一种用于样本排查的DNA检验试剂及专用引物

摘要

本发明公开了一种用于样本排查的DNA检验试剂及专用引物。本发明提供了DNA检验引物组，由用于扩增如下21个Y-STR位点的引物对组、用于扩增性别位点Amelogenin的引物对和用于扩增常染色体STR位点的引物对组成。本发明的实验证明，本发明提供的DNA检测试剂，能够同时检验21个Y-STR位点和1个常染色体STR位点，且引物特异性高，可以得到完整的STR分型，并且峰型尖锐清晰，平衡性好，无Pull-up峰、stutter带，无非特异性人工产物出现，完全能够满足法医DNA大规模样本检验的要求。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于样本排查的DNA检验试剂及专用 引物。

背景技术

DNA检验技术尤其是（Short Tandem Repeats）STR检测技术自20世纪80年代中 期问世以来，在刑事、民事案件、大型灾难性事故（如：美国9·11恐怖袭击、印尼海 啸、汶川大地震）及群体性突发事件中均发挥了巨大的作用。短串联重复序列(STR)， 又称微卫星DNA(microsatellite DNA)，STR检测技术主要是通过对这些特异性STR位 点的多态性进行检测，在获得了多个相应STR位点的信息后，进行多位点信息的平行 比对，从而实现了个体识别和亲权鉴定。STR检测以其特有的技术优势，几十年来一 直是法医遗传学研究的热点和核心，并被广泛应用于法医学个体识别和亲子鉴定等多 个领域。欧盟法医DNA分型标准委员会认为，虽然新技术与新遗传标记不断涌现， 但在今后相当长的时期内，STR将仍然是最主要的人特异性遗传标记。

人类Y染色体在遗传过程中不与另外的染色体发生重组，且序列结构特征能稳定 地由父亲传给儿子并为男性所特有，具有父系遗传特点。大多数暴力案件和所有的强 奸案件中都有男性参与。因此，Y-STR在法庭科学中的作用逐渐显现。在没有父亲的 父权鉴定时，利用Y染色体STR基因座（Y-STR）的父系遗传特点，可以通过父系亲 属进行鉴定。在混合斑鉴定中，特别是无法用两步法分离的情况下，Y-STR更具优势。 在轮奸案件中，Y-STR对于确定案犯人数也有很大作用。此外，由于Y-STR具有父系 遗传的特点，不同种族、不同地区的群体，Y-STR的分布存在着差异性，对其分型可 以揭示嫌疑人的种族、居住地甚至是姓氏。

近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，越来越多的Y-STR被开发和利用。1997 年，Prinz等第一次建立了Y-STR复合扩增体系，命名为Quadruplex I，分别用两种荧 光JOE和FAM标记DYS19、DYS389I、DYS389II和DYS390，并做了法医学应用性 研究。美国ABI(Applied Biosystems)公司推出了Y-Filer试剂盒，包含DYS456、 DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS458、DYS19、DYS385、DYS393、DYS391、 DYS439、DYS635、DYS392、YGATA-H4、DYS437、DYS438、DYS448等17个Y-STR 位点。美国Promega公司也研发出包含DYS391、DYS389I、DYS439、DYS389II、 DYS438、DYS437、DYS19、DYS392、DYS393、DYS390、DYS385a/b等12个Y-STR 位点的PowerPlex Y试剂盒。这些Y-STR检验试剂盒在法医DNA检验领域发挥着越 来越大的作用。

随着微量Y染色体STR检验技术的发展，其应用范围有进一步扩大的趋势，如 Y-DNA数据库建设和大规模样本的快速排查。然而，当前现有的Y染色体DNA检测 试剂在应用过程中确遇到了新的问题。由于Y-STR具有父系遗传的特点，在正常情况 下，同一个家系的样本所获得的STR分型结果是完全相同的。这在大规模检验过程中 就存在两个主要问题，一是大量无法确定具有相同Y-STR分型的样本是否存在样本交 叉污染等现象；二是确定家系后，还需要重新对相应家系的全部样本进行常染色体STR 检验，以实现精确比对。这将极大增加检验人员的工作量，降低整体检验效率，增加 检验成本。

