利用顶空气相色谱法检测广金钱草总黄酮提取物中大孔吸附树脂有机物残留的方法

摘要

本发明公开了一种利用顶空气相色谱法检测广金钱草总黄酮提取物中大孔吸附树脂有机物残留的方法，该方法：用配置FID检测器的气相色谱仪，顶空进样器；色谱条件：采用DB-1701色谱柱，柱流速为0.95-1.05ml/min，色谱柱的柱温：以35℃为起始温度，保持4min，然后以9-11℃/min的速率升温至90℃，再以19-21℃/min的速率升温至230℃；FID检测器温度为250℃；顶空参数：顶空瓶保温温度为138-142℃，顶空瓶保温时间为28-32min，其中，所述大孔吸附树脂有机物残留为选自正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯的至少一种。该方法简便、快捷、灵敏度高，准确度好，专属性强、重现性良好，能够有效地用于广金钱草总黄酮提取物的大孔吸附树脂有机物残留量检测。

说明书

技术领域

本发明涉及中药新药技术药物杂质的检测方法领域，特别是利用顶空气相色 谱法检测广金钱草总黄酮提取物中大孔吸附树脂有机物残留的方法。

背景技术

广金钱草为豆科山蚂蝗属植物，《中华人民共和国药典》2005年版一部中收 载为常用药材。同时药典中收载的成方制剂“石淋通片”，其药物组成仅有广金 钱草一味药，用于治疗尿路感染、尿结石、胆囊炎等病症。“石淋通片”提取制 备工艺比较简单，有效部位不明确，质量控制指标水平有待提高。广金钱草总黄 酮胶囊是由广金钱草的干燥地上部分利用大孔树脂等技术得到有效部位广金钱 草总黄酮，进而开发得到的防治尿石症的中药新药。其具有清除湿热、利尿排石 之功效，用于湿热蕴结所致的淋沥涩痛，尿路结石和上述症候者。

通常使用的大孔树脂一般是用苯乙烯做单体，以甲苯和二甲苯为致孔剂，经 二乙烯苯交联而成。其中常会由于聚合反应引入一些杂质，包括苯、甲苯、二甲 苯、苯乙烯、二乙烯苯、环烷等有机溶剂，在中药生产工艺中使用大孔树脂可能 将这些残留物带入制剂中，对人体健康带来危害。因此，有必要对可能残留的有 机溶剂进行限量检测。

根据制备工艺，广金钱草总黄酮制备过程中曾通过大孔树脂进行吸附纯化， 因而可能带来有机溶剂的残留，在广金钱草总黄酮提取物中为控制这些有机溶剂 残留量，需要采用适当方法检测这些有机溶剂残留，因此需要制定检测方法。

然而，目前的广金钱草总黄酮提取物中大孔吸附树脂有机溶剂残留限量的检 测方法，仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个 目的在于提出一种简便、快捷、灵敏度高的广金钱草总黄酮提取物中大孔吸附树 脂有机溶剂残留限量的检测方法。

首先，需要说明的是，目前虽然用气相色谱法建立了系列的检测方法，但因 中药品种的差异，特别是中药中化学成分的影响，各检测方法不可能一贯套用。 因有机残留量较小，不科学的检测方法对结果的影响很大，这就要求根据需要， 从仪器、试药、色谱条件、进样方法等方面开展研究，以便制定可行、准确、简 便的检测方法。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种利用顶空气相色谱法检测 广金钱草总黄酮提取物中大孔吸附树脂有机物残留的方法。根据本发明的实施 例，该方法：

用配置FID检测器的气相色谱仪，顶空进样器；

色谱条件：采用DB-1701色谱柱，柱流速为0.95-1.05ml/min，色谱柱的柱 温：以35℃为起始温度，保持4min，然后以9-11℃/min的速率升温至90℃， 再以19-21℃/min的速率升温至230℃；

