高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜡中硝基呋喃类代谢物的方法

摘要

本发明涉及一种高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜡中硝基呋喃类代谢物的方法，该方法试样采用正己烷预溶解，酸性水溶液中衍生化，经HLB固相萃取小柱净化，用Agilent Eclipse Plus-C18柱分离，电喷雾离子源正离子多反应监测模式串联质谱进行测定。结果表明，4种硝基呋喃类代谢物在0.5ng/mL-10ng/mL范围内均具有较好的线性关系，相关系数大于0.998。在0.5μg/kg、1.0μg/kg和2.0μg/kg添加水平下，实际样品中4种硝基呋喃类代谢物的回收率在71.8%-119.0%之间，相对标准偏差（RSD，n=6）均小于10%，方法定量限（S/N10）为0.5μg/kg。本方法快速、灵敏、准确，适用于日常蜂蜡样品中4种硝基呋喃类代谢物残留的定性、定量分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定蜂蜡中硝基呋喃类代谢物的方法。

背景技术

蜂蜡是一种由工蜂腹部下面四对蜡腺分泌的物质，其主要成分是烷醇和烷酸形成的酯类等，在化妆品、食品和医药工业上有较广泛的应用。蜂农在养殖过程中使用了硝基呋喃类药物给蜜蜂治病，导致了蜂蜡受到硝基呋喃药物的污染。然而，硝基呋喃类药物由于其对人体潜在的危害性，已经被欧盟严令禁止使用。研究证明硝基呋喃类药物在脊椎动物体内会迅速分解，因此检测该类药物的稳定代谢物的方法已被广泛认可。目前，检测蜂产品、水产品等动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物一般采用液相色谱-质谱联用方法。由于蜂蜡的基质复杂，无法采用国内外已公布的检测蜂蜜、蜂王浆等蜂产品的方法进行检测。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜡中硝基呋喃类代谢物的方法。该法简便、灵敏度高、基质干扰小等优点，可以用于蜂蜡中硝基呋喃代谢物残留的定性和定量分析。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

高效液相色谱串联质谱法测定蜂蜡中硝基呋喃类代谢物的方法，该方法包括以下的步骤：

1）标准工作溶液

呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）、 AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM.HCl-13C-15N2,用甲醇配制成1 mg/mL的单标储备液，根据实际需要用流动性稀释成相应的混合标准工作溶液；

2）样品提取和衍生化

称取试样2.0 g，精确至0.01g，置于50 mL具塞塑料离心管，准确加入0.10 mL混合内标工作溶液涡旋混和后加入10mL正己烷，内标工作溶液的浓度为100 ng/mL，涡旋、超声溶解成乳浊液，再加入10 mL盐酸溶液和0.15 mL2-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀后，置于恒温水浴振荡器中37℃避光振荡16  h；将上述衍生溶液取出放置至室温，6000 r/min离心5 min，取水层；

3）净化

在水溶液中加入适量的2.0 mol/L磷酸氢二钾溶液，调节pH至7.5，倒入Oasis HLB固相萃取柱60 mg ，3 mL，Oasis HLB固相萃取柱使用前先用5 mL甲醇和5 mL水活化，弃去流出液， 5 mL水洗涤，再用5 mL甲醇水溶液淋洗，甲醇水溶液体积比为5/95,抽干，最后用8 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹干；残渣中加入1 mL甲醇/5 mmol/L乙酸铵溶解残渣，甲醇/乙酸铵的体积比为2/8，涡旋混匀，过0.45 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定；

4）色谱条件

色谱柱： Agilent Eclipse Plus-C18柱，100×2.1 mm，3.5 μm；柱温：40℃；进样量：50 μL；流速：0.2 mL/min；流动相：Ａ 为乙腈，Ｂ为5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸；梯度洗脱程序：0～0.5 min,15%A；0.5～5.0 min,15%A～40%A；5.0～9.0 min,40%A～90%A；9.0～11.0 min，90%A；11～11.1min，90%A～15%A；11.1～16.0 min，90%A；

