓度 的WT1 RNA标准品的WT1 mRNA扩增循环数示于表4。单独扩增 GAPDH mRNA时及同时扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA时的、 各种浓度的GAPDH RNA标准品的GAPDH mRNA扩增循环数示于 表5。

[表4]

WT1 mRNA的扩增循环数

[表5]

GAPDH mRNA的扩增循环数

单独扩增WT1 mRNA时的WT1 mRNA扩增曲线示于图1。如 图1所示，单独扩增WT1 mRNA时，在2.5×10⁵～2.5×10¹个拷贝/测 试的情况下均可检测到WT1 mRNA。如图3所示，同时扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA时，在2.5×10⁵～2.5×10¹个拷贝/测试的情况 下均可检测到WT1 mRNA。

另外，如表4所示，单独扩增WT1 mRNA时的扩增循环数(扩 增循环数为18.63～32.09)与同时扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA 时的扩增循环数(扩增循环数为18.67～31.94)之差小至-0.15～0.06， 因此单独扩增与同时扩增时的扩增循环数之间没有显著性差异。由 此可以认为，即使在同时扩增校正基因和作为目的基因的WT1 mRNA时，也可以与单独扩增目的基因(WT1 mRNA)的情况同样 地，以同等程度的扩增循环数检测到WT1 mRNA。

单独扩增GAPDH mRNA时的GAPDH mRNA扩增曲线示于图 2。如图2所示，单独扩增GAPDH mRNA时，在1.0×10⁸～1.0×10⁴个拷贝/测试的情况下均可检测到GAPDH mRNA。

如表5所示，单独扩增GAPDH mRNA时的扩增循环数 (10.18～23.68)与同时扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA时的扩增 循环数(10.30～23.85)之差为0.10～0.20，单独与同时扩增时的扩增 循环数的差异不大。由此可以认为，即使在同时扩增作为校正基因 的GAPDH mRNA和作为目的基因的WT1 mRNA时，也可以与单独 扩增校正基因(GAPDH mRNA)的情况同样地，以同等程度的扩增 循环数检测到GAPDH mRNA。

[实施例2]

使用提取自K562的RNA的稀释试验

在本实施例中，对一步式多重RT-PCR法(其对WT1 mRNA和 GAPDH mRNA同时进行扩增)和两步式RT-PCR法(其中，在不同 的容器中分别进行逆转录反应和PCR，分开对WT1 mRNA和GAPDH  mRNA进行扩增)的测定灵敏度进行了比较。需要说明的是，使用 WT1 mRNA测定试剂盒“Otsuka”(大塚制药株式会社)实施两步 式RT-PCR法。

(1)引物和探针的序列

利用一步式RT-PCR法的WT1 mRNA测定及GAPDH mRNA测 定中使用的引物及探针的序列示于表6。需要说明的是，两步式 RT-PCR法由于使用了WT1 mRNA测定试剂盒“Otsuka”，故引物 及探针不明。

[表6]

用于扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA的引物序列及探针序列(序列组A)

(2)标准品的制备

作为标准品(WT1 mRNA、GAPDH mRNA)，一步式RT-PCR 法中使用了通过与实施例1记载的方法相同的方法制备的RNA标准 品。将WT1 RNA标准品的浓度调整为2.5×10¹、2.5×10³、2.5×10⁵、 2.5×10⁷个拷贝/测试。将GAPDH RNA标准品的浓度调整为1.0×10³、 1.0×10⁵、1.0×10⁷、1.0×10⁹个拷贝/测试。两步式RT-PCR法中，使用 了WT1 mRNA测定试剂盒“Otsuka”中配备的标准品。

(3)被测试样

作为被测试样，使用了从WT1阳性白血病细胞株K562中提取 的RNA。具体而言，为了防止核酸非特异性地吸附于PCR管，使用 TE缓冲液(其中预先添加了作为载体RNA的大肠杆菌转运RNA(最 终浓度为50ng/μL))将从K562提取的总RNA稀释至最终浓度为 2、5、10pg/μL，由此得到被测试样。

(4)RT-PCR反应

一步式RT-PCR法反应通过与实施例1相同的方法进行。两步 式RT-PCR法使用WT1 mRNA测定试剂盒“Otsuka”(大塚制药株 式会社)，依照其所附说明书实施。针对各被测试样进行2次重复 测定。根据WT1 mRNA测定试剂盒“Otsuka”的所附说明书，以拷 贝数/μg RNA(其为每1μg总RNA的WT1 mRNA数)的形式算出 测定结果。

