基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用

摘要

本发明公开一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用。该方法能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，通过使用如SEQ ID NO.1～198所示的扩增引物进行扩增反应，接着消化反应，再使用如SEQ ID NO.199～297所示的延伸引物进行延伸反应，得到的产物进行MassARRAY质谱平台Iplex分析。依据该方法设计得到一款检测试剂盒，其具有如下优点：紧跟肺癌诊治国际前沿，考虑了欧美人群与亚洲人群基因谱的差异，检测位点多；价格较低；高通量，用时短；检测样本不限；高准确性与高敏感性。因此，该试剂盒在临床上应用推广的潜力大。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测肺癌的检测方法，特别涉及一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因 谱检测方法及试剂盒与应用。

背景技术

肺癌是我恶性肿瘤死亡原因之首，发病率持续上升，健康危害形势严峻，其发生、发展以及治疗与基因变 异关系密切，基于基因变异的“个体化”靶向治疗是继传统放化疗后肿瘤领域的新突破。非小细胞肺癌(NSCLC) 样本中基因靶点变异可从相应的靶向药物治疗中获益，针对EGFR和ALK基因变异的酪氨酸激酶抑制剂(TKI) 吉非替尼(gefitinib)/厄洛替尼(erlotinib)和克佐替尼(crizotinb)等靶向治疗可延长患者的生存期。随着研究 深入，ROS1、RET、ERBB2、STK11等分子变异被逐步确定为肺癌的驱动基因(driver gene)，并且新的低频基 因被陆续报道。但是大部分患者在接受靶向治疗后一年左右最终都会对TKI药物耐药。在非小细胞肺癌中，对 EGFR TKI药物Gefitinib/Erlotinib的抗药性分子机理包括EGFR二次变异(T790M、D761Y、L747S、T854A、 G796A和Exon20插入)以及EGFR基因扩增、RAS/RAF基因变异、MAPK1基因扩增、MET基因扩增、HGF/MET 激活、FGF/FGFR激活、PTEN丢失、GAS6/AXL激活、IGFBP3丢失、BRCA1高表达和CRKL基因扩增。在 抗ALK TKI药物Crizotinib的肺癌中，ALK二次突变(L1196M、C1156Y、F1174L、L1152R、G1202R、S1206Y 和1151T插入)及ALK基因扩增、CD74-ROS1融合、KIT基因扩增，EGFR或KRAS变异也被发现。目前本 申请人所在肺癌研究进行的临床试验正在研究MET抑制剂INC280联合EGFR TKI治疗非小细胞肺癌靶向药物 治疗耐药后MET突变的疗效。肿瘤发生发展耐药的多位点变异决定了肿瘤靶点的分子分型、靶向治疗以及耐药 后机制探索的复杂性。

在肺癌的分子分型方面，目前临床单基因检测方法主要有qPCR、测序、FISH及IHC等多平台技术，除了 EGFR、ALK、KRAS等主要基因的检测技术在临床相对成熟之外，ROS1、RET、HER2、NRTK、NRG、RICTOR、 mTOR、LKB1、MET、RIT1A等分子变异的分型在临床主要限制因素有：分析的通量化(high throughput)不 够成熟和生物材料的有限性获得(limited procurement)。临床上肺癌早期患者接受手术(大手术或小手术活检) 具有充足的组织，晚期患者通常通过经皮肺穿刺、支气管镜活检、支气管内超声穿刺活检等获得只是少量标本。 这些小标本为了满足现有的临床病理诊断和个别基因的分子检测，很难有剩余材料进一步用于其他重要分子分 型(molecular classification/genotying)、药物耐药机制等分析。可见肿瘤样本的匮乏、低通量、耗时性以及价格 昂贵等是制约临床多次单个基因检测开展的瓶颈。

肿瘤发生发展、靶向治疗后耐药以及转移机制等分子靶点的复杂性分析，以及对肺癌患者样本多靶点变异 基因进行单基因检测的局限性，决定了在临床转化医学研究中开展多基因检测平台的必要性与紧迫性。 MassARRAY分子量阵列技术通过扩增延伸反应与质谱相结合实现基因的分型检测，基于此平台的Iplex技术可 基于96/384孔板开展多基因检测，操作程序简单，分型结果具有质谱的高准确性和敏感性。LungCarta试剂盒 是MassARRAY公司研发主要针对肺癌靶向基因检测的试剂盒，已在肺癌领域广泛应用，包含26个癌症相关基 因的214个突变位点。本发明申请人已经使用LungCarta试剂盒对肺癌患者组织样本进行多基因多位点的高通 量检测，检测样本目前已达到100多例，可明显提高临床检测效率，改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长， 操作繁琐等劣势，为肺癌患者的临床靶向治疗以及耐药后治疗、以及生物标志物转化医学研究提供更全面的依 据。但是由于该试剂盒为国外研发，技术信息保密，价格昂贵，且未完全包括前沿分子靶点如原发MET基因变 异与EGFR TKI的靶向治疗耐药相关、ALK基因的多个位点突变与Crizotinib的靶向治疗耐药相关等，以及中 美地区驱动基因谱具有差异性等特点，因此研发适合中国人群的多基因同步检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌 基因谱检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，是通过上述检测方 法设计得到。

本发明的再一目的在于提供上述试剂盒的应用

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法， 能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，包括如下步骤：

(1)设计如表1所示的扩增引物和如表2所示的延伸引物；

(2)将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为P1-F和P1-R为第1组，扩增引物名称末 尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将分组后的扩增引物混合，得到12管扩增引物混合液；将如 表2所示的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为E1的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物 名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，得到11管延伸引物混合物和1管单独延伸 引物，共计12管；

(3)以人肺组织基因组为模板，将12管扩增引物混合液分别进行PCR，获得PCR产物；

(4)将步骤(3)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；

(5)将步骤(4)消化后的产物进行延伸反应：12管扩增引物得到的产物分别对应12管延伸引物，P1对 应E1，以此类推；

(6)在96孔板或384孔板将步骤(5)延伸反应后得到的产物、清洁树脂和水混合；旋转96孔板或384 孔板进行脱盐去离子防干扰处理；接着离心；对上清进行分析；

(7)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫描结果以 Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。