FID检测器温度为250℃；

顶空参数：顶空瓶保温温度为138-142℃，顶空瓶保温时间为28-32min，

其中，所述大孔吸附树脂有机物残留为选自正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯 乙烯和二乙烯苯的至少一种。

发明人惊奇地发现，利用该方法能够高效地实现广金钱草总黄酮提取物中的 大孔吸附树脂有机溶剂残留限量检测。并且，本发明的方法简便、快捷、灵敏度 高，准确度好，专属性强、重现性良好，能够有效地用于控制广金钱草总黄酮提 取物的大孔吸附树脂有机物残留量。

另外，根据本发明上述实施例的利用顶空气相色谱法检测广金钱草总黄酮提 取物中大孔吸附树脂有机物残留的方法还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述气相色谱仪的进样口温度为180℃，载气为N₂。 由此，检测灵敏度高，准确性好。

根据本发明的实施例，顶空参数：顶空瓶保温温度为140℃，顶空瓶保温时 间为30min，取样针温度为150℃，加压时间为1.0min，传输线温度为160℃， 进样时间为0.05min，拔针时间为0.2min，GC循环时间为18min。由此，检测灵 敏度高，准确性好。

根据本发明的实施例，本发明的方法包括以下步骤：

(1)取供试品广金钱草总黄酮提取物，用二甲基亚砜超声溶解，配制成浓 度为200mg/ml的供试品溶液；

(2)将气相色谱仪、FID检测器和顶空进样器进行参数设置：

色谱条件：采用DB-1701色谱柱；柱流速为0.95-1.05ml/min；色谱柱的柱 温：以35℃为起始温度，保持4min，然后以9-11℃/min的速率升温至90℃， 再以19-21℃/min的速率升温至230℃；进样口温度为180℃；载气为N₂；

FID检测器参数：温度为250℃；

顶空参数：顶空瓶保温温度为138-142℃，顶空瓶保温时间为28-32min，取 样针温度为150℃，加压时间为1.0min，传输线温度为160℃，进样时间为 0.05min，拔针时间为0.2min，GC循环时间为18min；

(3)取所述供试品溶液，利用顶空进样器注入气相色谱仪，进样时间为 0.05min，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，得到供试品中各大孔吸附树脂 有机物残留量。

由此，能够简便、快捷地检测供试品广金钱草总黄酮提取物中各大孔吸附树 脂有机物的残留量，且灵敏度高，准确性好。

根据本发明的一些具体示例，色谱条件为：

采用30m×0.32mm，0.25μm的DB-1701色谱柱；柱流速为1ml/min；色谱 柱的柱温：以35℃为起始温度，保持4min，然后以10℃/min的速率升温至 90℃，再以20℃/min的速率升温至230℃；进样口温度为180℃；载气为N₂。 由此，检测灵敏度和准确度高，重现性好。

根据本发明的实施例，所述气相色谱仪为PE气相检测仪。由此，能够简便、 快捷、准确地实现广金钱草总黄酮提取物中各大孔吸附树脂有机物的残留限量检 测，另外便于操作，易于参数控制，检测灵敏度高。

根据本发明的实施例，所述气相色谱仪为岛津气相检测仪。由此，能够简便、 快捷、准确地实现广金钱草总黄酮提取物中各大孔吸附树脂有机物的残留限量检 测，另外便于操作，易于参数控制，检测灵敏度高。

根据本发明的一些具体示例，顶空参数为：

顶空瓶保温温度为140℃，顶空瓶保温时间为30min，取样针温度为150℃， 加压时间为1.0min，传输线温度为160℃，进样时间为0.05min，拔针时间为 0.2min，GC循环时间为18min。由此，检测灵敏度高、准确性好。

