针对草本植物防病、促生、抗逆的丛枝菌根真菌GZ176及其菌剂和应用

摘要

本发明公开了针对草本植物防病、促生、抗逆的丛枝菌根真菌GZ176及其菌剂和应用。丛枝菌根真菌GZ176为根内球囊霉(Rhizophagus intraradices)，该菌制成浓度40-60个孢子/g以上的粉剂，在温室正常管理条件下丛枝菌根真菌GZ176粉剂拌种处理后对草本植物病害生防效果达到71.3％,且对草本植物的促生效果达16.19％以上；在田间，对病害防效高达75.27％，增产效果超过36.17％；且能够显著提高草本植物的抗逆性。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护领域，涉及针对草本植物防病、促生、抗逆的丛枝菌根真菌GZ176及 其菌剂和应用。

背景技术

中国是农业大国,我国草本植物(包括水稻、小麦、番茄、辣椒、茄、烟草、黄瓜、西瓜、 甜瓜、芹菜等农作物，菊花、草坪草等园艺花卉，以及三七等中药材等)生产总面积已超过 22亿亩,为世界农业发展做出了巨大贡献。但是，我国亦是病虫害多发、频发和重发大国，病 虫害与水灾、旱灾并称为我国三大自然灾害。我国常见病虫害有1000种以上，常年可造成严 重危害的重大病虫害近100种，每年发生面积超过70亿亩次，每种作物经常同时遭受3-4种 病虫危害。联合国粮农组织估计，我国每年病虫害引起的农作物损失达700亿-900亿元，其中 病害占33％，作物病害正日趋成为限制我国农林业生产可持续发展的重要因素。

草本植物病害主要包土传病害以及地上部病害。植物土传病害通常引起植物根部乃至全株 性的病症,其发生和流行通常属于积年流行病害，如引发纹枯、枯萎、黄萎、立枯、猝倒、根 腐、青枯、软腐、根结线虫、胞囊线虫、根肿等病害。地上部病害主要危害叶片、茎干、果实 等地上部位，主要是借助气流和人们的农事活动从温室外面传入外，如霜霉病、炭疽病、锈病、 灰霉病等。这些病害病原物都有寄主范围广、抗逆性强、难以根除等特点。

不良环境包括干旱、洪涝、高温、寒冷等恶劣天气，均会对草本作物的生长产生不良影响。 20世纪90年代，中国平均每年受旱面积为2733万hm²，粮食因旱减产量与总产量之比达到 了4.7％。而且每年因涝渍灾害损失粮食62.3亿kg,年均经济损失46.7亿元。高温、寒冷等天 气亦会对作物生产造成严重损害。增加草本作物抵抗外界不良环境能力受到了国内外研究者的 高度重视，目前有效的方法非常少。

利用土壤有益微生物来控制病害的发生以及诱导草本作物抗逆能力是近些年来研究的热 点，尤其这些微生物对环境无污染，引起了科学家们利用生物防治手段控制病害的兴趣。丛枝 菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，以下简称AM真菌)能和大多数陆生植物的根系形成 共生关系，它对生态环境有着非常重要的作用。它可以不同方式或途径影响植物的许多代谢过 程，增加植物根长，改变植物根系形态建成，促进根系对水份和营养元素的吸收，AM真菌可 以提高草本植物的抗病能力，抵抗病原菌的侵染，以及抗逆能力，增强植物应对寒冷、盐分、 干旱等环境的胁迫。

CN103155815公开了一种提高烟草青枯病抗性的方法，包括将蜜色无梗囊霉 (Acaulosporamellea)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根内球囊霉(Glomusintraradices)单独 扩繁，；扩繁后的蜜色无梗囊霉(Acaulosporamellea)、摩西球囊霉(Glomusmosseae)、根内球 囊霉(Glomusintraradices)四种丛枝菌根真菌按照0.5-1:1:1，重量比混合制备混合丛枝菌根真 菌菌剂侵染烟草，该菌剂能促进烟草生长，有效降低烟草的土传病害的发病率和病情指数，从 而提高了烟草对病害的抗性。但是该专利利用了四种不同的丛枝菌根真菌联合作用，而细菌之 间可能存在协同作用，本领域技术人员无法预料使用其中一种丛枝菌根真菌是否依然能够起到 促生和防病功效。且不同来源的菌株可能具有不同的生理生化特性及生物功能，不同的植物即 便使用相同的菌剂也可能产生不同的功效。究竟哪一株丛枝菌根真菌能够对草本植物的土传病 害以及地上病害产生理想的生防效果，以及提高草本植物的抗逆性，目前尚未见相关的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种绿色环保的能提高草本植物防病、促生、 抗逆的丛枝菌根真菌GZ176。