表1 扩增引物

引物名称 引物序列(5’-3’) EGFR_p.L747_T751delLREAT-P1-F ACGTTGGATGTCTGGATCCCAGAAGGTGAG EGFR_p.L747_T751delLREAT-P1-R ACGTTGGATGTCGAGGATTTCCTTGTTGGC FGFR1_p.S125P-P1-F ACGTTGGATGTTCTTCCCATAGATGCTCTC FGFR1_p.S125P-P1-R ACGTTGGATGGCATACGGTTTGGTTTGGTG STK11_p.F354L-P1-F ACGTTGGATGTGACTGTGGTGCCGTACTTG STK11_p.F354L-P1-R ACGTTGGATGTCCTGAGTGTAGATGATGTC PTEN_p.R130G-P1-F ACGTTGGATGGCAGCAATTCACTGTAAAGC PTEN_p.R130G-P1-R ACGTTGGATGCCCGATGTAATAAATATGCAC FGFR2_p.C382Y-P1-F ACGTTGGATGTTACAGCTTCCCCAGACTAC FGFR2_p.C382Y-P1-R ACGTTGGATGCCACCATACAGGCGATTAAG ALK_p.F1174ILV-P1-F ACGTTGGATGTTGGTTACATCCCTCTCTGC ALK_p.F1174ILV-P1-R ACGTTGGATGATTGCAGGCTCACCCCAATG ERBB2_p.V777LM-P1-F ACGTTGGATGTTGTCCCCAGGAAGCATACG ERBB2_p.V777LM-P1-R ACGTTGGATGAGAAGGCGGGAGACATATGG FGFR2_p.A648D-P1-F ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG FGFR2_p.A648D-P1-R ACGTTGGATGGCCATCGACTTACATTGGTG KRAS_p.G13CRS-P1-F ACGTTGGATGAGGCCTGCTGAAAATGACTG KRAS_p.G13CRS-P1-R ACGTTGGATGGCTGTATCGTCAAGGCACTC BRAF_p.V600ED-P1-F ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG BRAF_p.V600ED-P1-R ACGTTGGATGTGATGGGACCCACTCCATCG PIK3CA_p.E542KQ-P2-F ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC PIK3CA_p.E542KQ-P2-R ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC ALK_p.F1174L-P2-F ACGTTGGATGTTGGTTACATCCCTCTCTGC ALK_p.F1174L-P2-R ACGTTGGATGATTGCAGGCTCACCCCAATG FGFR2_p.S252W-P2-F ACGTTGGATGTTCTTCCCTCTCTCCACCAG FGFR2_p.S252W-P2-R ACGTTGGATGACAAACTCTACGTCTCCTCC EGFR_p.L747_A750>P-P2-F ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC EGFR_p.L747_A750>P-P2-R ACGTTGGATGTTCCTTGTTGGCTTTCGGAG BRAF_p.V600KR-P2-F ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG BRAF_p.V600KR-P2-R ACGTTGGATGTGATGGGACCCACTCCATCG EGBB2_p.V842I-P2-F ACGTTGGATGGATGAGCTACCTGGAGGATG EGBB2_p.V842I-P2-R ACGTTGGATGACATGGTTGGGACTCTTGAC FGFR3_p.G370C-P2-F ACGTTGGATGCTCAACGCCCATGTCTTTGC FGFR3_p.G370C-P2-R ACGTTGGATGAGCTGAGGATGCCTGCATAC PTEN_p.R173H-P2-F ACGTTGGATGTCTGTCCACCAGGGAGTAAC PTEN_p.R173H-P2-R ACGTTGGATGGTGCCACTGGTCTATAATCC BRAF_p.G469R-P2-F ACGTTGGATGGGGACTCGAGTGATGATTGG BRAF_p.G469R-P2-R ACGTTGGATGCATGCCACTTTCCCTTGTAG ALK_p.G1269A-P2-F ACGTTGGATGAGAAACTGCCTCTTGACCTG ALK_p.G1269A-P2-R ACGTTGGATGACTCACCTGTAGATGTCTCG EGFR_p.L747_E749delLRE-P3-F ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC EGFR_p.L747_E749delLRE-P3-R ACGTTGGATGTTCCTTGTTGGCTTTCGGAG ERBB2_p.A775_G776insYVMA-P3-F ACGTTGGATGTCTCAGCGTACCCTTGTCC ERBB2_p.A775_G776insYVMA-P3-R ACGTTGGATGAGAAGGCGGGAGACATATGG ALK_p.F1174SC-P3-F ACGTTGGATGAAGATTTGCCCAGACTCAGC ALK_p.F1174SC-P3-R ACGTTGGATGTGCAGCGAACAATGTTCTGG

ALK_p.R1275QL-P3-F ACGTTGGATGTGGCCAAGATTGGAGACTTC ALK_p.R1275QL-P3-R ACGTTGGATGTGAGGCAGTCTTTACTCACC PTEN_p.R130QPL-P3-F ACGTTGGATGGCAGCAATTCACTGTAAAGC PTEN_p.R130QPL-P3-R ACGTTGGATGCCCGATGTAATAAATATGCAC FGFR2_p.N549H-P3-F ACGTTGGATGGACCTTTCTGATCTGGTGTC FGFR2_p.N549H-P3-R ACGTTGGATGCTACTCACCATCCTGTGTGC PIK3CA_p.E542VAG-P3-F ACGTTGGATGGCAATTTCTACACGAGATCC PIK3CA_p.E542VAG-P3-R ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC FGFR2_p.A648T-P3-F ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG FGFR2_p.A648T-P3-R ACGTTGGATGGCCATCGACTTACATTGGTG AKT_p.E17K-P3-F ACGTTGGATGTCTGACGGGTAGAGTGTGC AKT_p.E17K-P3-R ACGTTGGATGTTCTTGAGGAGGAAGTAGCG MET_p.R988CS-P3-F ACGTTGGATGCCATGATAGCCGTCTTTAAC MET_p.R988CS-P3-R ACGTTGGATGTGAGGAGTGTGTACTCTTGC FGFR3_p.G380R-P4-F ACGTTGGATGATGTCTTTGCAGCCGAGGAG FGFR3_p.G380R-P4-R ACGTTGGATGCAGGATGAACAGGAAGAAGC EGFR_p.E746_T751>A-P4-F ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC EGFR_p.E746_T751>A-P4-R ACGTTGGATGGATTTCCTTGTTGGCTTTCG PIK3CA_p.E545KQ-P4-F ACGTTGGATGTACACGAGATCCTCTCTCTG PIK3CA_p.E545KQ-P4-R ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC FGFR2_p.M640I-P4-F ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG FGFR2_p.M640I-P4-R ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC MET_p.T1010I-P4-F ACGTTGGATGGATAGGCTTGTAAGTGCCCG MET_p.T1010I-P4-R ACGTTGGATGGGAAAAGTAGCTCGGTAGTC FGFR3_p.K650MT-P4-F ACGTTGGATGACGTGCACAACCTCGACTAC FGFR3_p.K650MT-P4-R ACGTTGGATGAGGCGTCCTACTGGCATGA KRAS_p.Q61H-P4-F ACGTTGGATGTGGAGAAACCTGTCTCTTGG KRAS_p.Q61H-P4-R ACGTTGGATGCATGTACTGGTCCCTCATTG FGFR2_p.N549K-P4-F ACGTTGGATGGACCTTTCTGATCTGGTGTC FGFR2_p.N549K-P4-R ACGTTGGATGCTACTCACCATCCTGTGTGC PIK3CA_p.H1047RL-P4-F ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG PIK3CA_p.H1047RL-P4-R ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC BRAF_p.V600ML-P4-F ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG BRAF_p.V600ML-P4-R ACGTTGGATGTGATGGGACCCACTCCATCG ERBB2_p.R678Q-P5-F ACGTTGGATGTCTGCTGGTCGTGGTCTTG ERBB2_p.R678Q-P5-R ACGTTGGATGTCGTGTACTTCCGGATCTTC ERBB2_p.S310FY-P5-F ACGTTGGATGCAACTACCTTTCTACGGAC ERBB2_p.S310FY-P5-R ACGTTGGATGCTGTCACCTCTTGGTTGTGC FGFR2_p.Y375C-P5-F ACGTTGGATGTGTGATCTGCAATCTAGCG FGFR2_p.Y375C-P5-R ACGTTGGATGACAGGCGATTAAGAAGACCC FGFR3_p.R248C-P5-F ACGTTGGATGGGCCCCTGAGCGTCATCT FGFR3_p.R248C-P5-R ACGTTGGATGTTGCAGTGGAACTCCACGTC ALK_p.F1245L-P5-F ACGTTGGATGTGGCTGTCAGTATTTGGAG ALK_p.F1245L-P5-R ACGTTGGATGGAGCACAGTCACTTTGACTC KRAS_p.G13DAV-P5-F ACGTTGGATGGGCCTGCTGAAAATGACTG KRAS_p.G13DAV-P5-R ACGTTGGATGGCTGTATCGTCAAGGCACTC FGFR2_p.M640V-P5-F ACGTTGGATGATCGAGATTTAGCAGCCAG FGFR2_p.M640V-P5-R ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC MET_p.Y1253D-P5-F ACGTTGGATGCTTGCCAGAGACATGTATG MET_p.Y1253D-P5-R ACGTTGGATGTCCAAAGCCATCCACTTCAC EGFR_p.G719SC-P5-F ACGTTGGATGCTCTTGAGGATCTTGAAGG EGFR_p.G719SC-P5-R ACGTTGGATGTTACCTTATACACCGTGCCG BRAF_p.D594GVA-P5-F ACGTTGGATGCTTCATGAAGACCTCACAG BRAF_p.D594GVA-P5-R ACGTTGGATGCCATCGAGATTTCACTGTAG FGFR3_p.S371C-P6-F ACGTTGGATGATGTCTTTGCAGCCGAGGAG FGFR3_p.S371C-P6-R ACGTTGGATGATGAACAGGAAGAAGCCCAC STK11_p.P281L-P6-F ACGTTGGATGTTTGAGAACATCGGGAAGGG STK11_p.P281L-P6-R ACGTTGGATGATGAGGCTCCCACCTTTCAG FGFR3_p.S249C-P6-F ACGTTGGATGTGAGCGTCATCTGCCCCCA

