一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法

摘要

一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法。本发明公开了一种基于高效液相色谱法(HPLC)测定茶树嫩芽内源激素含量的方法，通过优化流动相组成及浓度、流速，及有机改良剂的添加比例、检测波长等条件，确定HPLC测定茶树嫩芽内源激素含量的最佳色谱条件，考察了该方法的重现性和精密度。本发明方法具有高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，主要解决了在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。

说明书

技术领域

本发明属于林学中树木内源激素技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱法(HPLC)测定茶树顶芽内源激素含量的方法。

背景技术

茶树(Camellia sinensis)在我国栽种历史悠久，是我国南方传统的经济植物(张玉翠，2010)。目前关于茶树的科学研究，多集中在形态指标、光合特性及内在品质等方面。通过分子机理的研究，深入认识植物激素调控茶树生长、发育及其对环境适应的机制，具有重要的科学意义。

植物激素(plant hormone,PH)是指在植物体的某一部位合成，可转移到其他部位，并对植物的生长发育具有显著调节作用的微量有机物，亦称植物天然激素或内源激素。植物内源激素种类多，含量甚微，且易被破坏。它们在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与萌发、植物形态建成以及离体组织培养等方面具有重要作用(Santner A，2009)。茶树作为我国重要的农业经济作物，以采摘幼嫩新梢为主。茶芽的萌发及生长极易受外界环境的影响，这些影响在很大程度上都是通过植物激素直接进行作用的(岳川，2012)。

由于吲哚乙酸和赤霉素都可以与化学试剂反应，生成物在紫外光激发下可以呈现出不同颜色的荧光，因此可用荧光法测定其含量，植物激素的测定还有纸层析、气相色谱(GC)、等方法，但由于分离效率和灵敏度的局限，目前关于植物顶芽和叶片的内源激素测定方法主要为间接酶联免疫吸附法(ELISA)，已有茶树顶芽内源激素测定方法是间接酶联免疫吸附法(ELISA)，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。但需要购买酶联免疫试剂盒，对试验条件高。

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，因其高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，广泛用于各个领域，也是目前用于茶树内源激素测定的重要方法。高效液相色谱法测定快速、高效、高灵敏度、高自动化的特点，但对配制流动相、设置色谱条件要求较高；由于茶树嫩芽中存在茶多酚等多酚类物质生化成分，会对激素的测定造成干扰，因此其样品的前处理与其他品种样品前处理存在差异。目前关于利用高效液相色谱法测定茶树顶芽的内源激素的方法前人研究较少，尚未有相适宜的测定方法研究成果。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种用于HPLC法测定茶树顶芽的内源激素的方法，具有高速、高效、高灵敏度、高自动化的特点。本发明主要解决了在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种茶树嫩芽内源激素含量的测定方法，包括以下步骤：

1)样品收集冷冻与预处理；

2)配置流动相及设置色谱条件；

3)配置标准溶液并建立回归方程；

4)样品待测溶液检测；

所述流动相由甲醇与0.075％冰乙酸溶液组成；所述标准溶液包括IAA标准液、ZT标准液、ABA标准液和GA₃标准液。

进一步的，在本发明中，步骤2)所述色谱条件为流速0.7mL/min，检测波长210nm和254nm，柱温25℃，进样量20μL。

进一步的，在本发明中，步骤2)所述流动相的配置方法为：再将甲醇与0.075％冰乙酸溶液分别进行抽滤及超声波震动30min，按体积比为45:55配制流动相。

进一步的，在本发明中，步骤3)所述标准溶液包括0.1g/L的IAA标准液、0.001g/L的ZT标准液、0.001g/L的ABA标准液和0.01g/L的GA₃标准液。

进一步的，在本发明中，步骤1)所述样品收集冷冻的具体方法为：采集茶树嫩芽样品，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻保存。