本发明的另一目的是提供该丛枝菌根真菌GZ176的粉剂

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

针对草本植物防病、促生、抗逆的丛枝菌根真菌GZ176，该菌株分类命名为根内球囊霉 (Rhizophagus intraradices)，于2014年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10056。

本发明所述的丛枝菌根真菌在制备草本植物防病、促生、抗逆的制剂中的应用；优选在 制备防治农作物、园艺花卉、中药材草本植物的土传病害和地上部病害，促进其生长，提高其 品质和/或抗逆性的制剂中的应用；其中所述的农作物草本植物优选水稻、小麦、茄科、葫芦 科、叶菜类蔬菜中的任意一种，所述的园艺花卉草本植物优选菊科等；所述的中药材草本植物 优选栝楼、半夏等；所述的抗逆性优选抗旱性。

用本发明所述的针对草本植物防病、促生、抗逆的丛枝菌根真菌GZ176制备的菌剂。

所述的的菌剂优选通过以下方法制备得到：

1)将含所述的浓度为40-60个孢子/g的菌根真菌GZ176孢子的土按1:80-120的体积比与 培养基质均匀混合，基质配方：泥炭土与经过至少2h热气蒸过的粗砂1:0.5-3的体积比混合；

2)将混合好含孢子的基质装入灭菌的塑料盆，并种上寄主植物，保证孢子能很充分的跟 高粱接触到；4个月后，将盆钵内的土壤和寄主植物根系一块取出，烘干,粉碎，保持干燥,制 得含菌根真菌孢子的土壤,备用；所述的寄主植物优选高粱或三叶草；

3)将步骤2)制得的含菌根真菌孢子的土壤与高岭土混合，烘干后粉碎，再次烘干至含 水量为3％，最终过200目筛，制成浓度为40-60个孢子/g的粉剂。

所述的的菌剂进一步优选通过以下方法制备得到：

1)将含权利要求1所述的菌根真菌GZ176孢子的土按1:80-120的体积比与培养基质均 匀混合，基质配方：泥炭土与经过至少2h热气蒸过的粗砂1:0.5-3混合；

2)将混合好含孢子的基质装入灭菌的塑料盆，塑料盆直径40cm，体积0.05m³，每个盆 钵种上50-60颗高粱种子，保证孢子能很充分的跟高粱接触到；4个月后，将盆钵内的土壤和 高粱根系一块取出，烘干,粉碎至800目，保持干燥,制得含菌根真菌孢子的土壤,备用；

3)制备：将步骤2)制得的含菌根真菌孢子的土壤与高岭土混合，烘干后粉碎至200目， 再次烘干至含水量为3％，最终过200目筛，制成浓度为40-60个孢子/g的粉剂。

本发明所述的菌剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)将含所述的浓度为40-60个孢子/g的菌根真菌GZ176孢子的土按1:80-120的体积比与 培养基质均匀混合，基质配方：泥炭土与经过至少2h热气蒸过的粗砂1:0.5-3的体积比混合；

2)将混合好含孢子的基质装入灭菌的塑料盆，并种上寄主植物，保证孢子能很充分的跟 高粱接触到；4个月后，将盆钵内的土壤和寄主植物根系一块取出，烘干,粉碎，保持干燥,制 得含菌根真菌孢子的土壤,备用；所述的寄主植物优选高粱或三叶草；