FGFR3_p.S249C-P6-R ACGTTGGATGTTGCAGTGGAACTCCACGTC EGFR_p.E746_S752>V-P6-F ACGTTGGATGTCTGGATCCCAGAAGGTGAG EGFR_p.E746_S752>V-P6-R ACGTTGGATGTCGAGGATTTCCTTGTTGGC FGFR2_p.P253R-P6-F ACGTTGGATGTTCTTCCCTCTCTCCACCAG FGFR2_p.P253R-P6-R ACGTTGGATGACAAACTCTACGTCTCCTCC FGFR2_p.C382R-P6-F ACGTTGGATGTTACAGCTTCCCCAGACTAC FGFR2_p.C382R-P6-R ACGTTGGATGCCACCATACAGGCGATTAAG ALK_p.F1245IV-P6-F ACGTTGGATGGTGGCTGTCAGTATTTGGAG ALK_p.F1245IV-P6-R ACGTTGGATGGAGCACAGTCACTTTGACTC KRAS_p.G12DVA-P6-F ACGTTGGATGAGGCCTGCTGAAAATGACTG KRAS_p.G12DVA-P6-R ACGTTGGATGGCTGTATCGTCAAGGCACTC FGFR2_p.I642V-P6-F ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG FGFR2_p.I642V-P6-R ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC MET_p.N375S-P6-F ACGTTGGATGCCATGTGTGCATTCCCTATC MET_p.N375S-P6-R ACGTTGGATGTGGGTCCGTAAAAATGCTGG EGFR_p.L861Q-P7-F ACGTTGGATGAAACACCGCAGCATGTCAAG EGFR_p.L861Q-P7-R ACGTTGGATGCCTCCTTCTGCATGGTATTC ALK_p.L1196M-P7-F ACGTTGGATGACATTGTTCGCTGCATTGGG ALK_p.L1196M-P7-R ACGTTGGATGTCTCTCGGAGGAAGGACTTG FGFR2_p.K659E-P7-F ACGTTGGATGGACTCGCCAGAGATATCAAC FGFR2_p.K659E-P7-R ACGTTGGATGACTGTGTTACTGCCATCGAC BRAF_p.G469AVE-P7-F ACGTTGGATGGGGACTCGAGTGATGATTGG BRAF_p.G469AVE-P7-R ACGTTGGATGCATGCCACTTTCCCTTGTAG PIK3CA_p.H1047Y-P7-F ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG PIK3CA_p.H1047Y-P7-R ACGTTGGATGTCCATTTTTGTTGTCCAGCC STK11_p.D194YN-P7-F ACGTTGGATGTGTGCACAAGGACATCAAGC STK11_p.D194YN-P7-R ACGTTGGATGCTAGCACGTGCCTACCTCG EGFR_p.L747_P753>S-P7-F ACGTTGGATGGTTAAAATTCCCGTCGCTATC EGFR_p.L747_P753>S-P7-R ACGTTGGATGAGCAGAAACTCACATCGAGG FGFR1_p.S125L-P7-F ACGTTGGATGTTCTTCCCATAGATGCTCTC FGFR1_p.S125L-P7-R ACGTTGGATGGCATACGGTTTGGTTTGGTG PIK3CA_p.E545AGV-P7-F ACGTTGGATGTACACGAGATCCTCTCTCTG PIK3CA_p.E545AGV-P7-R ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC BRAF_p.L597RQP-P7-F ACGTTGGATGTCCTTTACTTACTACACCTC BRAF_p.L597RQP-P7-R ACGTTGGATGCCACTCCATCGAGATTTCAC EGFR_p.E746_A750delELREA-P8-F ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC EGFR_p.E746_A750delELREA-P8-R ACGTTGGATGATTTCCTTGTTGGCTTTCGG FGFR3_p.Y373C-P8-F ACGTTGGATGATGTCTTTGCAGCCGAGGAG FGFR3_p.Y373C-P8-R ACGTTGGATGATGAACAGGAAGAAGCCCAC ALK_p.C1156Y-P8-F ACGTTGGATGCTCTGTAGGCTGCAGTTCTC ALK_p.C1156Y-P8-R ACGTTGGATGCCATGAGGAAATCCAGTTCG KRAS_p.G12CRS-P8-F ACGTTGGATGAGGCCTGCTGAAAATGACTG KRAS_p.G12CRS-P8-R ACGTTGGATGGCTGTATCGTCAAGGCACTC FGFR2_p.Y375H-P8-F ACGTTGGATGCTGTGATCTGCAATCTAGCG FGFR2_p.Y375H-P8-R ACGTTGGATGACAGGCGATTAAGAAGACCC BRAF_p.L597S-P8-F ACGTTGGATGTCCTTTACTTACTACACCTC BRAF_p.L597S-P8-R ACGTTGGATGCCACTCCATCGAGATTTCAC EGFR_p.L858R-P8-F ACGTTGGATGAAACACCGCAGCATGTCAAG EGFR_p.L858R-P8-R ACGTTGGATGCCTCCTTCTGCATGGTATTC PIK3CA_p.E545D-P8-F ACGTTGGATGTACACGAGATCCTCTCTCTG PIK3CA_p.E545D-P8-R ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC ALK_p.F1245C-P8-F ACGTTGGATGGTGGCTGTCAGTATTTGGAG ALK_p.F1245C-P8-R ACGTTGGATGGAGCACAGTCACTTTGACTC FGFR2_p.I642T-P8-F ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG FGFR2_p.I642T-P8-R ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC ERBB2_p.L755S-P9-F ACGTTGGATGTGAAAATTCCAGTGGCCATC ERBB2_p.L755S-P9-R ACGTTGGATGGGGCTTACGTCTAAGATTTC FGFR3_p.G697C-P9-F ACGTTGGATGTGCTCTGGGAGATCTTCACG FGFR3_p.G697C-P9-R ACGTTGGATGTCCTTCAGCAGCTTGAAGAG