根据本发明的实施例，在步骤(3)中，通过以下步骤实施所述外标法：利 用顶空进样器，将对照品溶液注入气相色谱仪，进样时间为0.05min，并记录色 谱图，其中所述对照品溶液为正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯标 准品的混合溶液；以所述对照品溶液的色谱图为对照，确定正己烷、苯、甲苯、 二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯在色谱图上的位置；针对各组分，分别以对照品溶液 中所述组分进样的峰面积和浓度作标准曲线，求出线性方程；基于所述供试品溶 液的色谱图，确定所述供试品溶液中各组分进样的峰面积；以及基于各组分的线 性方程和所述供试品溶液中各组分进样的峰面积，计算得到供试品溶液中各组分 的浓度及残留量。

根据本发明的实施例，所述对照品溶液是通过以下步骤获得的：分别取正己 烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯对照品，用二甲基亚砜稀释成每ml 含苯0.2mg，甲苯、二甲苯、苯乙烯各2mg和二乙烯苯10mg的对照品溶液储 备液；以及利用二甲基亚砜将所述对照品溶液储备液进行梯度稀释，以便获得对 照品溶液，在所述对照品溶液中，苯浓度为400pg/ml，正己烷浓度为4μg/ml， 甲苯浓度为4μg/ml，二甲苯浓度为4μg/ml，苯乙烯浓度为4μg/ml，二乙烯苯 浓度为20μg/ml。

此外，根据本发明的另一些实施例，本发明的方法还可以包括以下步骤：

1)制备空白溶液：

准确移取2ml二甲基亚砜溶液到20ml顶空瓶中，加盖密封。

2)制备对照品溶液：

分别称取正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯、二乙烯苯对照品适量，加二 甲基亚砜稀释成每ml含苯0.2mg，甲苯、二甲苯、苯乙烯各2mg和二乙烯苯10mg 的对照品溶液储备液。准确移取10.0ml储备溶液到100ml容量瓶中，用二甲基 亚砜稀释至刻度，摇匀，再准确移取2.0ml到100ml容量瓶中，用二甲基亚砜 稀释至刻度，摇匀。再准确移取2.0ml该溶液到20ml顶空瓶中，加盖密封，即 得。

3)制备供试品溶液：

称取400mg供试品，精密称定于20ml顶空瓶中，加2.0ml二甲基亚砜超 声溶解，加盖密封，振摇得供试品溶液(供试品溶液浓度：200mg/ml)。

4)分别进样对照品溶液和供试品溶液入顶空瓶，注入气相色谱仪，记录色 谱图，即得。

其中，色谱条件如下；气相色谱仪配置FID检测器，顶空进样，用DB-1701 色谱柱，升温程序，35℃为起始温度，保持4min，然后以10℃/min的速率上升 到0℃，然后再以20℃/min的速率升为230℃。检测器温度250℃，进样口温 度180℃，载气为N₂，流速1ml/min，顶空瓶保温温度，140℃，顶空瓶保温时 间30min，取样针温度：150℃，加压时间1.0min，传输线温度160℃，进样时 间0.05min，拔针时间：0.2min，GC循环时间18min。

5)根据色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中正己烷、苯、甲苯、二甲 苯、苯乙烯、二乙烯苯的含量。

具体地，以标准物质图谱为对照，确定各组分谱图上的位置；分别以各组分 标准品进样的峰面积和浓度做标准曲线，求出线性方程，将样品种各组分代入相 应的线性方程计算样品中各组分浓度，最后计算各组分残留量。

还需要说明的是，根据本发明实施例的利用顶空气相色谱法检测广金钱草总 黄酮提取物中大孔吸附树脂有机物残留的方法，具有下列优点的至少之一：

1、本发明的方法首次实现了用顶空气相色谱法进行广金钱草总黄酮提取物 大孔吸附树脂有机物残留的检测。

2、利用本发明的方法，能够实现所有有机溶剂残留组分一次检测，色谱分 离度甚佳。

3、本发明的方法需时短，一个样品的分析仅需18分钟，为产业化生产产品 质量的可控性奠定了坚实的基础。

4、通过方法学实验研究表明，本发明的方法准确度高、专属性强、重现性 良好，可以有效的控制广金钱草总黄酮提取物的大孔吸附树脂有机物残留量。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述 中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将 变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，线性关系检测实验中得到的正己烷线性 关系图；