3)将步骤2)制得的含菌根真菌孢子的土壤与高岭土混合，烘干后粉碎，再次烘干至含 水量为3％，最终过200目筛，制成浓度为40-60个孢子/g的粉剂。

本发明所述的丛枝菌根真菌在草本植物防病、促生、抗逆中的应用；优选在防治农作物、 园艺花卉、中药材草本植物的土传病害和地上部病害，促进其生长，提高其品质和/或抗逆性 中的应用；其中所述的农作物草本植物优选水稻、小麦、茄科、葫芦科、叶菜类蔬菜中的任意 一种，所述的园艺花卉草本植物优选菊科等；所述的中药材草本植物优选栝楼、半夏；所述的 抗逆性优选抗旱、抗寒、耐热、耐涝、抵抗不良气候；不良气候优选倒春寒。

所述的菌剂优选通过拌基质处理进行应用。

有益效果

本发明利用对环境无毒害的微生物菌剂防治草本植物土传病害以及地上部病害，提供了 一种绿色环保的丛枝菌根真菌GZ176粉剂或液体制剂，能够防治水稻、小麦、茄科、葫芦科、 叶菜类蔬菜中等农作物，菊花等园艺花卉，以及栝楼、半夏等所有草本植物的土传病害和地上 部病害，促进上述各类作物的生长并提高品质和提高其抗逆性(包括抗旱、抗寒、耐热、耐涝 等，抵抗倒春寒等不良气候)；解决了化学药剂等其它方法效果不佳或者有残留等问题，保护 环境，促进农业可持续发展。

该制剂对丛枝菌根真菌GZ176粉剂拌土处理后对病害生防效果高达到71.3％，作用十分 明显；且对植物的株高以及根长有明显地提高，对植株具有一定的促生作用，经GZ176处理 的草本植物与对照组相比，增产超17.75％。该菌根真菌GZ176粉剂，可室温保存6个月-1年。 AM真菌制剂处理的田间促生试验结果表明，防效高达75.27％，直接挽救农户每亩经济损失 近20000元。

附图说明

图1、GZ176粉剂处理对草本作物病害的生防效果

图2、GZ176粉剂处理对草本作物生物量的影响

图3、GZ176粉剂处理对草本作物抗逆性的影响

生物保藏信息

GZ176，为根内球囊霉(Rhizophagus intraradices)。于2014年11月25日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10056,地址：北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所。

具体实施方式

实施例1

一种提高对草本作物病害生物防治效果以及促生、抗逆的丛枝菌根真菌GZ176粉剂,含 微生物成分：丛枝菌根真菌GZ176(保藏号为CGMCC NO.10056)。由贵州省烟草根围土壤 中分离得到。

AM菌根真菌GZ176的分离、鉴定方法:用湿筛倾注-蔗糖离心法分离AM真菌孢子，称 取100g土样于离心管中，加水至离心管2/3处，3000rpm离心3min中后去掉上清液，加入 45％-50％的蔗糖溶液，搅匀后迅速1500rpm离心1.5min，过400目筛，并用水轻轻冲洗筛子 上面的孢子和孢子果，用生理盐水收集于培养皿中，在显微镜下统计孢子数目并观察孢子形态。

GZ176形态学特征：孢子壁多为3-4层，外层无色透明，1-2μm，易与内壁分离。内有2-3 层淡黄色壁，各1-1.5μm。仅连点处连抱菌丝壁多层，与抱壁相连，抱壁在进入连点时形成火 焰状喇叭形。在Melzer试剂中抱子深红色，在棉蓝试剂中外层易染成蓝色，内层浅蓝色，着 色稍慢。抱子大多在根内，有时根外也有。根外抱子与根内的形态一致，但稍大。幼龄抱子透 明，2层壁等厚，约1μm，老龄者外层透明，内层黄褐色。经形态学鉴定为根内球囊霉(Rhizophagus  intraradices)，送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号为 CGMCC NO.10056。

实施例2

AM真菌GZ176粉剂的制备方法如下：

1)将以前扩繁的含有丛枝菌根真菌GZ176的土壤按1:100的体积比例与培养基质均匀混 合，基质配方：泥炭土与经过至少2h热气蒸过的粗砂1:1混合；

2)将混合好含孢子的基质装入灭菌后地盆钵(直径15cm)，并种上高粱，每个盆钵50-60 颗种子，保证孢子能很充分的跟高粱接触到。4个月后，将盆钵内的土壤和高粱根系一块取出， 烘干,粉碎至800目，保持干燥,制得含菌根真菌孢子的土壤,备用；