EGFR_p.T790M-P9-F ACGTTGGATGATCTGCCTCACCTCCACCGT EGFR_p.T790M-P9-R ACGTTGGATGTGTTCCCGGACATAGTCCAG BRAF_p.V600EAG-P9-F ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG BRAF_p.V600EAG-P9-R ACGTTGGATGTGATGGGACCCACTCCATCG FGFR1_p.T141A-P9-F ACGTTGGATGTCTTCCCATAGATGCTCTCC FGFR1_p.T141A-P9-R ACGTTGGATGGCATACGGTTTGGTTTGGTG FGFR2_p.I642M-P9-F ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG FGFR2_p.I642M-P9-R ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC EGFR_p.L747_S752delLREATS-P9-F ACGTTGGATGTCTGGATCCCAGAAGGTGAG EGFR_p.L747_S752delLREATS-P9-R ACGTTGGATGTCGAGGATTTCCTTGTTGGC EGFR_p.E746_A750delELREA-P10-F ACGTTGGATGTCTCTCTGTCATAGGGACTC EGFR_p.E746_A750delELREA-P10-R ACGTTGGATGATTTCCTTGTTGGCTTTCGG FGFR3_p.K650EQ-P10-F ACGTTGGATGACGTGCACAACCTCGACTAC FGFR3_p.K650EQ-P10-R ACGTTGGATGAGGCGTCCTACTGGCATGA FGFR3_p.A391EV-P10-F ACGTTGGATGGCTTCTTCCTGTTCATCCTG FGFR3_p.A391EV-P10-R ACGTTGGATGAGATCTTGTGCACGGTGGG BRAF_p.D594NH-P10-F ACGTTGGATGTCTTCATGAAGACCTCACAG BRAF_p.D594NH-P10-R ACGTTGGATGCCATCGAGATTTCACTGTAG ERBB2_p.D769YHN-P10-F ACGTTGGATGGAAAACACATCCCCCAAAGC ERBB2_p.D769YHN-P10-R ACGTTGGATGTCCTTCCTGTCCTCCTAGC FGFR1_p.K656E-P10-F ACGTTGGATGACATTCACCACATCGACTAC FGFR1_p.K656E-P10-R ACGTTGGATGTCTCAGATGAAACCACCAGC FGFR2_p.N549S-P11-F ACGTTGGATGGACCTTTCTGATCTGGTGTC FGFR2_p.N549S-P11-R ACGTTGGATGCTACTCACCATCCTGTGTGC EGFR_p.G719DA-P11-F ACGTTGGATGTCTCTTGAGGATCTTGAAGG EGFR_p.G719DA-P11-R ACGTTGGATGTTACCTTATACACCGTGCCG FGFR2_p.M640T-P11-F ACGTTGGATGCATCGAGATTTAGCAGCCAG FGFR2_p.M640T-P11-R ACGTTGGATGGTTGATATCTCTGGCGAGTC BRAF_p.L597V-P11-F ACGTTGGATGTCCTTTACTTACTACACCTC BRAF_p.L597V-P11-R ACGTTGGATGCCACTCCATCGAGATTTCAC PTEN_p.R173C-P11-F ACGTTGGATGTCTGTCCACCAGGGAGTAAC PTEN_p.R173C-P11-R ACGTTGGATGGTGCCACTGGTCTATAATCC EGFR_p.L747_T751delLREAT-P12-F ACGTTGGATGGTTAAAATTCCCGTCGCTATC EGFR_p.L747_T751delLREAT-P12-R ACGTTGGATGCAAAGCAGAAACTCACATCG

表2 延伸引物

引物名称 引物序列(5’-3’) EGFR_p.L747_T751delLREAT-E1 CGTCGCTATCAAGGAAT FGFR1_p.S125P-E1 ATAGATGCTCTCCCCTCC STK11_p.F354L-E1-F TGATGTCATCCTCGATGTC PTEN_p.R130G-E1 CTGTAAAGCTGGAAAGGGA FGFR2_p.C382Y-E1 GCGATTAAGAAGACCCCTATG ALK_p.F1174ILV-E1 TCCCTCTCTGCTCTGCAGCAAA ERBB2_p.V777LM-E1 AGGAAGCATACGTGATGGCTGGT FGFR2_p.A648D-E1 TAGTCTATATTGTTGATATCTCTG KRAS_p.G13CRS-E1 TAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGT BRAF_p.V600ED-E1 TGATGGGACCCACTCCATCGAGATTT PIK3CA_p.E542KQ-E2 CACGAGATCCTCTCTCT ALK_p.F1174L-E2 ACAATGTTCTGGTGGTT FGFR2_p.S252W-E2 AGGATGGGCCGGTGAGGC EGFR_p.L747_A750>P-E2 TCCCGTCGCTATCAAGGAA BRAF_p.V600KR-E2 GACCCACTCCATCGAGATTTC EGBB2_p.V842I-E2 TACCTGGAGGATGTGCGGCTC FGFR3_p.G370C-E2 GCTGGTGGAGGCTGACGAGGCG PTEN_p.R173H-E2 AGTAACTATTCCCAGTCAGAGGC BRAF_p.G469R-E2 CAAAGAATTGGATCTGGATCATTT ALK_p.G1269A-E2 GGCCCTGGAAGAGTGGCCAAGATTG EGFR_p.L747_E749delLRE-E3 CCGTCGCTATCAAGGAA ERBB2_p.A775_G776insYVMA-E3 GGAAGCATACGTGATGGC

