小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法

摘要

本发明涉及一种小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法，该方法包括以下步骤：⑴心尖灌流替换血液：取小鼠一只麻醉后进行缓慢心尖灌流，待肝脏呈灰白色时停止并取出脑组织；⑵蛋白提取：将脑组织研磨成粉末状后加入预冷的Tris缓冲液，经超声处理、摇床孵育、离心得蛋白提取液Ⅰ；⑶热处理增加蛋白溶解性：将蛋白提取液Ⅰ与热处理液混合后处理5min，经离心得蛋白提取液Ⅱ；⑷沉淀去脂：将蛋白提取液Ⅱ加入到预冷的去脂沉淀液CUS中，经沉淀、离心、洗涤、吹干，即得纯化蛋白粉末；⑸蛋白重溶：将纯化蛋白粉末加入到尿素蛋白裂解液中，经离心得蛋白质组样品。本发明可经济、高效去除小鼠脑组织血液、脂类影响，并增加蛋白样品溶解性。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白组学研究领域，尤其涉及小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法。

背景技术

生命科学研究已经进入生命整体水平研究的组学时代，随着基因组学研究的展开，研究者发现，基因作为遗传信息的载体只能决定生命体的基本形式，现在获得的基因组知识还不能告诉我们基因在生命体中的作用和如何发挥作用，而基因表达的产物蛋白质是生命功能的真正执行体，因此要想深入了解基因及功能还需要从蛋白质水平进行诠释和解读。但基因和蛋白质表达量并不存在严格的线性关系，蛋白质的表达具有时间和空间的特殊性，其复杂程度和数量远高于基因。生物体内的蛋白质的复杂性大大增加了蛋白质样品制备的难度，因此，蛋白组学研究中以蛋白样品制备最为关键，决定着蛋白质组学研究的成败和结果的好坏。

小鼠是使用量最大、研究最详尽的哺乳类实验动物，广泛用于药物毒性、药物筛选和放射生物学实验，因此，发现小鼠脑组织蛋白质组表达的差异变化是研究药物和放射生物学效应的分子机制的重要途径，可为人类脑组织病变的药物筛选、药物靶标发现、治疗和辐射防护提供研究基础。

目前，小鼠采用劲椎脱臼的方法处死并分离脑组织，然后用生理盐水清洗脑组织以去除血液对脑组织的污染。之后将脑组织与含有高浓度尿素的蛋白裂解液直接混合后进行匀浆，离心后上清即为蛋白质组样品【Yijian Zhanga,Yi-Hsuan Pana,Qiuyuan Yina,et.al.Critical roles of mitochondria in brain activities of torpid Myotis ricketti bats revealed by a proteomic approach.Journal of Proteomics, 2014,105(13):266-284.；María ángeles Peinadoa, Raquel Hernándeza, Juan Peragónb,et.al.Proteomic characterization of nitrated cell targets after hypobaric hypoxia and reoxygenation in rat brain.Journal of Proteomics,2014,109(23):309-321.】。但上述文献公开的方法存在：

⑴无摘取脑组织前去除血液的步骤，样品有血液污染。

上述文献处死小鼠的方法为颈椎脱臼法，然后摘取脑组织并用生理盐水清洗脑组织表面血液，之后进行脑组织蛋白质组蛋白样品的制备。这种方法即使经过多次生理盐水清洗，也只能冲洗脑组织表面的血液，并不能彻底去除脑组织内部的血液。

由于血液中的白蛋白和免疫球蛋白也是蛋白，而且表达丰度非常高，如果不处理干净血液，就会严重污染脑组织的蛋白样品，进行蛋白质组分析时，血液不仅会影响蛋白样品的定量、分离，还会覆盖脑组织中极为重要的低丰度蛋白。蛋白样品制备过程中，也可采用去除血液中白蛋白和免疫球蛋白IgG的试剂盒，但试剂盒价格昂贵，可处理样品体积小，而且处理过程中会造成蛋白丢失。

⑵无对蛋白样品加热增加溶解性的步骤，蛋白提取效率不佳。

蛋白样品在100℃的高温条件下与高浓度SDS缓冲液作用，会增加蛋白的溶解性。但含有尿素的蛋白裂解液的温度却不能超过37℃，否则尿素水解为异氰酸酯，异氰酸酯通过氨基甲酰化（carbamylation）对蛋白质进行修饰，造成人为的“斑点串联”，影响蛋白质样品的分离和鉴定。因此按照该方法，无法对样品进行热处理增溶。

⑶无专门去除脑组织中脂类物质的步骤，导致脂类影响蛋白分离，蛋白质点减少。 

脑组织中含有大量脂类物质，如果不去除脂类物质，进行蛋白质组分析时，粘稠的脂类物质就会堵塞凝胶孔，阻止蛋白进入，造成蛋白质点减少，凝胶背景深等不佳效果。

⑷无去除盐离子的步骤，影响电泳电压。

蛋白质组分析，在等电聚焦电泳步骤，电压最高可达10000v，要达到高电压，就要求溶液中盐离子非常低，否则电压上不去。较低电压会延长等电聚焦时间，造成等电聚焦失败或者降低蛋白分离效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种经济、高效去除小鼠脑组织血液、脂类影响，并增加蛋白样品溶解性的小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法。