图2显示了根据本发明一个实施例，线性关系检测实验中得到的苯线性关系 图；

图3显示了根据本发明一个实施例，线性关系检测实验中得到的甲苯己烷线 性关系图；

图4显示了根据本发明一个实施例，线性关系检测实验中得到的二甲苯线性 关系图；

图5显示了根据本发明一个实施例，线性关系检测实验中得到的苯乙烯线性 关系图；

图6显示了根据本发明一个实施例，线性关系检测实验中得到的二乙烯苯线 性关系图；

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释 本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按 照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

需要说明的是，下面的实施例是针对本发明的残留溶剂分析方法进行的验证 实验，其中各验证实验均采用“一般方法”中描述的检测方法和检测参数进行残 留溶剂检测分析，验证结果汇总于下表1。

一般方法(残留溶剂分析方法验证)：

本发明的利用顶空气相色谱法检测广金钱草总黄酮提取物中大孔吸附树脂 有机物残留的一般方法，如下所示：

1.概述

根据制备工艺，广金钱草总黄酮制备过程中曾通过大孔树脂进行吸附纯化。由于苯 乙烯骨架型大孔树脂中大都含有未聚合的单体、交联剂、致孔剂等，如正己烷、苯、甲 苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯等有机物，因此发明人对样品中上述6种树脂有机物采 用顶空气相色谱法进行检查。

2.色谱条件

其中，需要说明的是，本文所使用的表达方式中，“储备溶液”与“对照品溶液储备液” 含义相同，可以互换使用；“标准溶液”与“对照品溶液”含义相同，可以互换使用。

实施例1

发明人对本发明的残留溶剂分析方法进行实验验证，其中各实验均采用“一般方法”中 方法和检测参数进行残留溶剂检测分析，具体的验证试验和结果如下：

1.系统适用性

1.1简介

在每次序列的开始考察系统适用性，空白溶液无干扰峰；系统适用性通过重复测定 6次标准溶液中各溶剂峰面积的RSD(即将前述配制的标准溶液分别取6份移至6个顶 空进样瓶中，分别测6次)而实现的，要求6次所得的色谱图中各个溶剂(这里的“各 个溶剂”对应标准溶液中的各组分，指各待测组分，也即下表2中所示的6种树脂有机 物：正己烷、苯、甲苯、二甲苯、苯乙烯和二乙烯苯)等面积的相对标准偏差RSD符 合可接受系统适用性(RSD不得大于10.0％)。

1.2测试结果

表2系统适用性测定结果

2.专属性

2.1简介

方法的专属性研究考察峰鉴别和选择性，要求：分别进样空白溶液和所有溶剂的定 位溶液(分别取6个待测组分各1ul至100ml容量瓶中，用DMSO定容，即得正己烷定 位溶液、苯定位溶液、甲苯定位溶液、二甲苯定位溶液、苯乙烯定位溶液、二乙烯苯定 位溶液)来确定所有潜在残留溶剂。分离度测试溶液所得的色谱图中，任意两相邻的色 谱峰之间的分离度不得小于1.5。

2.2测试结果

表3分离度测试结果

3.检测限和定量限

3.1简介

对于这些潜在的残留有机溶剂，检测限(LOD)和定量限(LOQ)是根据信噪比 法来确定的。把已知浓度的溶剂储备液(即各待测组分的对照品溶液储备液)稀释 到稀浓度的试样，测出的信号与空白处的信号(基线噪音)进行比较。算出能被可 靠地检测出的最低浓度或百分比。以信噪比(S/N)约为3时相应的试样浓度来确定 检测限。

