小槐花总黄酮提取物的制备及质量检测方法

摘要

本发明公开了一种从植物小槐花干燥药材经提取、浓缩、分离、干燥而制得的总黄酮提取物，本发明采用紫外—可见分光光度法测定小槐花总黄酮含量，采用高效液相色谱法测定小槐花总黄酮提取物中异柠檬酚的含量；本发明制备方法合理、稳定、可行，耗能低，分析方法淮确、稳定、操作简单，本发明从小槐花中提取总黄酮提取物的提取、分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种从中药植物提取总黄酮的技术领域，具体涉及一种小槐花总黄酮提取物的制备及质量检测方法。

背景技术

天然植物提取物是以植物为原料，按照提取的目的需要，经过物理化学提取分离过程，定向获取和浓集植物中的某一种或多种有效成分，而不改变其有效成分结构而形成的产品。与传统草药和中成药相比，中药提取物至少知道一种或一类有效成分，有明确的定量指标，有害成分大部分被除去，从而在安全性上比传统植物药和中成药大大提高。此外，中药提取物还融合了现代制药新技术，属于新型中药产品，具有广阔的国际市场空间，其产业化有良好的发展前景，体现了中药产业的技术进步，适应了中药现代化的要求。

小槐花，拉丁学名为Desmodium caudatum (Thunb.) DC. 别名：锐叶小槐花、茉草、抹草、磨草、魅草、巴人草、扁草子、草鞋板、豆子草、逢人打、旱蚂蝗、蚂蝗草、拿身草，中药名：清酒缸，为豆科(蝶形花亚Fabaceae)山蚂蝗属植物，以根或全株人药。原产于生于山谷、草地、林缘和村边，也有少数栽培。分布于安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广西、广东、四川、贵州、云南和西藏等省。小槐花微苦、辛，平。有清热利湿、消积散疲、消肿止痛之功效，用于感冒发烧，肠胃炎，痢疾，小儿疳积，风湿关节痛；外用治毒蛇咬伤，痈疖疔疮，乳腺炎。

山蚂蝗属植物小槐花是广西壮族和西南民族等地区特有的一味重要的民族药，具有清热解毒，祛风利湿之功效，用于复方中药治疗胃肠道疾病有较好的疗效。小槐花醇提物能有效延长小鼠的睡眠时间；明显减少醋酸所致小鼠扭体次数；降低小鼠血清MDA含量，提高SOD活力；显著提高单核巨噬细胞吞噬指数，说明小槐花具有较好的镇静催眠、镇痛、抗氧化和免疫增强等作用。【题名】小槐花醇提物药理作用研究【作者】李燕婧，钟正贤，卢文杰，广西中医药研究院【刊名】云南中医中药杂志，2013，34（5）：64-65.小槐花水提物能明显促进小鼠睡眠并延长其睡眠时间，减少醋酸所致的小鼠扭体反应次数，能提高单核巨噬细胞吞噬指数，降低小鼠血清MDA含量，同时提高SOD活性。小鼠最大给药量为220.5g生药/kg；结论：提示小槐花水提物具有明显的镇静催眠，镇痛，免疫增强和抗氧化作用，且毒性较低。【题名】小槐花水提物药理作用研究【作者】李燕婧，钟正贤，卢文杰，广西中医药研究院【刊名】中医药导报，2013，19（4）：76-78.目前的研究发现小槐花的原植物中，含有一定的黄酮类、多生物碱类、酚类和醇类成分等，其中黄酮类物质是植物中的主要成分；小槐花提取物中的多种黄酮类成分具有抗肿瘤作用。通过流式细胞术PI染色法、Western Blotting研究发现，三个活性黄酮化合物化合物7、lO、1l在50斗M浓度条件下对A43 1人上皮癌细胞有明显的G1／S期阻滞现象，显著抑制G1期相关蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1，且新黄酮化合物11抑制最为显著；通过进一步计算机模拟对接发现，三个活性黄酮化合物7、10、11能够与CDK4蛋白很好的模拟对接；这些结果说明小槐花发挥抗癌活性功能的主要物质基础可能为黄酮类化合物，这些黄酮化合物通过抑制细胞周期Gl期相关蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1，进而发挥抗癌功能(吴瑶.小槐花抗肿瘤活性成分研究[D].厦门：厦门大学，2012.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法合理、稳定、生产周期短，适合工业化生产的小槐花总黄酮提取物的制备及其质量检测方法。

本发明是这样实现的：

本发明小槐花总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）取小槐花干燥药材，粉碎，按重量加入9-13倍量体积浓度为60%的乙醇；