发明内容

本发明的一个目的是提供DNA检验引物组。

本发明提供的DNA检验引物组，包括用于扩增如下21个Y-STR位点的引物对组 和用于扩增常染色体STR位点的引物对；

所述用于扩增如下21个Y-STR位点的引物对组为如下：

用于扩增Y-STR位点DYS460的引物对，其由序列表中序列1所示的引物1和序 列表中序列2所示的引物2组成；

用于扩增Y-STR位点DYS458的引物对，其由序列表中序列3所示的引物3和序 列表中序列4所示的引物4组成；

用于扩增Y-STR位点DYS389I或Y-STR位点DYS389II的引物对，其由序列表 中序列5所示的引物5和序列表中序列6所示的引物6组成；

用于扩增Y-STR位点DYS438的引物对，其由序列表中序列7所示的引物7和序 列表中序列8所示的引物8组成；

用于扩增Y-STR位点DYS390的引物对，其由序列表中序列9所示的引物9和序 列表中序列10所示的引物10组成；

用于扩增Y-STR位点DYS392的引物对，其由序列表中序列11所示的引物11和 序列表中序列12所示的引物12组成；

用于扩增Y-STR位点DYS393的引物对，其由序列表中序列13所示的引物13和 序列表中序列14所示的引物14组成；

用于扩增Y-STR位点DYS437的引物对，其由序列表中序列15所示的引物15和 序列表中序列16所示的引物16组成；

用于扩增Y-STR位点DYS385a或用于扩增Y-STR位点DYS385b的引物对，其 由序列表中序列17所示的引物17和序列表中序列18所示的引物18组成；

用于扩增Y-STR位点YGATA_H4的引物对，其由序列表中序列19所示的引物 19和序列表中序列20所示的引物20组成；

用于扩增Y-STR位点DYS391的引物对，其由序列表中序列21所示的引物21和 序列表中序列22所示的引物22组成；

用于扩增Y-STR位点DYS447的引物对，其由序列表中序列23所示的引物23和 序列表中序列24所示的引物24组成；

用于扩增Y-STR位点DYS19的引物对，其由序列表中序列25所示的引物25和 序列表中序列26所示的引物26组成；

用于扩增Y-STR位点DYS448的引物对，其由序列表中序列27所示的引物27和 序列表中序列28所示的引物28组成；

用于扩增Y-STR位点DYS456的引物对，其由序列表中序列29所示的引物29和 序列表中序列30所示的引物30组成；

用于扩增Y-STR位点DYS635的引物对，其由序列表中序列31所示的引物31和 序列表中序列32所示的引物32组成；

用于扩增Y-STR位点DYS439的引物对，其由序列表中序列33所示的引物33和 序列表中序列34所示的引物34组成；

用于扩增Y-STR位点DYS527a或用于扩增Y-STR位点DYS527b的引物对，其 由序列表中序列35所示的引物35和序列表中序列36所示的引物36组成；

所述用于扩增常染色体STR位点D18S51的引物对，其由序列表中序列39所示 的引物39和序列表中序列40所示的引物40组成。

上述引物组还包括用于扩增性别位点Amelogenin的引物对；

用于扩增性别位点Amelogenin的引物对，其由序列表中序列37所示的引物37 和序列表中序列38所示的引物38组成；

所述引物组由用于扩增如下21个Y-STR位点的引物对组、用于扩增常染色体STR 位点的引物对和用于扩增性别位点Amelogenin的引物对组成。

上述的引物组中，所述引物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、 34、35、36、37、38、39、40的摩尔比为0.12:0.12:0.2:0.2：0.65:0.65:0.45:0.45： 0.25:0.25:0.6:0.6:0.15:0.15:0.2:0.2:0.35:0.35:0.4:0.4:0.25:0.25:0.45:0.45:0.2:0.2:0.25:0.25:0 .4:0.4:0.45：0.45：0.60:0.60:0.80:0.80:0.12:0.12:0.25:0.25。

上述各个引物对中的各条引物均独立包装。

上述引物的摩尔比为使用时的摩尔比。

上述的引物组中，各个所述引物对中的一条引物均用荧光标记；

所述用于扩增Y-STR位点DYS460的引物1的5’末端、用于扩增Y-STR位点 DYS458的引物3的5’末端、用于扩增Y-STR位点DYS389I或Y-STR位点DYS389II 的引物5的5’末端、用于扩增DYS438的引物7的5’末端、用于扩增DYS390的引物 9的5’末端和用于扩增DYS392的引物11的5’末端均用FAM标记；

