高效液相色谱法测定塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐含量的方法

摘要

本发明公开了一种高效液相色谱测定塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐含量的方法，它包括如下步骤：高效液相色谱仪的固定相为十八烷基键合石墨碳，流动相A为10mmol/l乙酸铵水溶液-甲醇=45:55～55:45，流动相B为甲醇，柱温为30℃～40℃，检测波长为218nm～222nm。吸取对照品溶液、供试品溶液、空白辅料溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。计算对照品溶液浓度的值为X与相应峰面积值为Y，进行线性拟合，得出线性回归方程，线性范围为99.897~599.382ng/ml。本发明应用高效液相色谱法测定塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐，分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高，能够更好控制塞来昔布胶囊的质量。

说明书

技术领域

本发明涉及高效液相色谱技术领域，具体涉及一种高效液相色谱测定塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐含量的方法。

背景技术

塞来昔布原料生产过程中可能存在对磺酰胺基苯肼盐酸盐带入。该化合物结构与已知基因毒杂质有类似性，需对其进行限度控制。按照ICH规定基因毒杂质的人体摄入量不能超过每人每天1.5μg，因此我们建立了塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼的HPLC-UV测定法，可以更好的控制塞来昔布胶囊的产品质量，更好的对塞来昔布胶囊中可能存在的对磺酰胺基苯肼盐酸盐杂质进行检测。

发明内容

本发明的目的是建立一个测定塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐含量的方法，可以更好的控制塞来昔布胶囊的质量，更好的对塞来昔布胶囊中可能存在的对磺酰胺基苯肼盐酸盐杂质进行检测。

 本发明的技术方案是：高效液相色谱测定塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐含量的方法，它包括如下步骤：

 (1) 对照品溶液的制备：称取对磺酰胺基苯肼盐酸盐对照品，加甲醇制成每1ml含500ng的对磺酰胺基苯肼盐酸盐溶液；

 (2) 供试品溶液的制备：取塞来昔布胶囊内容物加甲醇制成每1ml含150mg塞来昔布的溶液；

 (3) 测定：高效液相色谱仪的固定相为十八烷基键合石墨碳，流动相A为10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇=45:55～55:45，流动相B为甲醇，柱温为30℃～40℃，流动相A初始流速为0.78～0.82ml/min，检测波长为218nm～222nm分别吸取对照品溶液与供试品溶液各15～25μl，注入高效液相色谱仪，读取数据。

 所述高效液相色谱仪的检测器为紫外吸收检测器，检测波长为220nm。

 所述流动相A为10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇=50:50，流动相B为甲醇。其运行梯度方式见表1：

。

 本发明的有益效果是：本发明应用高效液相色谱测塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐含量，分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高，通过检测塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼的盐酸盐含量，控制每粒塞来昔布胶囊中对磺酰胺基苯肼盐酸盐不得过0.75μg，以利于更好控制塞来昔布胶囊的质量，更好的对塞来昔布胶囊中可能存在的对磺酰胺基苯肼盐酸盐杂质进行检测。

附图说明：图 1为空白辅料溶液色谱图；

图 2为对照溶液色谱图；

图 3为样品溶液色谱图；

图4为对磺酰胺基苯肼盐酸盐的线性回归图；

图5为流速变化测试结果对比图；

图6为流动相A比例变化测试结果对比图；

图7为进样量变化测试结果对比图；

图8为检测波长变化测试结果对比图；

图9为柱温变化测试结果对比图。

以下通过实施例形式再对本发明的内容作进一步详细说明，但不应就此理解为本发明上述主题范围内仅限于以下实施例。在不脱离本发明上述技术前提下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的相应替换或变更的修改，均包括在本发明的范围内。

实施例1色谱柱的确定

仪器：高效液相色谱仪 Thermo Ultimate3000，紫外检测器

色谱柱：Waters Xterra RP，150mm×4.6mm×3.50μm, 十八烷基键合硅胶为填料

流速：0.7ml/min  ；

进样量：20μl ；

柱温：35℃；

波长：247nm；

流动相： 10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇=70:30；

对照品溶液的配制：精密称取对磺酰胺基苯肼盐酸盐2mg，至于200ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。精密量取上述溶液0.5ml至于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