ALK_p.F1174SC-E3 TCTCTGCTCTGCAGCAAAT ALK_p.R1275QL-E3 TGGAGACTTCGGGATGGCCC PTEN_p.R130QPL-E3 GCACATATCATTACACCAGTT FGFR2_p.N549H-E3 TGGGAAACACAAGAATATCATA PIK3CA_p.E542VAG-E3 AATCTTTCTCCTGCTCAGTGATT FGFR2_p.A648T-E3 ATGAAAATAGCAGACTTTGGACTC AKT_p.E17K-E3 TCTCACCACCCGCACGTCTGTAGGG MET_p.R988CS-E3 AGGAGTGTGTACTCTTGCATCGTAGC FGFR3_p.G380R-E4 CAGGCATCCTCAGCTAC EGFR_p.E746_T751>A-E4 GTTGGCTTTCGGAGATG PIK3CA_p.E545KQ-E4 TCCTCTCTCTGAAATCACT FGFR2_p.M640I-E4 AGTCCAAAGTCTGCTATTTT MET_p.T1010I-E4 TTCATTTGAAACCATTTCTGTA FGFR3_p.K650MT-E4 GGCCGGGCTCACGTTGGTTGTC KRAS_p.Q61H-E4 GTCCCTCATTGCACTGTACTCCTC FGFR2_p.N549K-E4 ATCCTGTGTGCAGGCTCCAAGAAG PIK3CA_p.H1047RL-E4 CCATTTTTGTTGTCCAGCCACCATGA BRAF_p.V600ML-E4 AAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACA ERBB2_p.R678Q-E5 GATCCTCATCAAGCGAC ERBB2_p.S310FY-E5 GGCAGACGAGGGTGCAG FGFR2_p.Y375C-E5 TAAATGGCTATCTCCAGG FGFR3_p.R248C-E5 ATGGGCCGGTGCGGGGAGC ALK_p.F1245L-E5 ACTTTGACTCACCGGTGGAT KRAS_p.G13DAV-E5 CGTCAAGGCACTCTTGCCTACG FGFR2_p.M640V-E5 TTTGGTAACAGAAAACAATGTG MET_p.Y1253D-E5 CACCTGTTTTGTTGTGTACACTAT EGFR_p.G719SC-E5 GAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTG BRAF_p.D594GVA-E5-F GAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAA FGFR3_p.S371C-E6 GATGCCTGCATACACAC STK11_p.P281L-E6 TTCAGCAGGTCAGAGAGC FGFR3_p.S249C-E6 CAGGATGGGCCGGTGCGGG EGFR_p.E746_S752>V-E6 TTTCCTTGTTGGCTTTCGGA FGFR2_p.P253R-E6 GCTTGGAGGATGGGCCGGTGA FGFR2_p.C382R-E6 CTACCTGGAGATAGCCATTTAC ALK_p.F1245IV-E6 GTCAGTATTTGGAGGAAAACCAC KRAS_p.G12DVA-E6 GTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCA FGFR2_p.I642V-E6 GGTAACAGAAAACAATGTGATGAAA MET_p.N375S-E6 TCACATTGTTTTTGTTGACGATCTTG EGFR_p.L861Q-E7 TTTTGGGCTGGCCAAAC ALK_p.L1196M-E7 CCCCCGCCATGAGCTCCA FGFR2_p.K659E-E7 CGACTTACATTGGTGGTCT BRAF_p.G469AVE-E7 CACTTTCCCTTGTAGACTGTT PIK3CA_p.H1047Y-E7 ATGAAACAAATGAATGATGCA STK11_p.D194YN-E7 CCGGTGGCACCCTCAAAATCTCC EGFR_p.L747_P753>S-E7 GAGGATTTCCTTGTTGGCTTTCG FGFR1_p.S125L-E7 GTCATCATCATCATCATCATCCTCC PIK3CA_p.E545AGV-E7 GACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGC BRAF_p.L597RQP-E7 CACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTC EGFR_p.E746_A750delELREA-E8 ATTCCCGTCGCTATCAA FGFR3_p.Y373C-E8 AGCTGAGGATGCCTGCA ALK_p.C1156Y-E8 CAGTTCGTCCTGTTCAGAG KRAS_p.G12CRS-E8 AACTTGTGGTAGTTGGAGCT FGFR2_p.Y375H-E8 GAGATTACAGCTTCCCCAGAC BRAF_p.L597S-E8 AGTAAAAATAGGTGATTTTGGT EGFR_p.L858R-E8 ATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC PIK3CA_p.E545D-E8 GACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTG ALK_p.F1245C-E8 CAGTCACTTTGACTCACCGGTGGATG FGFR2_p.I642T-E8 GGTAACAGAAAACAATGTGATGAAAA ERBB2_p.L755S-E9 AGTGGCCATCAAAGTGT

FGFR3_p.G697C-E9 GGGGGCTCCCCGTACCCCG EGFR_p.T790M-E9 AGCCGAAGGGCATGAGCTGC BRAF_p.V600EAG-E9 GACCCACTCCATCGAGATTTC FGFR1_p.T141A-E9 CGGTTTGGTTTGGTGTTATCTG FGFR2_p.I642M-E9 ATCTCTGGCGAGTCCAAAGTCTGC EGFR_p.L747_S752delLREATS-E9 TTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAA EGFR_p.E746_A750delELREA-E10 TTCCCGTCGCTATCAAG FGFR3_p.K650EQ-E10 CAACCTCGACTACTACAAG FGFR3_p.A391EV-E10 GCGGCAGAGCGTCACAGCC BRAF_p.D594NH-E10 GACCTCACAGTAAAAATAGGT ERBB2_p.D769YHN-E10 CCAAAGCCAACAAAGAAATCTTA FGFR1_p.K656E-E10 TTGTCGGCACTCACGTTGGTTGTCT FGFR2_p.N549S-E11 TGCAGGCTCCAAGAAGA EGFR_p.G719DA-E11 CGTGCCGAACGCACCGGAG FGFR2_p.M640T-E11 TGGTAACAGAAAACAATGTGA BRAF_p.L597V-E11 CAGTAAAAATAGGTGATTTTGGT PTEN_p.R173C-E11 GGGAGTAACTATTCCCAGTCAGAGG EGFR_p.L747_T751delLREAT-E12 CGTCGCTATCAAGGAAT

步骤(2)中所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选为每条扩增引物的浓度为 0.5μM；

步骤(2)中所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：

第1管：如SEQ ID NO.199～SEQ ID NO.208所示的延伸引物的摩尔比为7.04：7.36：8.05：8.30：9.10：9.34： 10.12：10.35：10.91：11.11；

第2管：如SEQ ID NO.209～SEQ ID NO.218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83：7.11：7.84：8.05：8.93： 9.16：9.76：9.94：10.42：10.90；

第3管：如SEQ ID NO.219～SEQ ID NO.228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01：7.74：7.99：8.69：8.96： 9.60：9.84：10.41：10.66：11.20；

第4管：如SEQ ID NO.229～SEQ ID NO.238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89：7.18：7.89：8.55：9.44： 9.58：10.15：10.40：11.02：11.20；

第5管：如SEQ ID NO.239～SEQ ID NO.248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.28：7.59：8.34：8.59： 9.44：9.63：10.30：10.45：11.16；

