一种可降解环境内分泌干扰物双酚A假单胞杆菌及其应用

摘要

本发明涉及一种可降解环境内分泌干扰物双酚A假单胞杆菌及其应用，属于微生物技术领域。所述假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A，于2014年3月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.8942；所述假单胞杆菌Hu109A应用于微生物降解环境内分泌干扰物双酚A，包含以下步骤：将含有双酚A的无机盐培养基pH值调至9.0，然后将OD600值0.4~0.5的假单胞杆菌Hu109A按体积百分比10-40%的接种量添加，在25-37℃摇床中进行反应。本发明的假单胞杆菌Hu109A能高效降解双酚A，降解率可达90~100%；相对于物理化学法成本低，且无二次污染。

说明书

技术领域

    本发明涉及一种可降解环境内分泌干扰物双酚A假单胞杆菌及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

双酚A（Bisphenol A,BPA）是目前已知的一种雌激素活性的环境内分泌干扰物质。作为世界上使用最广泛的工业化合物之一，双酚A主要用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂等多种高分子材料，也可用于生产增塑剂、阻燃剂、抗氧剂等精细化工产品。但研究表明，双酚A是一种对水生动物、哺乳动物、两栖动物都具有环境荷尔蒙效应的内分泌干扰物，即使在很低剂量下也能使动物产生雌性早熟、精子量下降、前列腺增长等作用，还具有一定的胚胎毒性和致畸性，可明显增加动物卵巢癌、前列腺癌、白血病等癌症的发生。由于双酚A在生活中使用广泛，成为人们经常能接触到的物质，其安全性问题成为了公众关注的焦点，其生产应用也存在很大争议。很多国家已经将双酚A列入有毒物质列表中，并限制了双酚的生产和使用。因此，对环境中双酚A的高效降解是控制此污染物造成的环境危害的有效途径之一。

目前，很多方法和技术已经应用于双酚A的降解，包括物理法、化学法和生物法。通过吸附剂消除双酚A是目前物理法中应用最广泛的方法之一，常用的吸附剂有β-环糊精壳聚糖聚合物、活性炭、FeCl3等；化学法普遍采用氧化剂将双酚A氧化降解，常用的有光催化氧化法、溶胶-凝胶法、电化氧化法等；生物法降解双酚A，就是利用从自然界筛选得到的或人工改造的可代谢双酚A的微生物对其进行降解。与物理化学方法相比，生物降解由于其低成本，反应条件温和，作用范围广及持续时间长等特点被广泛应用于各种有害有机物的降解。目前，国内外有很多研究者分别从土壤、活性污泥、河水和河底沉积物中分离得到双酚A降解菌，袁理等（袁理，曾光明，张长，余健，徐建明. 双酚A降解菌的分离鉴定及其降解特性. 环境科学. 2006，27（10）：2095-2098.）从好氧反应堆反应器的渗滤液中分离到一株降解内分泌干扰物双酚A的细菌B-16，经鉴定该菌株为无色菌属，该菌株在双酚A的初始浓度为10mg/L时降解率达到最大值46.93%；蒋俊等（蒋俊，李秀艳，赵雅萍. 2株分别降解壬基酚和双酚A细菌的分离、鉴定和降解特性. 环境科学研究，2010,23（9）：1196-1203.）从污水处理厂氧化沟的活性污泥中驯化分离了一株可降解双酚A的芽孢杆菌B2，该菌株在最优条件下双酚A去除率为78.68%。虽然这两株细菌(Achromobacter sp. B-16、Bacillus sp. B-2）可在一定程度上降解双酚A，但降解率还达不到的应用的要求。而Kang等（Kang J H, Kondo F. Bisphenol A degradation by bacteria isolated from river water. Arch Environ Contam Toxicol, 2002,43:265-269.）从水体中分离了两株假单胞杆菌，其对双酚A的降解率可达90%。贾凌志等（贾凌志，李君文. 双酚A降解菌的分离鉴定及降解基因的定位. 环境科学与技术， 2006，29（6）：40-42.

）也从土壤中分离到一株降解双酚A假单胞杆菌W2。可见假单胞杆菌属具有高效降解双酚A的一类微生物。白蚁作为自然界中可高效降解木质纤维素的昆虫，其后肠中寄居着大量共生微生物，Harazono等（Harazono K, Yamashita N, Shinzato N, Watanabe Y, Fukatsu T, Kurane R. Isolation and Chracterization of Aromatics-degrading Microorganisms from the Gut of the Lower Termite Coptotermes formosanus. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2003, 67(4): 889-892.）和Ke等（Ke J, Singh D, Chen SL. Aromatic compound degradation by the wood-feeding termite Coptotermes formosanus(Shiraki). International Biodeterioration & Biodegradation , 2011, 65(6):744-756.）均从台湾乳白蚁内筛选出可降解芳香族化合物的菌株。

因此，本发明双酚A为底物，从黄胸散白蚁中筛选出一株可高效降解双酚A的假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A，这是首次从白蚁体内筛选出可降解双酚A菌种的报道。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A。

本发明的另一目的在于提供所述假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A在环保领域中的应用，特别是在微生物降解环境内分泌干扰物双酚A的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种假单胞菌（Pseudomonas sp.）Hu109A，于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 8942。

所述假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A具有以下的形态和生理生化特性：

A、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和扫描电镜观察，为革兰氏阴性杆状细菌；

B、主要的生理生化特征兼性厌氧，具有运动性，接触酶、氧化酶阳性，水解明胶和淀粉，吲哚试验阴性。

所述假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A的16S rRNA序列如SEQ ID：No. 1所示。