所述用于扩增DYS393的引物13的5’末端、所述用于扩增DYS437的引物15的5’ 末端、所述用于扩增Y-STR位点DYS385a或用于扩增Y-STR位点DYS385b的引物 17的5’末端、所述用于扩增YGATA_H4的引物19的5’末端均用HEX标记。

所述用于扩增Amelogenin的引物37的5’末端、所述用于扩增DYS391的引物21 的5’末端、所述用于扩增DYS447的引物23的5’末端、所述用于扩增DYS19的引物 25的5’末端、所述用于扩增DYS448的引物27的5’末端均用TAMRA标记；

所述用于扩增DYS456的引物29的5’末端、所述用于扩增DYS635的引物31的5’ 末端、所述用于扩增DYS439的引物33的5’末端、所述用于扩增Y-STR位点DYS527a 或用于扩增Y-STR位点DYS527b的引物35的5’末端、所述用于扩增D18S51的引物 39的5’末端均用ROX标记。

上述引物组的各条引物为独立包装。

本发明的另一个目的是提供一种DNA检验试剂。

本发明提供的DNA检测试剂，由上述的引物组、dNTP、MgCl₂、BSA、DNA聚 合酶和水组成。

上述DNA检测试剂中，所述用于扩增DYS460的引物对中的各条引物在所述试 剂中的终浓度均为0.12μM；

用于扩增DYS458的的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.20μM；

用于扩增DYS389I或DYS389II的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均 为0.65μM；

用于扩增DYS438的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.45μM；

用于扩增DYS390的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.25μM；

用于扩增DYS392的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.60μM；

用于扩增DYS393的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.15μM；

用于扩增DYS437的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.2μM；

用于扩增DYS385a或用于扩增DYS385b的引物对中的各条引物在所述试剂中的 终浓度均为0.35μM；

用于扩增YGATA_H4的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.4μM；

用于扩增DYS391的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.25μM

用于扩增DYS447的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.45μM；

用于扩增DYS19的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.2μM；

用于扩增DYS448的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.25μM；

用于扩增DYS456的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.4μM；

用于扩增DYS635的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.45μM；

用于扩增DYS439的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均为0.6μM；

用于扩增DYS527a或用于扩增DYS527b的引物对中的各条引物在所述试剂中的 终浓度均为0.8μM；

用于扩增性别位点Amelogenin的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓度均 为0.12μM；

用于扩增常染色体STR位点D18S51的引物对中的各条引物在所述试剂中的终浓 度均为0.25μM。

本发明的第三个目的是提供一种DNA检验试剂盒。

本发明提供的DNA检测试剂盒，包括上述的引物组或上述试剂。

上述的引物组或上述试剂在制备用于检测样本或样本排查的产品中的应用也是本 发明保护的范围。

上述应用中，所述样本为离体血液或者血液采集卡。

本发明的实验证明，本发明针对21个Y-STR位点、1个性别位点Amelogenin和 1个常染色体STR位点，设计40条引物，由这些引物、PCR缓冲液和DNA酶组成 DNA检测试剂，能够同时检验21个Y-STR位点、1个性别位点和1个常染色体STR 位点，且引物特异性高，可以得到完整的STR分型，并且峰型尖锐清晰，平衡性好， 无Pull-up峰、stutter带，无非特异性人工产物出现，完全能够满足法医DNA大规模 样本检验的要求。因此，可以将其用于大规模样本Y-STR检验过程中，高多态性的常 染色体的STR位点能够起到标记和区分同一家系不同个体样本的作用，能够实现样本 的迅速排查和区分。提高排查效率，节约检验成本，节省检验时间。

附图说明

图1为DNA检测试剂的STR位点排布图

图2为用于大规模样本排查的DNA检验试剂进行检测样本

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、用于大规模样本排查的DNA检验试剂的制备

1、用于大规模样本排查的DNA检验的位点的确定

由于Y-STR具有父系遗传的特点，在正常情况下，同一个家系的样本所获得的 STR分型结果是完全相同的。这在大规模检验过程中就存在两个主要问题，一是大量 无法确定具有相同Y-STR分型的样本是否存在样本交叉污染等现象；二是确定家系后， 还需要重新对相应家系的全部样本进行常染色体STR检验，以实现精确比对。