(5)结果

(5-1)使用提取自K562的RNA的稀释测定结果

将从K562提取的RNA作为被测试样、使用一步式RT-PCR法 和两步式RT-PCR法实施的稀释试验的结果示于表7。

[表7]

K562RNA测定结果

由表7可知，在一步式RT-PCR法中，即使从K562提取的RNA 被稀释至RNA浓度为2.5pg/μL，也能够对其进行测定；而与之相对， 在两步式RT-PCR法中，从K562提取的RNA被稀释至RNA浓度为 2.5pg/μL时，检测不到由PCR产生的扩增信号，为5pg/μL时，2 次重复测定的数据显示出17.2及1.95pg/μL的偏差，因此认为可作 为有效值测定的范围为10pg/μL以上。由上述结果可以判定，与两 步式RT-PCR法相比，一步式RT-PCR法的测定灵敏度更高。

[实施例3]

交叉反应性试验

本实施例中，将表8所示的组(序列组B)及表9所示的组分 别用作引物及探针，实施同时对WT1 mRNA和GAPDH mRNA进行 扩增的一步式RT-PCR法，评价交叉反应性。

[表8]

用于扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA的引物序列及探针序列

(序列组B)

^*：表示人WT1基因(NM_024426.4：序列号1)的区域。

^**：表示人GAPDH基因(NM_002046.3：序列号2)的区域。

[表9]

用于扩增WT1 mRNA和GAPDH mRNA的引物序列及探针序列

(比较组)

^*：表示人WT1基因(NM_024426.4：序列号1)的区域。

^**：表示人GAPDH基因(NM_002046.3：序列号2)的区域。

作为被测试样，使用了Human Genome DNA(Merck KGaA，达 姆施塔特，德国，产品编号：69237)250ng、50ng、10ng，及从 WT1阳性白血病细胞株K562(WT1K562)提取的总RNA 250ng。

一步式RT-PCR反应通过与实施例1相同的方法进行。进而， 在下述条件下，对将Human Genome DNA及WT1 K562 mRNA进行 PCR而得到的扩增产物实施琼脂糖凝胶电泳，从而对扩增产物进行 确认。琼脂糖凝胶电泳按照常规方法进行。

＜琼脂糖凝胶电泳的条件＞

电泳条件：15分钟，4％E-gal；

拍照条件：SYBR用滤光片，

利用E-gal装置直接拍照，

快门速度：1/15，

光圈：4.5；

应用条件：试样2.5μL+dH₂O 16.5μL

Marker 2.5μL+dH₂O 16.5μL

[结果]

已知Human Genomic DNA中不存在GAPDH基因，而是存在 GAPDH的伪基因(pseudogenes)。本实施例中，如图5(A)中的 泳道1～3所示，使用表8所示的引物序列及探针序列实施一步式 RT-PCR法时，通过电泳，没有在Human Genome DNA中观察到与 GAPDH一致的条带。即，可以确认根据使用本发明的引物及探针的 一步式RT-PCR法，能够明确地识别GAPDH和GAPDH的伪基因， 不会将GAPDH的伪基因误认为GAPDH。另一方面，如图5(B) 中的泳道1～3所示，使用表9所示的引物及探针序列实施一步式 RT-PCR法时，通过电泳观察到了与GAPDH一致的条带。即，使用 该引物及探针进行一步式RT-PCR法时，无法区分GAPDH和GAPDH 的伪基因。

另外，作为参考，表10、表11分别示出使用表8(实施例)及 表9(比较例)中的引物序列及探针序列实施一步式RT-PCR法时的 GAPDH的扩增循环数和WT1的扩增循环数。表中，“ND”表示检 测不到。

[表10]

GAPDH的扩增循环数

ND：检测不到

[表11]

WT1的扩增循环数

序列表自由文本

序列号3～12所示的碱基序列是指表3中记载的引物及探针。对 应关系详述于表3。序列号13所示的碱基序列是指表9中记载的引 物的碱基序列。该碱基序列相当于人GAPDH基因(NM_002046.3： 序列号2)的56～74区的碱基序列。