所述假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A在环保领域中的应用，特别优选所述假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A应用于微生物降解环境内分泌干扰物双酚A。

所述假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A应用于微生物降解双酚A优选包含以下步骤：

将含有双酚A的无机盐培养基pH值调至9.0，然后将OD600值0.4~0.5（对数增长期）的假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A按体积百分比10-40%的接种量添加，在25-37℃ 摇床中进行反应。

所述无机盐培养基中双酚A的含量为20-100mg/L；

所述反应为振荡反应条件，震荡速度为150-220rpm；

所述反应的时间为72-108h。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

（1）本发明首次从黄胸散白蚁肠道内筛选到具有可降解矿化双酚A的假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A；

（2）本发明的假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A能高效降解双酚A，降解率可达90~100%。

（3）本发明的假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A降解双酚A相对于物理化学法成本低，且无二次污染。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

本发明所述的可降解双酚A的假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A从黄胸散白蚁肠道内分离、纯化而得。

其分离方法如下所用的驯化培养基为无机盐培养基（g/L）：Na₂HPO₄  6.2，KH₂PO₄  3.0，NaCl  0.5，NH₄Cl  1.0，pH 9.0。首先抽取20头黄胸散白蚁肠道，用匀浆器充分研磨，然后将匀浆液以体积百分比10%接入5mL含20mg/L双酚A ，pH 9.0的无机盐培养液中，30℃驯化3天后，待无机盐培养基中出现浑浊后，再将浑浊的无机盐培养液以体积百分比10%接种量接入含双酚A 40mg/L的无机盐培养基接着驯化3天，依次类推逐步提高双酚A的浓度进行驯化，双酚A的浓度分别为60mg/L、80mg/L、100mg/L。驯化结束后将驯化液涂布于相应pH的LB琼脂平板（10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母粉，10.0 g NaCl ，15.0 g琼脂粉, g/L）上30℃培养48h，挑选单菌落于牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏 3.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂粉 20.0g/L，pH9）进行富集培养，然后测定降解率，选择降解率最高的菌种进行纯化。

降解率的测定：将单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的菌液（OD600为0.4~0.5）以体积百分比10%的接种量接入双酚A浓度为20mg/L， pH 9.0的无机盐培养基中，在30℃ 150rpm摇床中培养96h，定时取样测定环境内分泌干扰物的降解率。降解率=（初始浓度-终浓度）/ 初始浓度。高效液相色谱测定方法如下，将培养96h的空白和样品8000×g离心10min，将离心后的上清液用0.45um的针筒式滤膜过滤后注入进样口进行测定，分析柱为C₁₈ 5um（4.6×250mm），流动相为乙腈：水（60:40，v/v），流速为1ml/min，柱温40℃，采用紫外检测器进行检测， 检测波长为276nm。

将纯化得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：

（1）菌体的形态特性：

A、采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，为革兰氏阴性杆状细菌，周生鞭毛；

B、主要的生理生化特征兼性厌氧，具有运动性，接触酶、氧化酶阳性，水解明胶和淀粉，吲哚试验阴性。

（2）采用DNA提取方法提取细菌总DNA。采用细菌的16S rRNA通用引物F27（5^，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3^，），下游引物R534（5^，-ATTACCGCGGCTGCTGGC- 3^，）扩增其16S rRNA基因。PCR扩增体系总体积为50 μL，无菌超纯水 37.5μL，10×PCR Buffer 5μL，MgCl₂ 3μL，dNTP Mixture 1μL，上游引物 1μL，下游引物 1μL，Takara Taq 0.5μL，DNA模板 1μL。PCR反应反应29个循环，94.0℃变性。PCR产物直接测序，结果如下（SEQ ID No. 1）TCTGGGCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAGCGGATGACGGGAGCTTGCTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTCCGAAAGGAGCGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCACC 

上述PCR产物直接测序的16S rRNA基因序列已提交至NCBI数据库，登录号为KJ499805。将测出的16S rRNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对后用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树，置信度可达98%，可知该菌株与Pseudomonas菌属在同一分支。根据16S rRNA同源性分析可以判断该菌种为假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.）。

综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列测定结果，本发明所筛选的细菌应归属假单胞杆菌属（Pseudomonas sp.），命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）Hu109A，于2014年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8942。

实施例2：

将假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的菌液（OD600为0.4~0.5）以体积百分比10%的接种量接入双酚A浓度为40mg/L，pH值为9.0的无机盐培养基中，在25℃ 150rpm培养72h，降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为92%。

实施例3:

将假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的菌液（OD600为0.4~0.5）以体积百分比20%的接种量接入双酚A浓度为60mg/L、pH值为9.0的无机盐培养基中，在30℃，150rpm的摇床反应96h，降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为96%。

实施例4：

将假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的菌液（OD600为0.4~0.5）以体积百分比30%的接种量接入双酚A浓度为80mg/L、pH值为9.0的无机盐培养基中，在30℃、200rpm的摇床反应108h，降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为98%。

实施例5：

将假单胞杆菌（Pseudomonas sp.）Hu109A单菌落接种于3mL牛肉膏蛋白胨培养基中，培养18h的菌液（OD600为0.4~0.5）以体积比40%的接种量接入双酚A浓度为100mg/L、pH值为9.0的无机盐培养基中，在37℃、220rpm的摇床反应108h，降解率的测定同实施例1，检测结果为降解率为98%。

上述实施例为本发明的较佳实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未违背本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏大学

 

<120>  一种可降解环境内分泌干扰物双酚A假单胞杆菌及其应用

 

<130>  一种可降解环境内分泌干扰物双酚A假单胞杆菌及其应用

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  483

<212>  DNA

<213>  黄胸散白蚁

 

<400>  1

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