3)制剂：根据步骤2)中的菌根真菌孢子的土壤与高岭土混合，烘干后粉碎，过300目 筛，再次烘干至含水量为3％，最终制成浓度为50个左右孢子/g的粉剂。

实施例3温室防病试验

方法：将参试番茄种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。

播种前，每个盆钵中装混匀后的200g灭菌土壤以及10g GZ176粉剂(实施例2制备)， 以保证正常接种。每个营养钵播种10粒种子，正常浇水管理4周后，将菌根苗移栽至330ml 塑料杯中，移栽时选择长势一致的植株开展实验。每组处理24株苗，随机放置，共重复三次。

移栽3d后接种青枯病原菌ZJ3721(从浙江发生青枯病的番茄植株上分离得到，并保存)。 平板活化青枯菌ZJ3721，500ml YGPA培养液中过夜摇菌(200rpm/min，20-24h，30℃)。 随后使用0.85％Nacl溶液将菌液浓度调至1×107CFU/mL进行灌根处理，每株番茄苗浇取20ml 的青枯菌液。之后每天调查发病情况，按青枯病分级指标，进行病情指数统计，对温室实验结 果进行调查。接种后每天调查发病情况，按青枯病情分级指标，每株按小叶进行病情指数统计， 对温室试验进行调查。

按照Kempe(1983)(Kempe,J.,and Sequeira,L.1983.Biological control of baterial wilt of  potatoes:Attempts to induce resistance by treating tubes with bacteria.Plant Disease,67(5): 499-501.)提出的病级标准记录病级数，病情分级：

0级：无症状；

1级：1-25％叶片出现萎蔫症状；

2级：全株26％-50％的叶片出现萎蔫症状；

3级：全株51％一75％的叶片出现萎蔫；

4级：全株76％-100％的叶片出现萎蔫症状。

防效(％)＝[(对照病害严重度一处理病害严重度)/对照病害严重度]×100％

病害严重度＝[∑(各病级株数×各病情指数)/(调查总株数×青枯最高病情指数)]×100

实验结果如表1，在温室栽培中AM真菌对番茄青枯病的防治效果达到71.3％以上。

表1GZ176粉剂处理对番茄青枯病的生防效果

实施例4GZ176粉剂处理的温室促生试验

方法：将参试番茄、黄瓜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。每 个营养钵播种10粒种子。正常浇水管理4周后，将菌根苗移栽至330ml塑料杯中，每个塑料 杯中装混匀后的200g灭菌土壤以及10g GZ176粉剂(实施例2制备)，以保证正常接种。移栽 时选择长势一致的植株开展实验，每组处理48株苗，随机放置，共重复三次。30d后测定番 茄、黄瓜植株生物量。

将参试水稻、小麦、空心菜种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。 每个盆钵(直径9cm，高13cm)中装混匀后的200g灭菌土壤以及10g GZ176粉剂(实施例2 制备)，以保证正常接种。每个营养钵播种4粒种子，每组处理48株苗，随机放置，共重复 三次。以不加GZ176粉剂处理作为对照。接种30d后测定水稻、小麦、空心菜植株生物量。

将参试的菊花从宿根(老根)萌发的新枝上剪取长12cm的嫩梢作为插条，从节基部削平， 切去基部的两片大叶，再将上部的叶子修去一半(减少水分蒸发，防止插条萎蔫)即可扦插至盆 钵中(直径9cm，高13cm)。每个盆钵中装混匀后的200g灭菌土壤以及10g GZ176粉剂(实 施例2制备)，以保证正常接种。以不加GZ176粉剂处理作为对照。每组处理48株苗，随机 放置，共重复三次。接种30d后测定植株生物量。

如表2、3、4、5、6、7所示，GZ176粉剂处理对茄科番茄、葫芦科黄瓜、水稻、小麦、 叶类蔬菜空心菜、菊花的株高、茎粗、叶片面积、鲜干重具有显著提高作用，促生效果分别达 16.19％、38.83％、26.72％、45.19％、50.88％、20.33％。