第6管：如SEQ ID NO.249～SEQ ID NO.258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.67：8.34：8.57：9.31： 9.47：10.03：10.26：10.91：11.11；

第7管：如SEQ ID NO.259～SEQ ID NO.268所示的延伸引物的浓度分别依次为7.05：7.35：8.11：8.95：9.18： 9.80：9.99：10.52：11.01：11.22；

第8管：如SEQ ID NO.269～SEQ ID NO.278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87：7.12：8.09：8.74：9.00： 9.69：10.42：10.65：11.13：11.29；

第9管：如SEQ ID NO.279～SEQ ID NO.285所示的延伸引物的浓度分别依次为7.11：8.04：8.72：8.93：9.63： 10.34：11.10；

第10管：如SEQ ID NO.286～SEQ ID NO.291所示的延伸引物的浓度分别依次为6.90：7.97：8.14：9.11： 9.90：10.74；

第11管：如SEQ ID NO.292～SEQ ID NO.296所示的延伸引物的浓度分别依次为7.10：8.14：9.20：10.09： 10.85；

步骤(2)中所述的延伸引物混合物中的延伸引物的浓度优选为如表3所示；

表3 延伸引物浓度

步骤(3)中所述的PCR的体系优选为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl₂(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM) 0.1μl、PCR酶(5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、人肺组织基因组(10ng/μl)2μl，水补足5μl；

步骤(3)中所述的PCR的条件优选为：94℃2分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环； 72℃5分钟；

步骤(4)中所述的消化的体系为：在PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足 至7μl；

步骤(4)中所述的消化的条件优选为：37℃40分钟，85℃5分钟；

步骤(5)中所述的延伸反应的体系优选为：在消化后得到的产物中加入Typeplex缓冲液(10×)0.2μl、 Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物混合液或单独延伸引物 溶液0.804μl、H₂O补足至9μl；

步骤(5)中所述的延伸反应的条件优选为：94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环﹞， 35个循环；72℃3分钟。

步骤(6)中：当使用96孔板操作时，将延伸反应后的产物9μl、水41μl和清洁树脂(Clean Resin)15mg 混合；当使用384孔板操作时，将延伸反应后的产物9μl、水16μl和清洁树脂6mg混合；

步骤(6)中所述的脱盐去离子防干扰处理的时间优选为30～60分钟；

步骤(6)中所述的离心的条件优选为3200g离心5分钟。

一种基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，为依据上述基于MassARRAY质谱平台的肺癌 基因谱检测试剂盒设计得到，能检测肺癌13种驱动和耐药相关基因的99种热点变异位点，包含如表1所示的 扩增引物和表2所示的延伸引物：

所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒，优选包含12管扩增引物混合物、11管延伸 引物混合物和1管单独延伸引物；扩增引物名称末尾为P1-F和P1-R的引物混合得到第1管引物混合物，扩增 引物名称末尾为P2-F和P2-R的引物混合得到第2管引物混合物，类推，为12管；按表2中的延伸引物进行分 组，延伸引物名称末尾为E1的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物，延伸引物名称末尾为E2的延伸引物 混合得到第2管延伸引物混合物，类推，为12管；

所述的扩增引物混合物中的扩增引物优选为按等摩尔比混合；更优选为每条扩增引物的浓度为0.5μM；

所述的延伸引物混合物中的延伸引物优选为按如下摩尔比混合：

第1管：如SEQ ID NO.199～SEQ ID NO.208所示的延伸引物的摩尔比为7.04：7.36：8.05：8.30：9.10：9.34： 10.12：10.35：10.91：11.11；

第2管：如SEQ ID NO.209～SEQ ID NO.218所示的延伸引物的浓度分别依次为6.83：7.11：7.84：8.05：8.93： 9.16：9.76：9.94：10.42：10.90；

第3管：如SEQ ID NO.219～SEQ ID NO.228所示的延伸引物的浓度分别依次为7.01：7.74：7.99：8.69：8.96： 9.60：9.84：10.41：10.66：11.20；

第4管：如SEQ ID NO.229～SEQ ID NO.238所示的延伸引物的浓度分别依次为6.89：7.18：7.89：8.55：9.44： 9.58：10.15：10.40：11.02：11.20；

第5管：如SEQ ID NO.239～SEQ ID NO.248所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.28：7.59：8.34：8.59： 9.44：9.63：10.30：10.45：11.16；

第6管：如SEQ ID NO.249～SEQ ID NO.258所示的延伸引物的浓度分别依次为6.94：7.67：8.34：8.57：9.31： 9.47：10.03：10.26：10.91：11.11；

第7管：如SEQ ID NO.259～SEQ ID NO.268所示的延伸引物的浓度分别依次为7.05：7.35：8.11：8.95：9.18： 9.80：9.99：10.52：11.01：11.22；

第8管：如SEQ ID NO.269～SEQ ID NO.278所示的延伸引物的浓度分别依次为6.87：7.12：8.09：8.74：9.00： 9.69：10.42：10.65：11.13：11.29；

第9管：如SEQ ID NO.279～SEQ ID NO.285所示的延伸引物的浓度分别依次为7.11：8.04：8.72：8.93：9.63： 10.34：11.10；

第10管：如SEQ ID NO.286～SEQ ID NO.291所示的延伸引物的浓度分别依次为6.90：7.97：8.14：9.11： 9.90：10.74；

第11管：如SEQ ID NO.292～SEQ ID NO.296所示的延伸引物的浓度分别依次为7.10：8.14：9.20：10.09： 10.85；

所述的延伸引物混合物和所述的单独延伸引物中延伸引物的浓度更优选为如表3所示；

所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒还包括清洁树脂和PCR用酶试剂中的一种或两 种。

所述的PCR用酶试剂包括PCR酶、dNTP、PCR缓冲液等。

所述的基于MassARRAY质谱平台的肺癌基因谱检测试剂盒的应用，包含如下步骤：

(1)将如表1所示的扩增引物分为12组，扩增引物名称末尾为P1-F和P1-R为第1组，扩增引物名称末 尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；将每条扩增引物配制成浓度为10μM的引物溶液后，再按分组 进行混合，得到12管扩增引物混合液，每条引物的终浓度为0.5μM；以人肺组织基因组为模板，将12组扩增 引物混合液分别进行PCR，获得PCR产物；

PCR的条件为：94℃2分钟；94℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟；

PCR的体系为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl₂(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶(5U/μl) 0.2μl、扩增引物混合液1μl、人肺组织基因组(10ng/μl)2μl，水补足至5μl；

(2)将步骤(1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化；消化的体系为：在步骤(1)得到的PCR产物中 加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl；消化的条件为：37℃40分钟，85℃5分钟；

(3)按表2中的延伸引物进行分组，延伸引物名称末尾为E1的延伸引物混合得到第1管延伸引物混合物， 延伸引物名称末尾为E2的延伸引物混合得到第2管延伸引物混合物，类推，为12管，按表3将延伸引物配制 成11管延伸引物混合液和1管单独延伸引物溶液；在步骤(2)得到的产物中进行延伸反应；12管扩增引物 分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推；延伸反应的体系为：在步骤(2)得到的产物中加入Typeplex 缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物 混合液或单独延伸引物溶液0.804μl、H₂O补足至9μl；延伸反应的条件为：94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5 秒、80℃5秒)5个循环﹞，35个循环；72℃3分钟；

