二肽Pro-Asp在促进动物肝细胞分泌IGF-1方面的应用

摘要

本发明公开了二肽Pro-Asp在促进动物肝细胞分泌IGF-1方面的应用。本发明公开的是二肽Pro-Asp，而非Pro+Asp，能够促进动物肝细胞分泌IGF-1，Pro-Asp不仅能够在体外促进HepG2细胞和仔猪原代肝细胞分泌IGF-1，还能够在体内促进小鼠肝细胞分泌IGF-1。另外，本发明发现二肽Pro-Asp在促进IGF-1分泌方面，具有类似生长激素（GH）的作用，对于动物生长有一定的促进作用，可用作动物生长促进剂或饲料添加剂。

说明书

技术领域

本发明属于动物生长和代谢技术领域，具体涉及Pro-Asp对动物肝细胞分泌IGF-1的促进作用及其在动物生长和代谢中的应用。

背景技术

动物生长受到生长轴（GHRH-GH-IGF-1）的调控，如何促进肝脏IGF-1的分泌对于动物生长和代谢具有重要的意义。研究发现，日粮中不同营养物质对肝脏IGF-1的分泌有重要的影响。日粮蛋白经过消化后会形成一些含有2个氨基酸残基的肽，称为二肽。二肽不仅能为蛋白质合成提高氮骨架，发挥其营养性作用，还可参与动物的些生理活动，如促进矿物质元素的吸收利用、提高动物机体的免疫能力和促进瘤胃微生物的生长等，发挥其功能性作用，在动物生产实践中广泛应用。除了活体层面研究小肽功能外，小肽作为添加物处理细胞的试验也有报道。细胞培养基中添加肌肽和环二肽cyclo-[His-Pro] （CHP）均可以减缓缺血培养下PC12细胞的凋亡。

    日粮经小肠消化进入肠道时，由于小肠的首过代谢作用和胞液中的肽水解酶分解作用，二肽进入肝脏中的种类和浓度会有所改变，有报道（LIU et al., 2014），二肽中连有脯氨酸（Pro）时，其稳定性升高，可以以一定浓度在血液中存在。另有报道，肝细胞凋亡的发生可能主要依赖于肝组织半胱氨酸蛋白酶（caspase-3）活性的改变，抑制caspase-3能明显减轻肝损伤。Caspase-3为天冬氨酸（Asp）特异性半胱氨酸蛋白酶，其活性与天冬氨酸的浓度有关。L-谷氨酰胺（Gln）作为 DNA 和谷胱甘肽等合成的氮前体，在肝组织再生，肝细胞增殖的过程中扮演着极其重要的角色。但是，目前有关二肽Pro-Asp对动物肝细胞IGF-1分泌的影响尚未见研究和报道。

发明内容

本发明的目的在于提供二肽Pro-Asp的一种新的生理功能，即二肽Pro-Asp（而非单体氨基酸Pro+Asp）能够促进动物肝细胞分泌IGF-1。另外，Pro-Asp在促进IGF-1分泌方面，具有类似生长激素（GH）的作用，因此可以应用于动物生长促进剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明公开了二肽Pro-Asp在促进动物肝细胞分泌IGF-1方面的应用，主要包括以下方面：

二肽Pro-Asp在作为或制备动物肝细胞分泌IGF-1的分泌促进剂方面的应用。

二肽Pro-Asp在作为或制备体外HepG2细胞或仔猪原代肝细胞分泌IGF-1的分泌促进剂方面的应用。

二肽Pro-Asp在作为或制备体内小鼠肝细胞分泌IGF-1的分泌促进剂方面的应用。

二肽Pro-Asp作为或制备HepG2细胞或仔猪原代肝细胞IGF-1 mRNA和蛋白的表达促进剂方面的应用。

二肽Pro-Asp在作为或制备JAK2-STAT5信号通路激活剂方面的应用，具体地，二肽Pro-Asp是作为或制备小鼠肝脏细胞p-JAK2和p-STAT5蛋白表达促进剂方面的应用。

二肽Pro-Asp在作为或制备促进动物肝细胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促进剂方面的应用，以及二肽Pro-Asp和生长激素GH联用在作为或制备促进动物肝细胞JAK2和STAT5的磷酸化水平的促进剂方面的应用；具体地，所述动物肝细胞为HepG2细胞。

二肽Pro-Asp在作为或制备动物生长促进剂或饲料添加剂方面的应用，优选地，所述动物为猪。

本发明经过大量实验研究发现，二肽Pro-Asp，而非Pro+Asp，能够促进动物肝细胞分泌IGF-1。Pro-Asp不仅能够在体外促进HepG2细胞和仔猪原代肝细胞分泌IGF-1，还能够在体内促进小鼠肝细胞分泌IGF-1。另外，本发明还发现二肽Pro-Asp在促进IGF-1分泌方面，具有类似生长激素（GH）的作用，对于动物生长有一定的促进作用，因此，可用作动物生长促进剂或饲料添加剂使用。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明提供了Pro-Asp的一种重要的新生理功能，首次公开了二肽Pro-Asp能够在体外促进HepG2细胞和仔猪原代肝细胞分泌IGF-1，同时能够在体内促进小鼠肝细胞分泌IGF-1。