（2）加热回流提取2次，每次2-3小时，提取液滤过，合并滤液；

（3）滤液回收乙醇，浓缩得浓缩液，浓缩液:原药材的质量比为1.7:1-2.3:1，浓缩液过聚酰胺柱分离,聚酰胺柱中聚酰胺的体积与浓缩液的体积比为1:1，然后先用聚酰胺体积3-5倍量的20-40%的乙醇洗脱，弃去20-40%乙醇洗脱液，再用聚酰胺体积5-7倍量的65-85%乙醇洗脱，收集65-85%乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得小槐花总黄酮粗品；

（4）将步骤（3）中得到的小槐花总黄酮粗品加甲醇溶解，然后加入小槐花总黄酮粗品总重1-1.5倍的硅胶拌样，干燥，拌样后样品备用；取小槐花总黄酮粗品总重80-120倍的柱层析硅胶以乙酸乙酯为溶剂湿法装柱，取拌样后样品加乙酸乙酯湿法上样，先采用乙酸乙酯洗脱,乙酸乙酯:柱层析硅胶的质量比为4:1-6:1、再用体积比为1:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱，乙酸乙酯-甲醇:柱层析硅胶的质量比为7:1-10:1，分段收集洗脱液，每份洗脱液：原药材的质量比为1:1.5-1:2.5，洗脱液采用薄层色谱检视，合并检视到有黄酮类成分的洗脱液，回收溶剂，干燥，即得小槐花总黄酮提取物。

所述的小槐花总黄酮提取物的质量检测方法中总黄酮的含量测定包括以下步骤：

（1）仪器与试剂：

仪器：紫外-可见分光光度仪

试剂：芦丁对照品，甲醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠。

 (2)溶液制备

A、对照品贮备液的制备：精密称取芦丁对照品适量，加甲醇制成每lmL含O.2mg的溶液，即得；

B、标准曲线的绘制：分别准确吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置于25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6min；加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6min；加4％氢氧化钠溶液10.0ml，再加水至刻度，混匀，放置15min，摇匀；于500nm波长处测定吸收度，以对照品吸收度值(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程；A=10.829C+0.6728，相关系数γ=0.9989；

C、供试品溶液制备：精密称取样品30mg，置50mL 量瓶中，加甲醇40ml，超声使之溶解，冷却至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤即得；

D、空白溶液制备：以相应溶液作为空白；

（3）样品测定

精密吸取供试品溶液2mL，置25mL 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6min；加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6min；加4％氢氧化钠溶液10.0ml，再加水至刻度，混匀，放置15min，摇匀；用紫外-可见分光光度仪于500nm波长处测定吸收度,总黄酮含量以芦丁计算；

（4）结果计算

从回归方程计算供试品溶液中总黄酮的含量，本发明小槐花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算不少于50%。

所述的小槐花总黄酮提取物的质量检测方法中异柠檬酚的HPLC法含量测定包括以下步骤：

（1）仪器与试剂：

仪器：高效液相色谱仪LC-20A（日本岛津公司）；SPD-M20A二极管阵列检测器（日本岛津公司）；SIL-20A自动进样器（日本岛津公司）；CTO-20A柱温箱（日本岛津公司）；LC solution工作站（日本岛津公司）；XS205DU电子天平（梅特勒-托利多公司）；数控超声波清洗器KQ-500DB(昆明市超声仪器有限公司)，分析天平XS205（梅特勒-托利多公司）；

试剂：异柠檬酚对照品，甲醇，磷酸；

（2）溶液制备

A、对照品溶液的制备：准确称取异柠檬酚对照品4.5mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇至近刻度，超声使之溶解，冷却至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为450μg／ml的异柠檬酚对照品贮备溶液。取异柠檬酚对照品贮备溶液2ml，置于10ml容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为90μg／ml的异柠檬酚对照品溶液；

B、供试品溶液制备：精密称取样品0.1g，置10mL 量瓶中，加甲醇至近刻度，超声使之溶解，冷却至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤即得；

（3）样品测定

用高效液相色谱仪LC-20A来测定对照品及样品，色谱条件为：采用ZORBAX Eclipse XBD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-0.2％磷酸水溶液(70:30)，流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm，柱温为35℃，进样量为10μL，理论塔板数按异柠檬酚计不低于3000；

（4）结果计算

根据得到的对照品及样品的色谱图，记录峰面积，采用外标法计算含量；本发明小槐花总黄酮提取物中异柠檬酚的含量不少于5mg/g。

本发明小槐花总黄酮提取物的质量检测方法中包括有总黄酮的含量测定、异柠檬酚测定，测定小槐花总黄酮提取物中异柠檬酚的含量是为了进一步确认提取物中提取的总黄酮的含量，测定得到的异柠檬酚的含量越高，说明从小槐花中提取得到的总黄酮的含量也越高，质量越好。