定量限是通过考察各溶剂(即各待测组分)的信噪比为10左右的相应浓度来确定 的。在该浓度水平，重复考察6个测试溶液，要求6次所得的色谱图中各溶剂峰面 积的相对标准偏差不得大于10.0％，来证实定量限测定结果具有一定的精密度。需 要说明的是，前述的“6个测试溶液”指的是将各个对照品溶液储备液逐级稀释，直 到稀释至待测溶液的信噪比为10为止，此时的浓度即为该待测组分的测试溶液；“重 复考察6个测试溶液”指的是将定量限溶液分别移取6份至6个顶空瓶中重复测定6 次。

3.2测试结果

表4各溶剂检测限测定结果

表5正己烷定量限测定结果

表6苯定量限测定结果

表7甲苯定量限测定结果

表8二甲苯定量限测定结果

表9苯乙烯定量限测定结果

表10二乙烯苯定量限测定结果

4.线性和范围

4.1简述

本实验将各溶剂(即6种待测组分)的对照品溶液储备液，稀释成一系列浓度作为 线性溶液。然后，对各溶剂，在LOQ浓度至不低于150％指标浓度的范围内取7个浓度 点进行研究(选取原则是尽量让7个浓度在LOQ-150％浓度范围内平均分布)。线性关 系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回 归，至少报告相关系数R²来证实良好线性关系，要求该线性回归系数R²的数值应在 0.997～1.000。

4.2测试结果

表11正己烷线性测试结果

其中，正己烷线性关系图见图1。

表12苯线性测试结果

其中，苯线性关系图见图2。

表13甲苯线性测试结果

其中，甲苯线性关系图见图3。

表14二甲苯线性测试结果

其中，二甲苯线性关系图见图4。

表15苯乙烯线性测试结果

其中，苯乙烯线性关系图见图5。

表16二乙烯苯线性测试结果

其中，二乙烯苯线性关系图见图6。

5.精密度(重复性)

5.1简述

重复性是通过向供试品溶液(0.02g/ml)中加入100％指标浓度的溶液，测定6次来验 证的。要求测定6次的结果RSD％不得大于10.0％，来证实方法具有良好的精密度。

其中，本实验中样品配制：将0.4g供试品称在顶空进样瓶中，然后移取2ml配制好的 标准溶液至该顶空进样瓶中，压盖，超声使供试品溶解，即得。前述的“100％指标浓度的 溶液”即“一般方法”中所述的标准溶液。

5.2测试结果

表17重复性标准溶液测试结果

表18正己烷精密度测试结果

表19苯精密度测试结果

表20甲苯精密度测试结果

表21二甲苯精密度测试结果

表22苯乙烯精密度测试结果

表23二乙烯苯精密度测试结果

6.中间精密度

6.1简述

为考察随机变动因素对精密度的影响，由另一名分析员独立建立系统，重新配制6个 测试溶液(即按照“一般方法”中所述的配制方法，重新配制“标准溶液”)进行检测，须 使用不同的仪器，在不同的日期进行。要求该精密度结果与重复性结果共12次进样的RSD 不得大于10.0％，来证实良好的中间精密度。

6.2测试结果

表24中间精密度系统适用性兼标准溶液测试结果

表25正己烷中间精密度测试结果

表26苯中间精密度测试结果

表27甲苯中间精密度测试结果

表28二甲苯中间精密度测试结果

表29苯乙烯中间精密度测试结果

表30二乙烯苯中间精密度测试结果

7.准确度

7.1简述

准确度是通过在供试品中加入指标的80％、100％、120％三个不同浓度的标准溶液测 得的回收率所得。加入已知量的溶剂，再测定加样样品中各溶剂的测定结果和理论值之间的 比值(回收率)，以百分率％表达，要求回收率在80.0％～120.0％之间，以证实方法具有良好 的准确度。

本实验中样品配制方法为：

分别称取苯20mg(22ul)，正己烷200mg(305ul)，甲苯200mg(230ul)，二甲苯200mg (230ul)，苯乙烯200mg(220ul)，二乙烯苯1g(1100ul)，精密称定于100ml容量瓶中，用 二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，混匀，即得储备液(即标准溶液储备液)。准确移取10.0ml 储备溶液到100ml容量瓶中，用二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀。