5）质谱条件

扫描方式：正模式扫描；检测方式：多反应监测；干燥气温度（Gas Temp）：325℃;干燥气流量(Gas Flow)：6 L/min;喷雾气压力(Nebulizer)：45 psi；鞘气温度(Sheath Gas Temp)：400℃；鞘气流速(Sheath Gas Flow)：12 L/min；毛细管电压(Capillary)：4000 V；

4种硝基呋喃代谢物的质谱条件：

*定量离子；

6）方法的线性范围和检出限

配制一系列不同浓度的标准工作溶液，0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng /mL, 并依次进样, 分别以测定目标物的峰面积Y 为纵坐标, 以相应的浓度值为横坐标, 作标准曲线,结果表明,4种硝基呋喃代谢物目标物在0. 5~ 10 ng/mL范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数R₂大于0.998。

本发明由于采用了上述的技术方案，优化了提取、净化方法和仪器测定条件等。结果表明，4种硝基呋喃类代谢物在0. 5 ng/mL-10 ng/mL范围内均具有较好的线性关系，相关系数大于0.998。在0.5 μg/kg、1.0 μg/kg和2.0 μg/kg添加水平下，实际样品中4种硝基呋喃类代谢物的回收率在71.8%-119.0%之间，相对标准偏差（RSD，n=6）均小于10%，方法定量限（S/N>10）为0.5 μg/kg。本方法快速、灵敏、准确，适用于日常蜂蜡样品中4种硝基呋喃类代谢物残留的定性、定量分析。

附图说明

图1为蜂蜡中呋喃唑酮的SRM色谱图(添加水平2.0 μg /kg)。

图2为蜂蜡中呋喃它酮的SRM色谱图(添加水平2.0 μg /kg)。

图3为蜂蜡中呋喃西林的SRM色谱图(添加水平2.0 μg /kg)。

图4为蜂蜡中呋喃妥因的SRM色谱图(添加水平2.0 μg /kg)。

具体实施方式

1 实验部分

1.1　仪器与试剂

1260超高效液相色谱-6460三重四极杆串联质谱联用仪（美国Agilent公司）；MS 3 digital漩涡混合器（德国IKA公司）；IKA RV10旋转蒸发仪（德国IKA公司）；Blue pard数显恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司）；N-EVAP-111氮吹仪（美国Organomation公司）；Multifuge X1R离心机（美国Thermo Scientific公司）。

甲醇、正己烷、2-硝基苯甲醛、乙酸铵、甲酸均为色谱纯，磷酸氢二钾均为分析纯;OASIS HLB固相萃取小柱：60 mg，3 mL（美国Waters公司）。

1.2 标准工作溶液

呋喃唑酮代谢物（AOZ）、呋喃它酮代谢物（AMOZ）、呋喃西林代谢物（SEM）、呋喃妥因代谢物（AHD）、 AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3和SEM.HCl-13C-15N2,德国Witega公司（纯度均大于等于98%），用甲醇配制成1 mg/mL的单标储备液，根据实际需要用流动性稀释成相应的混合标准工作溶液。

1.3 样品提取和衍生化

称取试样2.0 g（精确至0.01g），置于50 mL具塞塑料离心管，准确加入0.10 mL混合内标工作溶液(100 ng/mL)涡旋混和后加入10mL正己烷，涡旋、超声溶解成乳浊液，再加入10 mL盐酸溶液和0.15 mL2-硝基苯甲醛溶液，涡旋混匀后，置于恒温水浴振荡器中37℃避光振荡16  h。将上述衍生溶液取出放置至室温，6000 r/min离心5 min，取水层。

1.4  净化

在水溶液中加入适量的2.0 mol/L磷酸氢二钾溶液，调节pH至7.5左右，倒入Oasis HLB固相萃取柱（60 mg ，3 mL，使用前先用5 mL甲醇和5 mL水活化），弃去流出液， 5 mL水洗涤，再用5 mL甲醇水（5/95,V/V）淋洗，抽干，最后用8 mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液，氮气吹干。残渣中加入1 mL甲醇/5 mmol/L乙酸铵（2/8,V/V）溶解残渣，涡旋混匀，过0.45 μm滤膜，供液相色谱串联质谱仪测定。