为解决上述问题，本发明所述的小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法，包括以下步骤：

⑴心尖灌流替换血液：取小鼠一只，固定四肢，并按照0.03ml/10g~0.05ml/10g腹腔注射质量浓度为10%的水合氯醛；麻醉后剖开胸腔，迅速切开肋骨，剪去隔膜使心脏暴露；然后左心室进针入心室，剪破右心耳，开启蠕动泵，用生理盐水进行缓慢心尖灌流，待肝脏呈灰白色时停止并取出脑组织；

⑵蛋白提取：将所述步骤⑴所得的脑组织放入盛有液氮的研钵中进行研磨，直至脑组织被研磨成粉末状；然后称取0.2~0.5g脑组织粉末转至1.5mlEP离心管中，按照300μl：0.1g的比例向所述EP离心管中加入4℃预冷的pH=8.1、50mM的Tris缓冲液；其次将所述EP离心管放在冰盒中进行超声处理，之后置于摇床上孵育1~2h，期间涡旋3~5次，最后经离心得上清液A，该上清液A即为蛋白提取液Ⅰ；

⑶热处理增加蛋白溶解性：将所述蛋白提取液Ⅰ按照1：1的体积比与SDS浓度为10%的热处理液混合后，在100℃处理5min，最后经离心得上清液B，该上清液B即为蛋白提取液Ⅱ；

⑷沉淀去脂：将所述蛋白提取液Ⅱ加入到其14倍体积的4℃预冷的去脂沉淀液CUS中，4℃沉淀90min，期间涡旋3~5次；然后离心得沉淀物，该沉淀物用4℃预冷的丙酮洗两次；室温下经15min~30min吹干去除丙酮，即得纯化蛋白粉末；

⑸蛋白重溶：将所述纯化蛋白粉末按照1：3的质量体积比加入到尿素蛋白裂解液中，置35℃温箱摇晃1h，经离心得上清液C，该上清液C经蛋白定量后即为蛋白质组样品。

所述步骤⑵中Tris缓冲液是指100ml缓冲液中含有0.1g的十二烷基硫酸钠（SDS）、0.877g的NaCl、1mL的Triton X-100，并按照40μl/ml现加蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor）。

所述步骤⑵中超声处理条件是指功率130W，时间总计140s，其中每超声4s，间歇10s，循环10次。

所述步骤⑵、所述步骤⑶和所述步骤⑸中离心条件均是指温度为4℃，离心力为12000g，时间为15min。

所述步骤⑶中SDS浓度为10%的热处理液是指100ml pH=8.1、50mM的Tris缓冲液溶液中含有10g十二烷基硫酸钠（SDS），并按照0.03g/ml现加二硫苏糖醇（DTT）。

所述步骤⑷中离心条件是指温度为4℃，离心力为8000g，时间为30min。

所述步骤⑷中去脂沉淀液CUS是由磷酸三丁酯（tri-n-butylphosphate）：丙酮（Acteon）：甲醇（Methanol）按照体积比为1：12：1配制而成。

所述步骤⑸中尿素蛋白裂解液是指10ml溶液中含有4.2g的尿素（Urea）、1.52g的硫脲（Thiourea）、0.4g的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）；并按照0.098g/ml现加二硫苏糖醇（DTT），按照5μl/ml分别现加Bio-Lyte pH4-6和Bio-Lyte pH6-8，按照40μl/ml现加蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor）。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明摘取小鼠脑组织前，经过生理盐水替换血液，彻底去除了脑皮层血管内的血液，减少了高丰度白蛋白和免疫球蛋白对蛋白组样品的影响，避免了劲椎脱臼法不能有效去除血管中血液中的弊端。

2、本发明在蛋白提取中，脑组织放入盛有液氮的研钵中进行研磨，细胞破碎时会释放出蛋白酶造成蛋白被降解，而液氮低温速冻能有效抑制蛋白酶的活性，确保蛋白质保持完整结构。同时加入的Tris缓冲液使用低浓度SDS有效避免了细胞裂解过程中大量粘稠性的核酸的影响。

3、本发明在热处理增加蛋白溶解性过程中，采用高浓度的SDS高温处理蛋白提取液，SDS断裂了蛋白分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二级和三级结构，取消了蛋白的疏水作用，多肽的二级结构被破坏，极大地增加了蛋白的溶解性，同时又避免高温处理后尿素对蛋白的修饰。