指标的80％浓度：准确移取上述溶液1.6ml到100ml容量瓶中，用二甲基亚砜稀释至 刻度，摇匀，即得指标的80％浓度的标准溶液。

指标的100％浓度：准确移取上述溶液2.0ml到100ml容量瓶中，用二甲基亚砜稀释至 刻度，摇匀，即得指标的100％浓度的标准溶液。

指标的120％浓度：准确移取上述溶液2.4ml到100ml容量瓶中，用二甲基亚砜稀释至 刻度，摇匀，即得指标的120％浓度的标准溶液。

称取供试品溶液0.4g至顶空进样瓶中(称取多份)，将上述80％浓度、100％浓度、120％ 浓度的标准溶液分别加入供试品中即得。

7.2测试结果

由于准确度和重复性在同一个序列下同时进行，因此准确度标准溶液测试结果见表 17。即：

表17重复性标准溶液测试结果

表31正己烷回收率测试结果

表32苯回收率测试结果

表33甲苯回收率测试结果

表34二甲苯回收率测试结果

表35苯乙烯回收率测试结果

表36二乙烯苯回收率测试结果

8.耐用性-溶液稳定性

8.1简述

在广金钱草总黄酮原料药供试品溶液中加入指标浓度的有机溶剂(“指标浓度的有机 溶剂”即为前述“一般方法”中所述的标准溶液)，作为测试溶液，考察溶剂标准溶液(前 述“一般方法”中所述的标准溶液)和测试溶液随时间变化的规律，在自然环境下，将顶空 瓶中的标准溶液和测试溶液放置0天、1天、2天、3天后，用新鲜配制的标准溶液考察其 检测结果的变化，要求回收率在80.0％～120.0％之间，为检测时标准溶液和测试溶液的放置 时间提供依据。

8.2测试结果

表37溶液放置时间对标准溶液中正己烷测定结果的影响

表38溶液放置时间对标准溶液中苯测定结果的影响

表39溶液放置时间对标准溶液中甲苯测定结果的影响

表40溶液放置时间对标准溶液中二甲苯测定结果的影响

表41溶液放置时间对标准溶液中苯乙烯测定结果的影响

表42溶液放置时间对标准溶液中二乙烯苯测定结果的影响

表43溶液放置时间对测试溶液中正己烷测定结果的影响

表44溶液放置时间对测试溶液中苯测定结果的影响

表45溶液放置时间对测试溶液中甲苯测定结果的影响

表46溶液放置时间对测试溶液中二甲苯测定结果的影响

表47溶液放置时间对测试溶液中苯乙烯测定结果的影响

表48溶液放置时间对测试溶液中二乙烯苯测定结果的影响

9.耐用性-条件参数变化对各个溶剂测定的影响

9.1简述

将通过改变柱流量、顶空瓶保温温度、顶空瓶保温时间、不同的升温速率来评估测定 条件参数有微小的变动时，测定结果不受影响的承受程度。要求各个变动的色谱条件参数下， 残留溶剂的回收率满足80.0％～120.0％。

其中，

本实验的色谱条件如表49；

采用的样品为：

供试品空白溶液，具体配制方法见表51；

标准溶液：即为前述“一般方法”中所述的标准溶液，具体配制方法见表50；

测试溶液：向供试品溶液中添加上述“标准溶液”，作为测试溶液，也即：供试品空白 溶液+标准溶液，具体配制方法见表51。

表49色谱条件变动的参数

表50标准溶液配制

表51供试品空白溶液和测试溶液配制

9.2测试结果

表52不同柱流量影响的测试结果

表53不同炉温影响的测试结果

表54不同恒温时间的测试结果

表55不同升温速率的测试结果

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指 的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本 发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。