（2）本发明提供了二肽Pro-Asp在促进动物肝细胞IGF-1分泌方面，具有类似生长激素（GH）的作用，可用作动物生长促进剂，具有很好的推广应用前景。

附图说明

图1为二肽Pro-Asp对HepG2细胞IGF-I分泌的影响。

图2为二肽Pro-Asp对仔猪肝原代细胞IGF-I分泌的影响。

图3为二肽Pro-Asp对HepG2细胞IGF-I mRNA表达的影响。

图4为二肽Pro-Asp对仔猪肝原代细胞IGF-I mRNA表达的影响。

图5为二肽Pro-Asp对HepG2细胞IGF-I mRNA表达及蛋白的影响。

图6为单体氨基酸Pro+Asp对HepG2细胞IGF-I mRNA表达的影响。

图7为二肽Pro-Asp对小鼠肝脏组织IGFs相关蛋白表达的影响。

图8为二肽Pro-Asp与生长激素（GH）对IGF-1表达的作用比较。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1二肽Pro-Asp（而非氨基酸单体Pro+Asp）促进动物肝细胞分泌IGF-1

1、实验方法

（1）采用含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养HepG2细胞，Hepato ZYME-SFM 无血清培养基培养仔猪原代肝细胞。

（2）分别用Pro-Asp（50、200、500 μM）和Pro+Asp（500 μM）处理上述HepG2细胞和仔猪原代肝细胞24h。

（3）收集细胞，提取RNA和蛋白，分别利用qPCR和western blot方法检测IGF-1 mRNA和蛋白表达。

收集细胞上清，RIA或ELSIA方法检测细胞上清中IGF-1分泌量。

2、结果如附图1～6所示。结果表明，500 μM的Pro-Asp可显著提高HepG2细胞（图1）和仔猪原代肝细胞（图2）分泌IGF-1，同时显著促进HepG2细胞（图3）和仔猪原代肝细胞（图4）IGF-1 mRNA的表达，显著促进HepG2细胞（图5）IGF-1蛋白的表达。而单体氨基酸Pro+Asp则不具备Pro-Asp对肝细胞IGF-1分泌的促进作用（图6）。

实施例2 尾静脉注射二肽Pro-Asp对小鼠肝脏细胞IGF-1表达及信号通路的影响

1、实验方法

（1）动物饲养条件：1只/箱，单养；饲养温度与湿度：20～26 ℃，40～70% ；采用10 h：14 h昼夜间断照明；饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。自由进食饮水，饲料和饮用水均由广东省医学实验动物中心提供；检疫：对购入SPF级C57BL BKS-DB小鼠预饲7 d。期间每日检查动物一次。

（2）动物分组及处理：将4周龄大的小鼠随机分为正常对照组、T1组和T2组，每组6只，共3组。正常对照组小鼠尾静脉注射生理盐水，T1组小鼠尾静脉注射纯度95%的 Pro-Asp 100 mg/kg，T2组小鼠尾静脉注射Pro+Asp（45+51）mg/kg。小鼠处理30 min时开始采样。

（3）血液样品的采集：将处理后的小鼠迅速摘掉眼球取血，用2 mL离心管收集血液，静置待血液凝固后，3000 rpm/min离心15 min，收集血清，-80℃冰箱保存备用。血液中IGF-I含量采用试剂盒检测，具体方法参见试剂说明书。

（4）组织样品的采集：试验结束当天，采血完毕后颈椎脱臼处死小鼠，摘取肝脏、滤纸吸干，每只小鼠于固定位置剪一块组织样，放入2 mL离心管，迅速投入装有液氮的容器中，采样结束后转移样品至 -80 ℃冰箱中，保存备用。组织样品经总蛋白提取后，采用Western Blot方法检测IGF-I等相关基因蛋白水平的表达变化，综合分析Pro-Asp对小鼠肝脏分泌IGF-I的影响。

2、结果如附图7所示。由图7可知，小鼠尾静脉注射100 mg/kg Pro-Asp 30 min，Pro-Asp可以显著上调小鼠肝脏组织IGF-I的表达，同时显著提高p-JAK2和p-STAT5的蛋白表达，而单体氨基酸则无此促进作用。结果提示Pro-Asp通过激活JAK2-STAT5信号通路促进IGF-1蛋白的表达。

实施例3 Pro-Asp具有类似GH促进IGF-1分泌的作用

1、采用含有10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养HepG2细胞，分别用Pro-Asp（500 μM）或/和GH（20 nM）处理细胞24h，收集细胞，提取细胞蛋白， western blot方法分别进行IGF-1蛋白和相关信号通路蛋白的表达。

2、结果如附图8所示。图8表明，单独添加GH和Pro-Asp均能够显著促进JAK2和STAT5的磷酸化水平和IGF-1蛋白表达水平；与单独添加GH和Pro-Asp相比，同时添加二者同时能够显著促进JAK2和STAT5的磷酸化水平，但并不能显著升高IGF-1蛋白表达水平，提示Pro-Asp具有类似GH的作用。

综上所述，试验表明，二肽Pro-Asp（而非单体氨基酸Pro+Asp）能够促进动物肝细胞分泌IGF-1，且在促进IGF-1分泌方面，Pro-Asp具有类似生长激素（GH）的作用。