取流动相、对磺酰胺基苯肼盐酸盐50ng/ml溶液，分别进样记录色谱图。

溶剂峰在4.0min处有较小吸收，对磺酰胺基苯肼盐酸盐在3.8min处出峰。

结论：在该方法条件下，流动相作为溶剂对磺酰胺基苯肼盐酸盐的测定有干扰。

 实施例2色谱柱的确定

仪器：高效液相色谱仪 Thermo Ultimate3000，紫外检测器

色谱柱：Inertsil ODS-3，150mm×4.6mm×3.00μm, 十八烷基键合硅胶为填料。

流速：0.7ml/min  ；

进样量：20μl ；

柱温：35℃；

波长：247nm；

流动相： 10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇=70:30；

对照溶液的配制：精密称取对磺酰胺基苯肼盐酸盐2mg，至于200ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。精密量取上述溶液0.5ml至于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

供试溶液的配制：精密称取对塞来昔布1.5g，至10ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

取流动相，对磺酰胺基苯肼盐酸盐50ng/ml溶液，塞来昔布150mg/ml溶液分别进样记录色谱图。

溶剂峰在4.0min处有较小吸收，对照溶液的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在3.89min处出峰，供试的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在3.92min处出峰，

结论：在该方法条件下，流动相作为溶剂对塞来昔布中对磺酰胺基苯肼盐酸盐的测定有干扰。

 实施例3色谱柱的确定和检测波长

仪器：高效液相色谱仪 Waters e2695-2998，二极管阵列检测器。

色谱柱：Thermo Hypercarb，150mm×4.6mm×3.00μm,十八烷基键合石墨碳为填料。

流速：0.8ml/min  ；

进样量：20μl ；

柱温：35℃；

波长：190~400nm；

流动相：10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇=70:30；

对照溶液的配制：精密称取对磺酰胺基苯肼盐酸盐2mg，至于200ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。精密量取上述溶液5ml至于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

取甲醇，对磺酰胺基苯肼盐酸盐500ng/ml溶液，分别进样记录色谱图。

溶剂峰在3.0min处有较小溶剂峰，对照溶液的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在11.93min处出峰，对照溶液的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在197nm 、217nm、264nm处分别有最大吸收。

结论：在该方法条件下使用十八烷基键合石墨碳为填料的色谱柱，甲醇作为溶剂对磺酰胺基苯肼盐酸盐的测定无干扰，在217nm处对磺酰胺基苯肼盐酸盐紫外吸收最大，故采用在217nm附近的波长检测。

 实施例4检测器和色谱柱的确定。

仪器：高效液相色谱仪 Waters 515-2475，荧光检测器。

色谱柱：Thermo Hypercarb，250mm×4.6mm×5.00μm,  十八烷基键合石墨碳为填料。

进样量：20μl ；

柱温：35℃；

激发波长：210-260nm；发射波长：280nm；

流动相： 10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇（50:50）；

在激发波长：210-260nm；发射波长：280nm；波长条件下进样

对磺酰胺基苯肼盐酸盐10μg/ml溶液，记录色谱图。

溶剂峰在2.3min处有较大吸收，对照溶液的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在11.93min处出峰，对照溶液的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在激发波长220nm处有最大吸收。

在激发波长：220nm；发射波长：260-360nm；波长条件下进样。

对磺酰胺基苯肼盐酸盐10μg/ml溶液，记录色谱图。

溶剂峰在2.3min处有较大吸收，对照溶液的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在11.80min处出峰，对照溶液的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在发射波长280nm处有最大吸收。