4、本发明去脂液沉淀蛋白不仅能有效去除脂类物质，同时去除了盐离子、多余SDS和其它影响电泳的杂质，保证了蛋白样品的纯度和浓度。相比去除盐离子和浓缩蛋白的TAC/aceton沉淀法需要12小时以上，去脂液沉淀只需1.5h，提高了效率，节省了时间。

5、本发明获得的蛋白质组样品可用于蛋白质组双向电泳，且可以获得分辨率高、清晰度好的双向电泳蛋白图谱（参见图1），有利于差异蛋白的分析。

具体实验步骤和参数设置如下：

①第一向等电聚焦： IPG胶条：17cm，pH4-7，上样450μl含500μg蛋白。胶条在20℃水化16h后进行等电聚焦，等电聚焦程序为：200v，1h；500v，1h；1000v，1h；10000v，5h，10000v，直至聚焦80000Volr Hr。

②第二向SDS-PAGE电泳：胶条分别用10ml含0.2gDTT（二硫苏糖醇）的平衡液和10ml含0.25gIAA（碘乙酰胺）的平衡液各平衡15min后，用低熔点琼脂糖固定于SDS-PAGE凝胶顶部进行SDS-PAGE电泳，参数为：5mA/Gel，30min；205mA/Gel，直至溴酚蓝指示剂达到凝胶底部边缘。

③胶体考马斯亮蓝染色：固定过夜；水洗4次，各15min；染色过夜；脱色直至蛋白质点清晰为止。

④进行图像获取和图像分析。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明双向电泳后所得蛋白电泳图谱。

具体实施方式

小鼠脑组织蛋白质组分析的样品制备方法，包括以下步骤：

⑴心尖灌流替换血液：取小鼠一只，固定四肢，并按照0.03ml/10g~0.05ml/10g腹腔注射质量浓度为10%的水合氯醛；麻醉后剖开胸腔，迅速切开肋骨，剪去隔膜使心脏暴露；然后左心室进针入心室，剪破右心耳，开启蠕动泵，用生理盐水进行缓慢心尖灌流，待肝脏呈灰白色时停止并取出脑组织。

⑵蛋白提取：将步骤⑴所得的脑组织放入盛有液氮的研钵中进行研磨，直至脑组织被研磨成粉末状；然后称取0.2~0.5g脑组织粉末转至1.5mlEP离心管中，按照300μl：0.1g的比例向EP离心管中加入4℃预冷的pH=8.1、50mM的Tris缓冲液；其次将EP离心管放在冰盒中进行超声处理，之后置于摇床上孵育1~2h，期间涡旋3~5次，最后经离心得上清液A，该上清液A即为蛋白提取液Ⅰ。

其中：Tris缓冲液是指100ml缓冲液中含有0.1g的十二烷基硫酸钠（SDS）、0.877g的NaCl、1mL的Triton X-100，并按照40μl/ml现加蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor）。

超声处理条件是指功率130W，时间总计140s，其中每超声4s，间歇10s，循环10次。

离心条件均是指温度为4℃，离心力为12000g，时间为15min。

⑶热处理增加蛋白溶解性：将蛋白提取液Ⅰ按照1：1的体积比与SDS浓度为10%的热处理液混合后，在100℃处理5min，最后经离心得上清液B，该上清液B即为蛋白提取液Ⅱ。

其中：SDS浓度为10%的热处理液是指100ml pH=8.1、50mM的Tris缓冲液溶液中含有10g十二烷基硫酸钠（SDS），并按照0.03g/ml现加二硫苏糖醇（DTT）。

离心条件均是指温度为4℃，离心力为12000g，时间为15min。

⑷沉淀去脂：将蛋白提取液Ⅱ加入到其14倍体积的4℃预冷的去脂沉淀液CUS中，4℃沉淀90min，期间涡旋3~5次；然后离心得沉淀物，该沉淀物用4℃预冷的丙酮洗两次；室温下经15min~30min吹干去除丙酮，即得纯化蛋白粉末。

其中：去脂沉淀液CUS是由磷酸三丁酯（tri-n-butylphosphate）：丙酮（Acteon）：甲醇（Methanol）按照体积比为1：12：1配制而成。

离心条件均是指温度为4℃，离心力为8000g，时间为30min。

⑸蛋白重溶：蛋白重溶：将所述纯化蛋白粉末按照1：3的质量体积比加入到尿素蛋白裂解液中，置35℃温箱摇晃1h，经离心得上清液C，该上清液C经蛋白定量后即为蛋白质组样品。

其中：尿素蛋白裂解液是指10ml溶液中含有4.2g的尿素（Urea）、1.52g的硫脲（Thiourea）、0.4g的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）；并按照0.098g/ml现加二硫苏糖醇（DTT），按照5μl/ml分别现加Bio-Lyte pH4-6和Bio-Lyte pH6-8，按照40μl/ml现加蛋白酶抑制剂（Protease inhibitor）。

离心条件均是指温度为4℃，离心力为12000g，时间为15min。