与现有技术相比，本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

1、本发明从小槐花中制备出含量50%以上的小槐花总黄酮提取物，为药材资源的充分利用及提高其应用价值提供科学的依据。

2、本发明设计合理，制备方法合理、稳定、可行，耗能低，本发明从小槐花中提取总黄酮提取物的提取、分离速度快，生产周期短，适合工业化生产，有很好的应用前景。

3、本发明采用紫外—可见分光光度法直接测定小槐花总黄酮的含量，方法准确、简单，能适应工业生产的需要，可有效的检测小槐花总黄酮提取物的质量。

 4、通过对小槐花总黄酮提取物进行研究，建立了一种小槐花总黄酮提取物的制备及质量检测方法，有利于小槐花相关产品的进一步开发利用。

附图说明

图1是异柠檬酚对照品的液相色谱图；

图2小槐花总黄酮提取物的液相色谱图；

从图1可以看出，柠檬酚对照品中柠檬酚的出峰时间在13.62左右，因此本发明小槐花总黄酮提取物中样品色谱图在13.62这个时间左右出的峰就是异柠檬酚的色谱峰。

具体实施方式

实施例1

一种小槐花总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）取小槐花干燥药材，粉碎，按重量加入9倍量体积浓度为60%的乙醇；

（2）加热回流提取2次，每次2小时，提取液滤过，合并滤液；

（3）滤液回收乙醇，浓缩得浓缩液，浓缩液:原药材的质量比为1.7:1，浓缩液过聚酰胺柱分离,聚酰胺柱中聚酰胺的体积与浓缩液的体积比为1:1，然后先用聚酰胺体积3倍量的20-40%的乙醇洗脱，弃去20-40%乙醇洗脱液，再用聚酰胺体积5倍量的65-85%乙醇洗脱，收集65-85%乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得小槐花总黄酮粗品；

（4）将步骤（3）中得到的小槐花总黄酮粗品加甲醇溶解，然后加入小槐花总黄酮粗品总重1倍的硅胶拌样，干燥，拌样后样品备用；取小槐花总黄酮粗品总重80倍的柱层析硅胶以乙酸乙酯为溶剂湿法装柱，取拌样后样品加乙酸乙酯湿法上样，先采用乙酸乙酯洗脱,乙酸乙酯:柱层析硅胶的质量比为4:1、再用体积比为1:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱，乙酸乙酯-甲醇:柱层析硅胶的质量比为7:1，分段收集洗脱液，每份洗脱液：原药材的质量比为1:1.5，洗脱液采用薄层色谱检视，合并检视到有黄酮类成分的洗脱液，回收溶剂，干燥，即得小槐花总黄酮提取物；测定，计算，小槐花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为52.18%，小槐花总黄酮提取物中异柠檬酚的含量8.38 mg/g。

实施例2

一种小槐花总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）取小槐花干燥药材，粉碎，按重量加入11倍量体积浓度为60%的乙醇；

（2）加热回流提取2次，每次2.5小时，提取液滤过，合并滤液；

（3）滤液回收乙醇，浓缩得浓缩液，浓缩液:原药材的质量比为2.0:1，浓缩液过聚酰胺柱分离,聚酰胺柱中聚酰胺的体积与浓缩液的体积比为1:1，然后先用聚酰胺体积4倍量的20-40%的乙醇洗脱，弃去20-40%乙醇洗脱液，再用聚酰胺体积6倍量的65-85%乙醇洗脱，收集65-85%乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得小槐花总黄酮粗品；

（4）将步骤（3）中得到的小槐花总黄酮粗品加甲醇溶解，然后加入小槐花总黄酮粗品总重1.2倍的硅胶拌样，干燥，拌样后样品备用；取小槐花总黄酮粗品总重100倍的柱层析硅胶以乙酸乙酯为溶剂湿法装柱，取拌样后样品加乙酸乙酯湿法上样，先采用乙酸乙酯洗脱,乙酸乙酯:柱层析硅胶的质量比为5:1、再用体积比为1:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱，乙酸乙酯-甲醇:柱层析硅胶的质量比为8:1，分段收集洗脱液，每份洗脱液：原药材的质量比为1:2.0，洗脱液采用薄层色谱检视，合并检视到有黄酮类成分的洗脱液，回收溶剂，干燥，即得小槐花总黄酮提取物；测定，计算，小槐花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为53.25%，小槐花总黄酮提取物中异柠檬酚的含量10.35 mg/g。

实施例3

一种小槐花总黄酮提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）取小槐花干燥药材，粉碎，按重量加入13倍量体积浓度为60%的乙醇；

