一种氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法

摘要

本发明涉及一种用于生产甲烷的氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法。本发明设计在常温常压条件下运行沼气发酵体系，通过外源加入H2和CO2基质并进行气体循环的驯化方法，促进沼气发酵活性污泥中氢营养型产甲烷菌群的生长与富集。本发明可以有效提升氢营养型产甲烷菌群在产甲烷菌中的含量，并能获得富集了氢营养型产甲烷菌群的沼气发酵活性污泥。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于生产甲烷的氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法，属于沼气发酵微生物技术领域。

背景技术

在沼气发酵过程中，有机物在水解和发酵阶段、产氢产乙酸阶段等两个阶段中产生的氢气（H₂）和二氧化碳（CO₂），能被氢营养型产甲烷菌群代谢生成甲烷（CH₄），沼气中CH₄的产生有28%来源于这一途径，即H₂还原CO₂生成CH₄。

沼气中CH₄含量为60%左右，CO₂含量为35%左右，CO₂含量超过CH₄含量的一半，造成沼气高值化利用的瓶颈，同时CO₂没有得到有效利用，浪费了沼气发酵微生物生长所需的碳源；从H₂还原CO₂生成CH₄这一途径得到启发，若将沼气中的CO₂通过H₂来进行微生物还原，必将有效提升沼气中CH₄的含量，开发生物天然气，促进沼气高值化利用；产甲烷菌可分类为乙酸营养型产甲烷菌（代谢基质为乙酸）、氢营养型产甲烷菌（代谢基质为H₂和CO₂）以及甲基营养型产甲烷菌（代谢基质为甲酸、甲醇及甲胺等），而示踪实验表明沼气发酵微生物体系中的产甲烷菌有70%以上是乙酸营养型产甲烷菌，为了在沼气发酵体系中高效实现H₂还原CO₂生成CH₄，有必要采取方法促进微生物体系中氢营养型产甲烷菌群的生长；因此，本实验设计在常温常压条件下运行沼气发酵体系，通过外源加入H₂和CO₂基质的驯化方法，促进沼气发酵活性污泥中氢营养型产甲烷菌群的代谢生长，以期提升氢营养型产甲烷菌群在产甲烷菌中的含量，并获得富集了氢营养型产甲烷菌群的沼气发酵活性污泥。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于生产甲烷的氢营养型产甲烷菌群的富集与驯化方法。

本发明通过以下技术方案完成：

⑴沼气发酵温度、压力：常温、常压

⑵沼气发酵活性污泥用量：沼气发酵活性污泥用量为沼气发酵反应器容积的50%，剩余反应器体积空间由沼液填充。

⑶代谢基质配料：按照H₂还原CO₂生成CH₄的生化方程式4H₂ + CO₂ → CH₄ + 2H₂O，以H₂:CO₂体积比4:1进行配料，并配1体积的N₂作为微生物生长所需的氮源，每组实验混合气体配料3000mL，其中H₂有2000mL、CO₂有500mL、N₂有500mL。

⑷驯化方法：将配好的混合气体通至湿式储气柜中，此时气柜浮罩上升至3000mL的位置，然后利用气体循环泵将混合气体抽至沼气发酵反应器中，在沼气发酵活性污泥床中反应后又回到气柜中，这样反复进行气体循环，随着反应进行，气柜浮罩不断下降，当浮罩不再下降时表明反应结束。

⑸沼气发酵活性污泥样品总DNA的提取、检测及测序

①基因组DNA的提取：采用环境DNA提取试剂盒Fast DNA spin kit for soil(MP Biomedicals,LLC;www.mpbio.com)对样品进行总DNA的提取，之后采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，取适量的样品于离心管中，使用无菌水稀释样品至1ng/μl。

②PCR扩增：稀释后的基因组DNA为模板；根据测序区域的选择，使用带Barcode的特异引物；使用New England Biolabs公司的Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。使用高效和高保真的酶进行PCR，确保扩增效率和准确性。 引物对应区域：16S V4区引物为515F-806R；18S V4区引物为528F-706R；18S V9区引物为1380F-1510R；ITS1区引物为ITS1-5F-- ITS2；ITS2区引物为：ITS2-3F-- ITS2-4R。

③PCR产物的混样和纯化：PCR产物使用2%浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测；根据PCR产物浓度进行等浓度混样，充分混匀后使用2 %的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用Thermo Scientific公司的GeneJET 胶回收试剂盒回收产物。

④文库构建和上机测序：使用New England Biolabs公司的NEB Next? Ultra? DNA Library Prep Kit for Illumina建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测，合格后，使用MiSeq进行上机测序。