(4)使用96孔板操作时，将步骤(3)获得产物9μl、水41μl和清洁树脂(Clean Resin)15mg混合；使 用384孔板操作时，将步骤(3)获得产物9μl、水16μl和清洁树脂6mg混合；旋转96孔板或384孔板30～ 60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；对上清进行分析；

(5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫描结果以 Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的检测试剂盒考虑了欧美人群与亚洲人群肺癌基因谱的差异性，检测基因更前沿，并纳入 了多个与肺癌靶向治疗耐药相关的位点，检测结果将为优化个体化诊疗分子分型，筛查技术方案以及靶向治疗 耐药的后续治疗和研究提供依据。

(2)本发明提供的检测试剂盒自主研发，在价格上存在优势，降低了患者的临床检测费用，可转化研究应 用于临床，产生经济效益和优化临床资源配置。

(3)本发明提供的检测试剂盒以96或384孔板多重反应分析为基础，具有高通量性，可同时检测13个基 因的99个位点。改变传统单基因检测价格昂贵，耗时长，操作繁琐等劣势。具有在肺癌的穿刺活检小样本中实 现“单个小样本多基因的检测”，满足小样本最大化使用、获得最大信息量的临床实践需求。

(4)本发明提供的检测试剂盒进行的PCR反应产物片段短，不仅可在新鲜组织样本中进行检测，还可在 石蜡组织、胸水等疑难样本中进行检测。

(5)本发明提供的检测试剂盒基于MassARRAY平台具有质谱的高准确性与高敏感性，并在石蜡样本残存 DNA样本中检测结果稳定，较Sanger测序法具有明显优势，提高了检测阳性率。

附图说明

图1为使用本发明试剂盒检测K1747T肺癌组织样本得到FGFR2_N549H的结果图；

其中，横坐标表示延伸产物(或延伸引物)的分组量大小；纵坐标表示质谱强度，下同。

图2为检测K1736T肺癌组织样本得到的EGFR_L858R、MET_N375S突变结果图；

其中，A为LungCarta检测EGFR_L858R突变G分子量为6139.00；

B为LungCarta检测MET_N375S突变G分子量为7253.80；

C为本发明试剂盒检测EGFR_L858R突变G分子量为7679.00；

D为本发明试剂盒检测MET_N375S突变G分子量为8195.40。

图3为检测K1744T肺癌组织样本得到的EGFR_Exon19del突变结果图；

其中，A为LungCarta检测EGFR_Exon19del分子量为5376.50；

B为本发明试剂盒检测EGFR_2235_2249del15分子量为5376.50。

图4为检测K1748T肺癌组织样本得到的结果图；

其中，A为LungCarta检测STK11_F354L突变G分子量为8239.40；

B为本发明试剂盒检测STK11_F354L突变G分子量为6016.90。

图5为延伸引物浓度对第9孔检测结果质谱峰的影响的结果图；

其中，A为优化延伸引物后的检测质谱图；

B为优化延伸引物前的检查质谱图。

图6为树脂量对第10孔检测结果质谱峰的影响图；

其中，A为优化树脂量后的检测质谱图；

B为优化树脂量前的检测质谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1肺癌多基因谱检测引物试剂盒的制备

1、确定肺癌相关驱动基因或靶向耐药基因：通过网络检索PUBMED数据库，查阅最新文献，统计与中国 人群肺癌发病机理、化放疗、靶向耐药以及转移等相关的靶向基因或其平行、相邻通路基因，确定纳入试剂盒的 基因(13个)如下：EGFR(NM_005228)、KRAS(NM_033360)、ALK(NM_004304)、FGFR1(NM_023110.2)、 FGFR2(NM_000141.2)、FGFR3(NM_000142.4)、PIK3CA(NM_006218.2)、BRAF(NM_004333.4)、PTEN (NM_000314.4)、MET(NM_001127500.1)、ERBB2(NM_004448)、AKT1(NM_005163)、STK11 (NM_000455.4)。

2、筛选目的基因的热点变异位点：在COSMIC数据库中查询上述13个基因的COSMIC基因号分别为EGFR (ENST00000275493)、KRAS(ENST00000256078)、ALK(ENST00000389048)、FGFR1(ENST00000447712)、 FGFR2(ENST00000358487)、FGFR3(ENST00000440486)、PIK3CA(ENST00000263967)、BRAF (ENST00000288602)、PTEN(ENST00000371953)、MET(ENST00000318493)、ERBB2(ENST00000269571)、 AKT1(ENST00000349310)、STK11(ENST00000326873)。查询上述基因在肿瘤中的热点变异位点，结合国内 外研究进展以及本申请发明人的前期研究成果，共确定99个与驱动肺癌发生以及耐药相关的碱基位点以及相应 的氨基酸位点(见表4)。

表4 引物试剂盒包含检测基因的蛋白变异位点

3、软件设计多重引物文档：在PUBMED数据库查询纳入试剂盒13个基因的基因组gDNA序列，分别为EGFR (NG_007726.3)、KRAS(NG_007524.2)、ALK(NG_009445.1)、FGFR1(NG_007729)、FGFR2(NG_012449.1)、 FGFR3(NG_012632.1)、PIK3C(NG_012113.2)、BRAF(NG_007873.3)、PTEN(NG_007466.2)、MET(NG_008996.1)、 ERBB2(NG_007503.1)、AKT1(NG_012188.1)、STK11(NG_007460.2)。根据COSMIC中基因的CDS序列在 gDNA序列中标记变异位点，并根据SEQUENOM公司突变标示方式，将变异位点侧翼约200个碱基拷贝到引物 设计固定格式文本中设计引物。

4、多重引物设计：通过MassARRAY网站ADS(Assay Design Suite)引物设计软件，运行第3步变异位点 序列的文档，调整相关参数，将13个基因99个位点全部纳入引物设计试剂盒。共设计297条引物，99条正向、 99条反向PCR引物和99条延伸引物。依据延伸产物的长度以及引物不形成二聚体且能特异性得到目标产物，将 297条引物分别分布在12孔里面，PCR引物(如表1所示)的分组以表1中的扩增引物进行分组，引物名称末尾 为P1-F和P1-R为第1组，引物名称末尾为P2-F和P2-R为第2组，类推，分为12组；延伸引物的分组以表2 中的延伸引物进行分组，引物名称末尾为E1为第1组，引物名称末尾为E2为第2组，类推，分为12组。12管 扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推。

5、多重引物的合成与配制(试剂盒制备)：在上海生工生物工程有限公司合成ADS软件导出的297条引物， 并进行配制：(1)PCR引物先稀释成10μM，然后工作液以每条引物浓度为0.5μM进行混合，得到扩增引物混 合液，共12管(每管包括正、反向引物)；(2)延伸引物先稀释成500μM，然后根据每一条延伸引物的分子量， 按相应体积(如表3)进行混合，得到延伸引物混合液，共12管。