进一步的，在本发明中，步骤1)所述样品预处理的具体方法为：

1-1)浸提：称取冷冻的茶树嫩芽样品，加入80％冷甲醇研磨，置于4℃下静置16h后，抽滤得粗提液；

1-2)一次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水相；

1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得水相在37℃下旋转蒸发至溶液体积的1/4至1/5；

1-4)调节pH：将步骤1-3)所得旋蒸浓缩液调节pH至8.0，加入PVP，过滤，用0.3mol/L酒石酸溶液调节pH至3.5；

1-5)二次萃取：将调好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相；

1-6)酯相收集：将步骤1-5)所得酯相在37℃下旋转蒸干，溶解于甲醇，通过0.45μm滤膜抽滤，滤液保存于4℃下棕色瓶中，待测；

1-7)水相收集：将步骤1-5)所得的水相调节pH至8.0，用等量饱和正丁醇萃取得有机相，在60℃下旋转蒸发，溶解于甲醇，离心，滤液保存于4℃下棕色瓶中，待测。

进一步的，在本发明中，所述建立回归方程的具体方法为：在相应的色谱条件下分别测定所述标准溶液，用保留时间对标准溶液进行定性判定；将所述标准液配制成系列浓度梯度的标准混合液并进行检测，以混合标准液峰面积与其质量浓度进行线性回归分析；以峰面积为纵坐标，以各进样浓度为横坐标，得到相应的标准溶液的线性回归方程。

进一步的，在本发明中，所述系列浓度梯度的标准混合溶液的具体配制方法为：根据混合后的标准混合溶液的总体积和其中各组分的最终浓度，得出各标准溶液所需量，将配置好的标准溶液进行混合，制成标准混合溶液后进行检测，根据结果制成标准曲线。

进一步的，在本发明中，样品待测溶液检测后，进行重现性和精密度的检验：取同一批次茶树嫩芽样品待测溶液，加入已知浓度的混合标准溶液后，测定其中的内源激素含量，计算加标回收率。

进一步的，在本发明中，所述标准溶液和样品待测溶液在进行测定前均需用0.45μm滤膜过滤。

有益效果：本发明提供的高效液相色谱法测定茶树顶芽的内源激素的方法，与现有技术相比，本发明解决了在利用高效液相色谱法测定茶树顶芽激素时，探索茶树顶芽样品前处理方法、流动相的选择和色谱条件，对成功利用HPLC测定植物激素提供一种可靠快速方法，并且可快速、准确、同时测定茶树嫩芽的IAA、ZT、ABA和GA₃的含量；进行加标回收率实验，平均回收率为98.91％，符合激素测定要求。

附图说明

图1为本发明方法的流程示意图；

图2为本发明标准样品出峰时间色谱图，其中标明时间的峰从左至右依次为：反玉米素、赤霉素、生长素、脱落酸。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

如图1所示为一种的方法的流程示意图，具体技术方案如下:

实施例

第一步：茶树嫩芽样品收集

经过不同氮肥处理(0.4g/盆、0.8g/盆、1.6g/盆、2.4g/盆)的茶树嫩芽，取一芽两叶，若干，置于液氮中5min后放入冰箱冷冻，于-24℃下冷冻保存。液氮的作用主要固定嫩芽中的内源激素。

第二步：仪器设备与药品准备

(1)仪器设备

10-1000μL DRAGONLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司；

1000mL砂芯过滤装置，天津津腾实验设备有限公司；

QP-01小型真空泵，深圳良谊仪器公司；

DS-5510DTH超声波清洗器，上海奥析科学仪器有限公司；

LC600液相色谱仪，北京莱博泰科仪器股份有限公司。

(2)药品试剂

IAA标准品，SIGMA-ALDRICH，product of USA；

ZT标准品，SIGMA-ALDRICH，product of USA；

ABA标准品，SIGMA-ALDRICH，product of USA；

GA₃标准品，SIGMA-ALDRICH，product of USA；

甲醇，色谱纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

冰乙酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海。

第三步：茶树嫩芽样品的预处理

1-1)浸提：称取1.000g冷冻的茶树嫩芽样品，用10ml 80％冷甲醇研磨并完全转移至玻璃试管，置于4℃下静置16h后，将提取液抽滤，再用10ml 80％冷甲醇重新浸提残渣三次，合并清液得粗提液；