（2）加热回流提取2次，每次3小时，提取液滤过，合并滤液；

（3）滤液回收乙醇，浓缩得浓缩液，浓缩液:原药材的质量比为2.3:1，浓缩液过聚酰胺柱分离,聚酰胺柱中聚酰胺的体积与浓缩液的体积比为1:1，然后先用聚酰胺体积5倍量的20-40%的乙醇洗脱，弃去20-40%乙醇洗脱液，再用聚酰胺体积7倍量的65-85%乙醇洗脱，收集65-85%乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得小槐花总黄酮粗品；

（4）将步骤（3）中得到的小槐花总黄酮粗品加甲醇溶解，然后加入小槐花总黄酮粗品总重1.5倍的硅胶拌样，干燥，拌样后样品备用；取小槐花总黄酮粗品总重120倍的柱层析硅胶以乙酸乙酯为溶剂湿法装柱，取拌样后样品加乙酸乙酯湿法上样，先采用乙酸乙酯洗脱,乙酸乙酯:柱层析硅胶的质量比为6:1、再用体积比为1:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱，乙酸乙酯-甲醇:柱层析硅胶的质量比为10:1，分段收集洗脱液，每份洗脱液：原药材的质量比为1:2.5，洗脱液采用薄层色谱检视，合并检视到有黄酮类成分的洗脱液，回收溶剂，干燥，即得小槐花总黄酮提取物；测定，计算，小槐花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为56.03%，小槐花总黄酮提取物中异柠檬酚的含量10.06 mg/g。

小槐花总黄酮提取物的质量检测方法：

本发明小槐花总黄酮提取物的质量检测方法中总黄酮的含量测定包括以下步骤：

（1）仪器与试剂：

仪器：紫外-可见分光光度仪

试剂：芦丁对照品，甲醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠。

(2)溶液制备

A、对照品贮备液的制备：

准确称取芦丁对照品10.0mg，置于50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超声使之溶解，冷却至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.2mg／ml的芦丁对照品溶液；

B、标准曲线的绘制：分别准确吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml，分别置于25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6min；加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6min；加4％氢氧化钠溶液10.0ml，再加水至刻度，混匀，放置15min，摇匀；于500nm波长处测定吸收度，以对照品吸收度值(A)对浓度(C)进行线性回归，得回归方程；A=10.829C+0.6728，相关系数γ=0.9989；

C、供试品溶液制备：精密称取样品30mg，置50mL 量瓶中，加甲醇40ml，超声使之溶解，冷却至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤即得；

D、空白溶液制备：以相应溶液作为空白；

（3）样品测定

精密吸取供试品溶液2mL，置25mL 量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1.0ml，混匀，放置6min；加10％硝酸铝溶液1.0ml，摇匀，放置6min；加4％氢氧化钠溶液10.0ml，再加水至刻度，混匀，放置15min，摇匀；用紫外-可见分光光度仪于500nm波长处测定吸收度,总黄酮含量以芦丁计算；

（4）结果计算

从回归方程计算供试品溶液中总黄酮的含量，本发明小槐花总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算不少于50%。

所述的小槐花总黄酮提取物的质量检测方法中异柠檬酚的HPLC法含量测定包括以下步骤：

（1）仪器与试剂：

仪器：高效液相色谱仪LC-20A（日本岛津公司）；SPD-M20A二极管阵列检测器（日本岛津公司）；SIL-20A自动进样器（日本岛津公司）；CTO-20A柱温箱（日本岛津公司）；LC solution工作站（日本岛津公司）；XS205DU电子天平（梅特勒-托利多公司）；数控超声波清洗器KQ-500DB(昆明市超声仪器有限公司)，分析天平XS205（梅特勒-托利多公司）；

试剂：异柠檬酚对照品，甲醇，磷酸；

（2）溶液制备

A、对照品溶液的制备：准确称取异柠檬酚对照品4.5mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇至近刻度，超声使之溶解，冷却至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为450μg／ml的异柠檬酚对照品贮备溶液。取异柠檬酚对照品贮备溶液2ml，置于10ml容量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，得浓度为90μg／ml的异柠檬酚对照品溶液；

B、供试品溶液制备：精密称取样品0.1g，置10mL 量瓶中，加甲醇至近刻度，超声使之溶解，冷却至室温，以甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤即得；

（3）样品测定

用高效液相色谱仪LC-20A来测定对照品及样品，色谱条件为：采用ZORBAX Eclipse XBD-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-0.2％磷酸水溶液(70:30)，流速为1.0 mL/min，检测波长为270 nm，柱温为35℃，进样量为10μL，理论塔板数按异柠檬酚计不低于3000；

（4）结果计算

根据得到的对照品及样品的色谱图，记录峰面积，采用外标法计算含量；本发明小槐花总黄酮提取物中异柠檬酚的含量不少于5mg/g。