本发明的作用机理：本发明通入沼气发酵反应器中的底物是H₂、CO₂和N₂，H₂和CO₂作为沼气发酵微生物的代谢基质，N₂作为沼气发酵微生物的氮源；在气体循环过程中，氢营养型产甲烷菌由于有充足的代谢基质H₂和CO₂，因而能在沼气发酵过程中不断生长富集，而乙酸营养型产甲烷菌和甲基营养型产甲烷菌由于没有得到代谢基质，在沼气发酵过程中就会不断消亡。

本发明的有益效果：⑴本发明兼备 CO₂减排的环保意义、生物合成CH₄的再生能源意义和潜在经济收益等优势，有着广泛应用前景。⑵将不易被高效安全利用的H₂，通入沼气发酵体系中，与沼气中占比35%左右的CO₂发生生化反应，转化为另一种清洁能源CH₄，有效提升传统沼气发酵的CH₄含量，打造生物天然气，实现沼气的高值化利用。

    附图说明：

图1为本发明的结构示意图；

图2为本发明实施例H₂还原CO₂生成CH₄的实验结果。

具体实施方式：

实施例：

⑴H₂还原CO₂生成CH₄的实验结果

在实验的正常运行阶段，氢营养型产甲烷菌的富集驯化共进行了5组有效实验，这5组有效实验的CH₄生成量结果见图2。

从图2中可以看出，第1至5组气体循环实验的CH₄产量分别为185mL、258mL、166mL、136mL、140mL，表明沼气发酵体系中的微生物能将H₂和CO₂较好的转换成CH₄；按照H₂还原CO₂转换生成CH₄的生化方程式4H₂ + CO₂ → CH₄ + 2H₂O，外源加入的2000mL H₂和500mL CO₂在理论上可转换生成500mL CH₄，从实验结果可知，第1至5组气体循环实验的实际CH₄产量分别占理论产量的37%、51.6%、33.2%、27.2%、28%，其中第2组的CH₄产量最高，达到理论值的51.6%。

N₂减少（或利用）的情况说明：第1至5组气体循环实验的N₂消耗量分别为151mL、44mL、210mL、157mL、45mL，表明在本实验条件下，通过气体循环的方式，外源加入的N₂可被沼气发酵微生物当作氮源直接利用，同时也表明富集得到的沼气发酵微生物中存在着以N₂为氮源的微生物。

⑵产甲烷菌群落及变化分析

从图2的气体循环实验结果可知，本发明可将外源加入的H₂和CO₂较好的转换生成CH₄，从微生物学的角度上看，应是体系中的氢营养型产甲烷菌发挥了重要作用，因此，对启动前的沼气发酵活性污泥和第5组气体循环实验结束后的沼气发酵活性污泥分别进行总DNA提取，应用16S rRNA基因技术对气体循环实验前后沼气发酵活性污泥中的原核微生物群落进行研究，比较分析原核微生物群落的前后变化情况，实验前后沼气发酵活性污泥中产甲烷菌在古菌中的含量变化情况参见下表（表中↑表示增长、↓表示降低）。

由上表可知，专性乙酸型的甲烷鬃毛菌属含量在实验前后明显降低，从84%降低至64%，降幅达23.8%，这是由于本实验没有提供乙酸基质，而甲烷鬃毛菌属又不能利用H₂和CO₂基质，甲烷鬃毛菌属由于缺乏代谢基质而导致含量显著降低；甲烷八叠球菌属既可以利用乙酸基质又可以利用H₂和CO₂基质，本实验没有提供乙酸基质，但甲烷八叠球菌属在古菌中的含量由实验前的8%提高到实验后的16%，含量增长了一倍，这是由于外源加入的H₂和CO₂作为甲烷八叠球菌属的生长基质，使其不断富集生长所致；属于氢营养型的甲烷粒菌属、甲烷袋状菌属、甲烷螺菌属、甲烷杆菌属在实验前后的含量同样发生了明显增长，增长率分别为16.7%、80%、150%、11.1%，表明了本实验中外源加入的H₂和CO₂充分促进了这些氢营养型产甲烷菌的生长；值得注意的是，在实验前没有检测到的甲烷绳菌属、甲烷盘菌属、甲烷泡菌属等氢营养型产甲烷菌，在实验结束后的沼气发酵活性污泥中都检测到了这些产甲烷菌的存在，说明了通过外源加入H₂和CO₂基质，可有效刺激能利用H₂和CO₂的产甲烷菌的富集。