因此，确定用于大规模样本排查的DNA检验的位点如下23个：21个Y-STR位 点、1个性别位点Amelogenin、1个常染色体STR位点D18S51。

上述21个Y-STR位点分别为DYS460、DYS458、DYS389I、DYS438、DYS389II、 DYS390、DYS392、DYS393、DYS437、DYS385a/b、YGATA_H4、DYS391、DYS447、 DYS19、DYS448、DYS456、DYS635、DYS439、DYS527a/b；

上述性别位点Amelogenin，能直接区分待检样本为女性样本还是阴性样本；

上述常染色体STR位点D18S51，能够在一定程度上辅助区分同一家系的不同个 体样本。

其STR位点的排布方式如下图1所示。

2、用于大规模样本排查的DNA检验的位点专用扩增引物

根据上述位点设计复合扩增引物，序列如表1所示。

表1复合扩增引物序列

扩增引物分别用FAM，HEX，TAMRA，ROX四种荧光素标记。

其中DYS460、DYS458、DYS389I、DYS438、DYS389II、DYS390、DYS392的 扩增引物用FAM标记。

其中DYS393、DYS437、DYS385a/b、YGATA_H4的扩增引物用HEX标记。

其中Amelogenin、DYS391、DYS447、DYS19、DYS448的扩增引物用TAMRA 标记。

其中DYS456、DYS635、DYS439、DYS527a/b、D18S51的扩增引物用ROX标记。

FAM，HEX，TAMRA，ROX四种荧光素分别标记在正向扩增引物的5’端。

3、用于大规模样本排查的DNA检验试剂的制备

用于大规模样本排查的DNA检验试剂即为PCR扩增体系，具体如下，下面的终 浓度为在扩增体系中的终浓度：

2×PrimerMix为将表1所示的40条引物按照表1所示使用的浓度进行混匀。

每10μL的PCR扩增体系如下：2μL5×PCR缓冲液（各物质的在DNA检验试剂 中的终浓度如表2所示）、5μL2×PrimerMix（各条引物在DNA检验试剂中的终浓度如 表1所示）、0.2μL5U/μL的FastSTAR DNA聚合酶（Roche公司，货号：12032902001）， 其余用水补足体积。

表2为5×PCR缓冲液的组分

PCR Buffer成分 终浓度 Tris-HCl 50mM dNTP 1mM each

MgCl₂8mM BSA 2mg/mL KCl 250mM

PCR扩增体系即为用于大规模样本排查的DNA检验试剂。

因此，DNA检验试剂由具有表1所示终浓度的引物、终浓度为200μM dNTP、终 浓度为1.6mM的MgCl₂、终浓度为400μg/mL的BSA、终浓度为1U/μL DNA聚合酶 和水组成。

实施例2、用于大规模样本排查的DNA检验试剂的应用

1、样本制备

样本为公安部物证鉴定中心日常DNA数据库建设所积累。样本均为纸质类型， 为血液采集卡。

将血液采集卡（已知为男性）用0.5mm手持式打孔器打下一片圆片（不超过 1.2mm），置于0.2mL薄壁管中。

2、样本扩增

将10ul由实施例1制备的DNA检验试剂加入上述装有血液采集卡的薄壁管中， 进行PCR扩增。

PCR扩增程序为：95℃，11min；94℃，30s，59℃，2min，72℃，1min，28个 循环；60℃，1h，25℃，forever。

3、PCR产物检测

取上述扩增产物1μL加入10μL Hi-Di甲酰胺（ABI公司），置于ABI3130xl遗传 分析仪内进行毛细管电泳检测，具体操作步骤参照产品说明书。

采用GeneMapper ID v3.2软件进行数据分析，其检测结果如下图2所示，上述样 本（男性）得到了完整的STR分型，并且峰型尖锐清晰，平衡性好，无Pull-up峰、 stutter带，无非特异性人工产物出现。完全能够满足法医DNA大规模样本检验的要求。

因此，可以用本发明的DNA检测试剂可以用于大规模样本Y-STR检验过程中， 高多态性的常染色体的STR位点能够起到标记和区分同一家系不同个体样本的作用， 能够实现样本的迅速排查和区分。提高排查效率，节约检验成本，节省检验时间。