1.5　色谱条件

色谱柱： Agilent Eclipse Plus-C18柱（100×2.1 mm，3.5 μm）；柱温：40℃；进样量：50 μL；流速：0.2 mL/min。流动相：Ａ 为乙腈，Ｂ为（5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸）。梯度洗脱程序：0～0.5 min,15%A；0.5～5.0 min,15%A～40%A；5.0～9.0 min,40%A～90%A；9.0～11.0 min，90%A；11～11.1min，90%A～15%A；11.1～16.0 min，90%A。

1.6 质谱条件

扫描方式：正模式扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；干燥气温度（Gas Temp）：325℃;干燥气流量(Gas Flow)：6 L/min;喷雾气压力(Nebulizer)：45 psi；鞘气温度(Sheath Gas Temp)：400℃；鞘气流速(Sheath Gas Flow)：12 L/min；毛细管电压(Capillary)：4000 V。

表 1  4种硝基呋喃代谢物的质谱条件

* Quantitative ion

2　结果与讨论

2.1　提取溶剂选择

蜂蜡的主要成分有游离脂肪酸、游离脂肪醇、碳水化合物、类胡萝卜素等，属于脂溶性物质。所以本文采用加入正己烷溶解蜂蜡样品后，再加入盐酸水溶液提取蜂蜡样品中硝基呋喃代谢物。通过回收率试验表明，该方法能有效的提取出蜂蜡中的测定物质。

3.2 净化条件选择

应用高效液相色谱-串联质谱法测定硝基呋喃类代谢物时，提取液需经净化，目前用于硝基呋喃类代谢物净化的主要方法有液液萃取净化法和固相萃取小柱净化法。本文比较了提取液经调解pH后采用15×2 mL乙酸乙酯萃取目标物，然后将乙酸乙酯提取液浓缩至干，采用流动性复溶，离心、过膜，待测定和本文报道的净化方法。

结果表明，液液萃取净化法对AMOZ化合物的净化效果和回收率均不佳。采用HLB固相净化小柱法对硝基呋喃类代谢物的净化效果和回收率均得到满意结果，并且该法较液液萃取净化法具有操作简便，有机溶剂使用量少等特点。因此，本实验选择HLB作为样品前处理净化柱。

2.3　方法的线性范围和检出限

配制一系列不同浓度的标准工作溶液(0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng /mL), 并依次进样, 分别以测定目标物的峰面积Y 为纵坐标, 以相应的浓度值为横坐标, 作标准曲线, 见表2，结果表明,4种硝基呋喃代谢物目标物在0. 5~ 10 ng/mL范围内其浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数R²大于0.998。

在阴性样品中添加目标化合物，按照本文的方法测定，10倍信噪比(S/N)对应的添加水平作为定量限（LOQ），结果见表 2。

表 2  4种硝基呋喃代谢物线性方程、检出限、定量限

2.4　方法的回收率和精密度

在0. 5 μg /kg、1.0 μg /kg和2.0 μg /kg三个添加水平下进行阴性样品中添加标准溶液的方法进行方法回收率试验，每个添加水平重复6次，方法回收率和精密度见表 3。结果表明，4种硝基呋喃代谢物的加标回收率范围在71.8%-119.0%之间，相对标准偏差（RSD）为4.7%-9.8%，表明本文所开发的方法能够满足残留检测的要求。

表 3 阴性样品中目标分析物的添加回收率和精密度（n=6）

2.5 实际样品测定

采用本方法对某网购平台采购的15份和某蜂产品生产企业提供的25份蜂蜡样品中硝基呋喃类代谢物残留量进行测定，结果表明，有4个样品中检出呋喃妥因（AHD）含量在0.9-3.0 ng/g之间；呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）和呋喃西林（SEM）均未检测。

3 结论

本实验采用正己烷预溶解，酸性水溶液中衍生化，HLB固相萃取小柱净化等前处理方法提取净化，超高效液相色谱-串联质谱同位素内标法测定蜂蜡中痕量呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃西林（SEM）、呋喃妥因(AHD)等硝基呋喃代谢物残留量。结果表明，本方法具有简便、灵敏、准确的优点，可以用于蜂蜡中痕量硝基呋喃代谢物残留的定性和定量分析。