实施例2使用实施例1的试剂盒检测肺癌细胞株

1、选用已知突变位点的H460、PC9、H1650、H1975、A549、GLC82、HCC827、H1299的8个肺癌细胞株 (均能从ATCC购买得到)进行本试剂盒的可行性分析，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)(来源于就诊广 东省人民医院的正常人的包皮组织提取得到)做为阴性对照，水(H₂O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA 120ng，即10ng/孔×12孔。本发明试剂盒的操作如下：

(1)PCR的体系为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl₂(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶 (5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、肺癌组织样本基因组(10ng/μl)2μl，水补足至5μl。94℃2分钟；94℃ 30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟。

(2)在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl。37℃ 40分钟，85℃5分钟，将步骤(1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化。

(3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推。在步骤(2)得到的产物中加入Typeplex 缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物 混合液0.804μl、H₂O补足至9μl。94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环﹞，35个循环； 72℃3分钟，进行延伸反应。

(4)将步骤(3)获得产物中加入水41μl，清洁树脂(Clean Resin)15mg(96孔板)或者加入水16μl， 清洁树脂6mg(384孔板)，旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；

(5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫 描结果以Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。

2、建立方法检测8例肺癌细胞株的变异位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏所(www.atcc.org)细胞株 的变异情况一致，具体基因的变异蛋白与碱基位点结果如表5。其中由于本发明试剂盒不包含PTEN缺失位点， 因此未检测到H1650细胞株的PTEN缺失。阴性对照以及空白对照均没有检测到基因变异，表明本试剂盒具有可 行性。

表5 本发明试剂盒在肺癌细胞株检测的验证结果

实施例3使用实施例1的试剂盒检测肺癌患者组织样本

1、验证选用已经使用LungCarta试剂盒检测出突变的3例人肺腺癌组织样(来自广东省人民医院)以及未检 测出突变的3例肺癌组织样本(来自广东省人民医院)，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)做为阴性对照， 水(H₂O)做为空白对照。每个样本检测需要DNA 120ng，即10ng/孔×12孔。其中，LungCarta试剂盒按其说 明书操作。本发明试剂盒的操作如下：

(1)PCR的体系为：10×PCR缓冲液0.5μl、MgCl₂(25mM)0.4μl、dNTPs(25mM)0.1μl、PCR酶 (5U/μl)0.2μl、扩增引物混合液1μl、肺癌组织样本基因组(10ng/μl)2μl，水补足至5μl。94℃2分钟；94℃ 30秒、56℃30秒、72℃1分钟，45个循环；72℃5分钟。

(2)在步骤(1)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl、水补足至7μl。37℃ 40分钟，85℃5分钟，将步骤(1)获得的PCR产物进行碱性磷酸酶消化。

(3)12管扩增引物分别对应12管延伸引物，P1对应E1，以此类推。在步骤(2)得到的产物中加入Typeplex 缓冲液(10×)0.2μl、Typeplex终止混合液(10×)0.2μl、Typeplex热测序酶(33U/μl)0.041μl、延伸引物 混合液0.804μl、H2O补足至9μl。：94℃30秒；﹝94℃5秒、(52℃5秒、80℃5秒)5个循环﹞，35个循环； 72℃3分钟，进行延伸反应。

(4)将步骤(3)获得产物中加入水41μl，清洁树脂(Clean Resin)15mg(96孔板)或者加入水16μl， 清洁树脂6mg(384孔板)，旋转板30-60分钟进行脱盐去离子防干扰处理；3200g离心5分钟；

(5)MassARRAY系统Nanodispenser点样仪将上清液进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；扫 描结果以Typer4.0软件分析各目的基因的突变状况，在质谱峰变异碱基处出现峰，则判断为突变。

2、本发明试剂盒检测6例肺癌组织样本，与LungCarta试剂盒检测结果比较(见表6)。使用本发明试剂盒 在1例使用LungCarta试剂盒检测未发现突变的K1747T样本中检测到FGFR2基因的突变(N549位点野生型A 碱基分子量为7055.7；突变C碱基分子量为7031.6，见图1)，在其它组织样本中与LungCarta试剂盒检测结果完 全一致(图2～4)。FGFR2基因是肿瘤治疗的新靶点，本试剂盒包含此新突变位点，而LungCarta试剂盒未含此 突变位点，表明本试剂盒具有前沿优势，可为临床患者提供更准确的基因变异信息。阴性对照以及空白对照均没 有检测到变异，表明本试剂盒具有可行性。

表6 本发明试剂盒与LungCarta试剂盒比较的验证结果

实施例4本发明试剂盒与直接测序法比较

选取100例肺癌组织样本使用本发明试剂盒进行检测，与本研究所已经建立的EGFR、KRAS、PIK3CA、BRAF 直接测序法比较敏感性与特异性。直接测序法按ABI 3730测序仪标准操作流程进行。本发明试剂盒灵敏度为 100％，特异度为96.3％，阳性预测值为95.8％，阴性预测值为100％(见表7)。结果显示本发明试剂盒具有高灵 敏度，与直接测序法比较特异度为96.3％，可能与质谱的高敏感性相关，可弥补直接测序法低敏感度导致的假阴 性。

表7 本发明试剂盒的灵敏度与特异度

对比例1：

操作步骤与条件基本与实施例2、3所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别仅在于：E9组延伸引物 的浓度有变化，具体为FGFR1_T141A由9.63μM变为3.21μM，其他六个延伸引物浓度不变。结果显示 FGFR1_T141A的电泳峰明显降低，如图5所示。本对比例旨在说明，在其他条件不变的情况下，延伸引物的混 合物中，各个引物成分的浓度比例是实验成败的一个关键因素。

该对比例说明，在进行多重PCR及延伸反应时，引物混合物中，各种引物之间存在着相互竞争作用，某些 引物的反应效率高以及受分子量大小影响，产生的峰形较高，但有些引物效率则受到抑制，所以引物混合中各 种引物的浓度和比例对结果影响很大，需要不断调整，获得最佳引物浓度比例。

对比例2：

操作步骤与条件基本与实施例2、3所述的肺癌基因谱检测方法的应用一致，区别仅在于：建立应用方法的 第4步在96孔板操作时清洁树脂(Clean Resin)每孔加入由15mg变为10mg。结果显示在每个反应的主峰后 面约40分子量大小处形成一个K⁺副峰，干扰结果判读，如图6所示为反应第十孔6重反应6个主峰后面均含 有1个副峰。本对比例旨在说明，在其他条件不变的情况下，在树脂的脱离子(K⁺、Na⁺等)作用下对质谱结 果的影响，树脂加入量的多少是实验成败的一个关键因素。

该对比例说明，在点样芯片进行质谱扫描前，应该对产物进行充分的脱离子处理，调整树脂到合适量，否 则将会在产物主峰的后面形成副峰，严重干扰结果判读。所以考虑树脂量对结果的影响比较大，需要调整加入 合适量的树脂，在芯片点样前将样本充分脱盐，减少离子对结果的影响。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本 发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保 护范围之内。