在激发波长：220nm；发射波长：280nm；波长条件下进样。

对磺酰胺基苯肼盐酸盐10μg/ml溶液，记录色谱图。

溶剂峰在2.1min处有较大吸收，对照溶液的中对磺酰胺基苯肼盐酸盐在12.2min处出峰，溶剂峰对磺酰胺基苯肼盐酸盐检测没有干扰。

在激发波长：220nm；发射波长：280nm；波长条件下进样。

对磺酰胺基苯肼盐酸盐500ng/ml溶液，记录色谱图。

溶剂峰在2.1min处有较大吸收，对磺酰胺基苯肼盐酸盐在500ng/ml 浓度时低于荧光检测器检测限，荧光检测器检测不到。

 实施例5流动相梯度方式的确定。

仪器：高效液相色谱仪 Waters2695-2998，二极管阵列检测器

色谱柱：Thermo Hypercarb，150mm×4.6mm×3.00μm,  十八烷基键合石墨碳为填料。

流速：0.8ml/min  ；

进样量：20μl ；

柱温：35℃；

波长：220nm；

运行时间：80min；

流动相，流动相A：10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇=50:50；流动相B：甲醇。

梯度表见表1

对照品储备液的配制：精密称取对磺酰胺基苯肼盐酸盐5mg，至于500ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

对照溶液的配制：精密量取对照品储备液0.5ml至于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

原料溶液配制：取塞来昔布原料（批号20110712）约1.5g，精密称定，至于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

取上述溶液分别进样结果，塞来昔布原料在20min以后出峰，对磺酰胺基苯肼在9.6min出峰，塞来昔布和对磺酰胺基苯肼可以完全分离。

实验例6系统适用性实验

仪器：高效液相色谱仪 岛津LC-20AD。

色谱柱：Thermo Hypercarb，150mm×4.6mm×3.00μm,  十八烷基键合石墨碳为填料。

流速：0.8ml/min  ；

进样量：20μl ；

柱温：35℃；

波长：220nm；

运行时间：80min；

流动相，流动相A：10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇（50:50）；流动相B：甲醇；

梯度表见表1

对照品储备液的配制：精密称取对磺酰胺基苯肼盐酸盐5mg，至于500ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

对照溶液的配制：精密量取对照品储备液0.5ml至于10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀即得。

样品溶液配制：取塞来昔布胶囊15粒，至于20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

分别取空白辅料溶液、对照溶液、样品溶液进样，记录色谱图。试验结果见图 1、图 2、图 3。

结果表明，溶剂峰甲醇的保留时间为2.7min、对磺酰胺基苯肼盐酸盐的保留时间为9.5min，塞来昔布的保留时间为32min以后，空白辅料和塞来昔布不干扰待测物的测定。

实验例7系统适用性实验。

 取对照溶液20μl进样，记录色谱图至80min，连续进样6次，计算每次进样各待测物的峰面积,求得相对标准偏差应不大于5.0％，结果见表2。

表2 精密度实验数据表。

结论：试验表明本色谱系统精密度良好。

 实验例8线性和范围。

取浓度为99.897 ng/ml、199.794 ng/ml、299.691 ng/ml、399.588 ng/ml、499.485 ng/ml、599.382 ng/ml 对磺酰胺基苯肼盐酸盐，分别作为20%、40%、60%、80%、100%、120%限度的对照品溶液。按上述测定方法分别测定，记录色谱图，测定峰面积，结果见表。以峰面积值A、对浓度C（ng/ml）进行线性回归，得一直线结果见表3、图4。

表3对磺酰胺基苯肼盐酸盐线性回归数据

 

  对磺酰胺基苯肼盐酸盐的回归方程y=37.908x -634.356，r=0.9982。

结果表明，对磺酰胺基苯肼盐酸盐浓度分别在99.897~599.382ng/ml范围内进样浓度与峰面积值有良好的线性关系。

 实验例9检测限与定量限。

根据检测限计算公式LOD= 3.3 × SD/S，（S ：校正曲线的斜率， SD ：标准曲线的y轴截距的标准差）计算。由线性回归数据计算得对磺酰胺基苯肼盐酸盐检测限浓度为7.6ng/ml。根据定量限计算公式LOQ =10 ×  SD/S，（S ：校正曲线的斜率， SD ： 标准曲线的y轴截距的标准差）计算。由线性回归数据计算得对磺酰胺基苯肼盐酸盐定量限浓度为23.1ng/ml。将对磺酰胺基苯肼盐酸盐稀释至11.988 ng/ml、35.963ng/ml浓度进样，进行验证记录色谱图，结果见表4 。