1-2)一次萃取：将步骤1-1)所得粗提液用等量石油醚萃取，弃去醚相，保留水相，重复两次；

1-3)旋转蒸发：将步骤1-2)所得剩余水相在37℃下旋转蒸发至溶液体积的1/4至1/5；

1-4)调节pH：将步骤1-3)所得减压旋蒸浓缩液用0.5mol/L盐酸和0.5mol/L氢氧化钠调节pH至8.0，在其中加入1gPVP，过滤，用0.3mol/L酒石酸溶液将过滤后的溶液调节pH至3.5；

1-5)二次萃取：将调好pH值的溶液用等量乙酸乙酯萃取，收集水相，合并酯相，重复三次；

1-6)酯相收集：将步骤1-5)所得剩余酯相在37℃下旋转蒸干，用甲醇定容至2ml，通过0.45μm滤膜抽滤，滤液保存于4℃下棕色瓶中，待测；得到的是生长素、赤霉素、脱落酸的检测液。

1-7)水相收集：将步骤1-5)所得的水相用0.5mol/L NaOH溶液将PH调至8.0，用等量饱和正丁醇萃取3次，保留有机相，于60℃下旋转蒸干，用甲醇定容至2ml，12000r离心10min，取上清液保存于4℃下棕色瓶中，待测。得到的是玉米素检测液。

第四步：流动相的配置和色谱条件的选择

(1)流动相的配置

使用移液枪准确量取375μL冰乙酸，在500mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线，制成0.075％冰乙酸。将甲醇与0.075％冰乙酸分别抽滤并超声波震动30min，按体积比为45：55配制流动相，

(2)色谱条件的设置

最适色谱条件设置为：以甲醇和0.075％冰乙酸为流动相，检测波长210nm和254nm，流速为0.7mL/min，柱温25℃，进样量为20μL。

第五步：标准溶液配置与线性回归方程的建立

分别准确称取标准品IAA100mg、ZT 1mg、ABA1mg和GA₃10mg，在1000mL棕色容量瓶中用甲醇定容至刻度线，制成0.1g/L的IAA标准液、0.001g/L的ZT标准液、0.001g/L的ABA标准液和0.01g/L的GA₃标准液，即成标准品贮备液；并将标准液配制成系列浓度梯度的标准混合溶液，保存于4℃冰箱中，备用。

将各浓度标准溶液根据混合体积不超过容量瓶刻度为依据进行混合，制成标准混合溶液后进行测定，根据结果制成标准曲线。

分别精密量取1mL IAA、ZT、ABA和GA₃的标准品贮备液，在10mL棕色容量瓶中用甲醇定容至刻度线，过滤、进样并检测，在上述最适色谱条件下分别重复进样6次，以4种混标峰面积与其质量浓度进行线性回归分析；以峰面积为纵坐标，以各进样浓度(mg/L)为横坐标，在EXCEL中进行运算，得到四种激素的线性回归方程及其相关系数，如表1所示。

表1、内源激素在选定色谱条件下的标准曲线

从表1可以看出，各标准样品浓度与其峰面积线性关系良好，相关系数满足分析要求，且决定系数R²均达到了0.99以上。测定结果如附图2所示。

第六步：茶树嫩芽样品含量的测定

将茶树嫩芽样品经过预处理后在确定的色谱条件下进样，在最适色谱条件下，进行测定，将测得的峰面积代入表1回归方程中计算出各激素浓度。每个样品重复进样6次，所得结果为6次平均将测得的峰面积代入回归方程计算出测定值。

实例：每个样品重复进样6次。茶树品种乌牛早的春季嫩芽中，GA₃含量为0.654μg/gFW(鲜重)，ZT含量为0.412μg/g FW，IAA含量为0.585μg/g FW，ABA含量为1.35μg/gFW。

第七步：重现性和精密度的检验

取同一批次茶树顶芽样品贮备液，加混合标准贮备液后，按外标法以峰面积测定4种茶树嫩芽激素含量，计算加标回收率。

取1mL茶树嫩芽样品待测液，分别加入一定体积的标准溶液，测定各激素浓度，根据结果换算成加标样前后各内源激素的质量值。重复6次，计算加标回收率。试验结果见表2，进行加标回收率实验，平均回收率为98.91％，符合激素测定要求。

表2茶树嫩芽内源激素加标回收试验结果

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。