表2GZ176粉剂处理对番茄生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表3GZ176粉剂处理对黄瓜生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表4GZ176粉剂处理对水稻生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表5GZ176粉剂处理对小麦生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表6GZ176粉剂处理对空心菜生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表7GZ176粉剂处理对菊花生物量的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例5GZ176粉剂制剂处理的田间生防与促生试验

方法：本试验共设两个处理：A：番茄“特力娜”(购买于南京寿德实验器材有限公司)+GZ176 粉剂(实施例2制备)：育苗时，将GZ176粉剂拌种后播于穴盘中，至4叶期(4周左右)时， 将菌根化苗移栽至大田中；B：以不用GZ176粉剂拌种作为空白对照。每处理设3小区重复， 各处理随机区组排列，小区之间以保护行隔离。试验田其他方面按常规管理。

在移栽缓苗30天后，统计病害严重度，40天后，每小区选定长势均一的24株番茄测量株 高、茎粗和叶片数。收获时每个小区选定长势均一的10株番茄测量产量。

根据表8，GZ176粉剂处理后，番茄青枯病的病害严重度控制在17.16％，即防效高达 75.27％，直接挽救农户每亩经济损失近20000元。由表9可知，“特力娜”移栽40天后，处理 组番茄的株高、茎粗和叶片数都有显著优于对照组。

GZ176粉剂处理可使番茄溶性蛋白质含量提高25.4％、可溶性糖含量提高75.6％，Vc含 量提高54％，番茄红素含量提高59.58％。由于青枯病的发生严重，造成对照组几乎绝收，经 GZ176粉剂处理的番茄亩产为121.73kg，与对照组相比，增产超177.54％(表10)。

表8GZ176粉剂对番茄“特力娜”的防病效果(移栽后30天)

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表9GZ176粉剂对番茄“特力娜”的促生效果(移栽后40天)

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表10GZ176粉剂对番茄“特力娜”果实的品质及产量影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

实施例6GZ176粉剂制剂处理的诱导草本作物半夏、栝楼田间防病促生试验

方法：将参试半夏球茎播种前，按照10g粉剂/Kg球茎的量拌种，再播种于连作田(细菌 性软腐病发病严重)中。以不加GZ176粉剂处理作为对照。每个小区10m³，3次重复。按常 规管理方法管理，夏季收获时，统计每平方米的产量以及细菌性软腐病发病率。

将参试栝楼块根播种前，按照10g粉剂/Kg块根的量拌种，再播种于连作田(根结线虫发 病严重)中。以不加GZ176粉剂处理作为对照。每个小区20m³，3次重复。按常规管理方法 管理，秋天收获时，统计每个小区栝楼果实数以及根结线虫发病发病率。

发病率(％)＝[发病植株数/(发病植株数+健康植株数)]×100％

如表11所示，GZ176粉剂处理组半夏每平方米的产量显著高于对照组，对细菌性软腐病 的防效达68.45％，增产效果达36.17％。GZ176粉剂处理栝楼后，对根结线虫并的防效达56.27％， 增产46.69％(表12)。

表11GZ176粉剂在半夏上的应用效果

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。

表12GZ176粉剂在栝楼上的应用效果

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著

实施例7GZ176粉剂制剂处理的诱导草本作物烟草抗逆性试验

方法：将参试烟草种子用10％H₂O₂表面消毒10min，无菌水洗净后晾干备用。

播种前，每个盆钵中装混匀后的200g灭菌土壤以及10g GZ176粉剂，以保证正常接种。 每个营养钵播种10粒种子，正常浇水管理6周后，将菌根苗移栽至330ml塑料杯中，移栽时 选择长势一致的植株，1个月后进行断水干旱，干旱胁迫持续15d，干旱胁迫后正常浇水，观 察烟草幼苗的恢复生长情况。每组处理24株苗，随机放置，共重复三次。在温室中按照完全 随机区组设计摆放。

浇水进行恢复生长6d后，GZ176粉剂处理组植株恢复正常生长，而而对照组植株全部死 亡(表13)。

表13GZ176粉剂对烟草耐旱性的影响

注：不同小写字母者表示在0.05水平上差异显著。