表4检测限和定量限

结论：对磺酰胺基苯肼盐酸盐检测限浓度为11.988 ng/ml。将对磺酰胺基苯肼盐酸盐稀释至上述浓度进样，RSD值为8.58%，RSD值小于10%。

结论：对磺酰胺基苯肼盐酸盐定量限浓度为35.963ng/ml。将对磺酰胺基苯肼盐酸盐稀释至上述浓度进样，RSD值为4.75%，RSD值小于5%。

实验例10重复性试验 。

按检测方法，对同一批样品（批号120829）5份进行测定，求得相对标准偏差，试验结果表明该法重现性良好，结果见表5

表5重复性试验

 实验例11回收率试验。

分别称取重量约为1.5g的塞来昔布样品和0.45g的辅料，9份于10ml量瓶中，分为3组，每组3份。用分别含有300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml对磺酰胺基苯肼盐酸盐甲醇溶液稀释至刻度，制得相当于含有基因毒杂质60%、80%、100%限度水平的加样回收率溶液，将制备好的上述溶液按正文的方法及上述色谱条件测定。按下式计算回收率。

试验表明该法的准确度良好，结果见表6。

表6对磺酰胺基苯肼盐酸盐回收率试验

 实验例12溶液稳定性

取标准溶液进样，记录色谱图至80min，以上各溶剂完全出峰。分别于0h、4h、6h、2d、4d、6d进样，计算每次进样各溶剂的峰面积,求得相对标准偏差，应不大于5.0％，数据见表 7。

表7  溶液稳定性考察

结论：试验表明对照品溶液在6天内稳定。

实验例13液相色谱条件耐用性，流速变化对分离度的影响。

原始流速为0.8ml/min，将流速变化为0.78ml/min、0.82ml/min。取含有对磺酰胺基苯肼盐酸盐500ng/ml和塞来昔布150mg/ml的混合溶液在系统稳定后分别进样，测试结果见图5 。

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见流速在0.78ml/min～0.82ml/min范围内色谱条件的变化对对磺酰胺基苯肼盐酸盐分离没有影响。

 实验例14液相色谱条件耐用性，流动相比例变化对分离度的影响。

原始流动相A：10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇=50：50，将流动相A为10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇:45：55、10mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇55：45。取含有对磺酰胺基苯肼盐酸盐500ng/ml和塞来昔布150mg/ml的混合溶液在系统稳定后分别进样，测试结果见图6。

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见流动相A比例在45:55～55:45允许范围内变化对对磺酰胺基苯肼盐酸盐样品分离没有影响。

 实验例15液相色谱条件耐用性，进样量变化对分离度的影响。

 原始进样量20μl，将进样量变化为15μl、25μl。取含有对磺酰胺基苯肼盐酸盐500ng/ml和塞来昔布150mg/ml的混合溶液在系统稳定后分别进样，测试结果见图7。

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见进样量在15μl～25μl允许范围内变化对对磺酰胺基苯肼盐酸盐分离没有影响。

 实验例16液相色谱条件耐用性，检测波长变化对分离度的影响。

 原始检测波长：220nm，将检测波长变化为， 218nm、222nm。取含有对磺酰胺基苯肼盐酸盐500ng/ml和塞来昔布150mg/ml的混合溶液在系统稳定后分别进样，测试结果见图8。

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见检测波长在218nm～222nm允许范围内变化对对磺酰胺基苯肼盐酸盐分离没有影响。

 实验例17液相色谱条件耐用性，柱温变化对分离度的影响。

 原始柱温：35℃，将柱温变化为30℃、40℃。取含有对磺酰胺基苯肼盐酸盐500ng/ml和塞来昔布150mg/ml的混合溶液在系统稳定后分别进样测试结果见图9。

结论：按上述色谱条件下测定，均能达到所需的分离效果，可见柱温在30℃～40℃允许范围内变化对对磺酰胺基苯肼盐酸盐分离没有影响。

 上述实施例中，对磺酰胺基苯肼盐酸盐对照品购自日本TOKYO CHEMICAL INDUSTRY CO ；LTD。