人TM7SF4基因的用途及其相关药物

摘要

本发明公开了人TM7SF4基因的用途及其相关药物。本发明公开了人TM7SF4基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人TM7SF4基因小分子干扰RNA、人TM7SF4基因干扰核酸构建体、人TM7SF4基因干扰慢病毒并公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人TM7SF4基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中TM7SF4基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人TM7SF4基因的用途及其相关药物。

背景技术

核糖核酸干扰（RNA interference,RNAi）现象是指当与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA（dsRNA）导入细胞后，该mRNA发生特异性降解，而导致该基因表达的沉默。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi（TuschlT,Zamore PD,Sharp PA,Bartel DP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependentcleavage of mRNA at21to23nucleotide intervals.Cell2000;101:25-33.）。肿瘤是威胁人类健康的主要疾病。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤的发生和发展（Uprichard,Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.）。

Tm7sf4基因编码7次跨膜蛋白，主要分布在树突状细胞中，编码的蛋白主要参与树突状细胞参与的免疫反应中，在破骨细胞和骨髓瘤细胞分化中发挥重要的作用。Tm7sf4基因与破骨细胞的发生和破骨细胞的融合有一定的调节作用，体外实验证明α-tocopherol可以刺激破骨细胞的融合，并且不依赖于抗氧化剂的活力，通过诱导树突状细胞特异性的跨膜蛋白，这种蛋白对破骨细胞的融合发挥重要的作用，它是通过激活MAPK14和microphthalmia相关的转录因子和直接招募Tm7sf4启动子来发挥作用，事实上，在Ttpa-/-老鼠上骨髓的反常现象都可以通过转入Tm7sf4基因得以逆转。（K,Iwasaki M,Ochi H,Fukuda T,Ma C et al.(2012)Vitamin E decreases bone mass by stimulating osteoclast fusion.Nat Med18:589-594）另外Tm7sf4基因在牙周膜组织中与牙泡组织相比有明显上调的趋势（Lee H-S,LeeJ,Kim S-O,Song J-S,Lee J-H,et al.(2013)Comparative Gene-Expression Analysisof the Dental Follicle and PeriodontalLigament in Humans.PLoS ONE8(12):），有报道在甲状腺乳头状癌中TM7SF4为高表达。（Hyun Sook Kim,Do Hyung Kim,Ji Yeon Kim,NamHo Jeoung,In Kyu Lee,Jin Gu Bong,and Eui Dal JungMicroarray Analysis of PapillaryThyroid Cancers in KoreanKorean J Intern Med.2010;25(4):399-407）还有报到用化的方法分析发现TM7SF4基因与肝脏的疾病有一定的关系。（Hyo Young Ki1,Seoae Ch2,JeongmiYu,Samsun Sung&Heebal KimAnalysis of copy number variation in8,842Koreanindividuals reveals39genes associated with hepatic biomarkers AST and ALT）.然而，目前关于TM7SF4基因在肿瘤发生过程中的作用尚无任何报道。

发明内容

本发明的目的在于公开与人TM7SF4(transmembrane7superfamily member4)基因相关的治疗方法及药物，以RNA干扰（RNAi）为手段研究TM7SF4基因在肿瘤细胞的存活和凋亡过程中的作用。

本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了TM7SF4基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制TM7SF4基因的转录或翻译，或能够特异性抑制eIF5B蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。

所述肿瘤细胞选自其生长与TM7SF4蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优的，所述肿瘤细胞选自乳腺癌之任一。

所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量为足够降低TM7SF4基因的转录或翻译，或者足够降低TM7SF4蛋白的表达或活性的剂量。进一步的，所述TM7SF4基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。

所述分子可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA（esiRNA）或者短发夹RNA（shRNA）。

所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有TM7SF4基因的启动子序列或TM7SF4基因的信息序列。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。所述小干扰RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与TM7SF4基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人TM7SF4基因的表达。

进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与TM7SF4基因中的靶序列基本相同。较优的，所述TM7SF4基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1-9中之任一序列。

所述TM7SF4基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默TM7SF4基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的TM7SF4基因中的片段。

较佳的，所述TM7SF4基因来源于人。

本发明第一方面还公开了一种分离的人TM7SF4基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。

进一步的，所述肿瘤选自乳腺癌。

所述将分离的TM7SF4基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将TM7SF4基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将TM7SF4基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。

所述将TM7SF4基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将TM7SF4基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内TM7SF4基因的表达水平。

所述将TM7SF4基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：TM7SF4基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人TM7SF4基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的TM7SF4基因小分子干扰RNA（siRNA）即是以人TM7SF4基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将TM7SF4基因及其蛋白作为作用对象。

所述将TM7SF4基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将TM7SF4基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。

所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制TM7SF4基因的转录或翻译，或能够特异性抑制TM7SF4蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中TM7SF4基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。

所述通过分离的TM7SF4基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA（esiRNA）或者短发夹RNA（shRNA）。

所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人TM7SF4基因的转录或翻译，或者足够降低人TM7SF4蛋白的表达或活性的剂量。以使人TM7SF4基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。

采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人TM7SF4基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人TM7SF4基因表达水平的物质给药于患者。

本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中TM7SF4基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：

a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与TM7SF4基因杂交的核苷酸序列；或者

b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与TM7SF4基因杂交的核苷酸序列。

进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与TM7SF4基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与TM7SF4基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与TM7SF4基因中19个连续的核苷酸序列基本相同。

更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与TM7SF4基因中的靶序列基本相同。

所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19个核苷酸。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：21所示，具体为5’-gaCUGUUGUCCUCUAUCCUUA-3’。

SEQ ID NO：21所示的siRNA为以SEQ ID NO:2所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人TM7SF4基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源TM7SF4基因表达的作用。

进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与TM7SF4基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA（siRNA）进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源TM7SF4基因表达的作用。

更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与TM7SF4基因中的靶序列基本相同。

较佳的，所述正义链片段与TM7SF4基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正义链片段与TM7SF4基因中19个连续的核苷酸序列基本相同。

进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:22所示，具体为：5’-gaCUGUUGUCCUCUAUCCUUAUUCAAGAGAUAAGGAUAGAGGACAACAGUc-3’。

shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人TM7SF4基因表达的作用。

编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO:1-9中之任一序列及其互补序列。

所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与TM7SF4基因中的靶序列基本相同，所述TM7SF4基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默TM7SF4基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的TM7SF4基因中的片段。

较佳的，所述TM7SF4基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1-9之任一序列。

进一步的，所述TM7SF4基因来源于人。

本发明第三方面，公开了一种TM7SF4基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

所述的人TM7SF4基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人TM7SF4基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述TM7SF4基因干扰核酸构建体为TM7SF4基因干扰慢病毒载体。

本发明的TM7SF4基因干扰慢病毒载体是将编码前述TM7SF4基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述TM7SF4基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默TM7SF4基因的表达。

进一步的，所述TM7SF4基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP）。

进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人TM7SF4基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-GFP-TM7SF4-siRNA。

本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为肺癌或结肠癌。

本发明的TM7SF4基因siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗肿瘤的药物或制剂。TM7SF4基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述TM7SF4基因siRNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第四方面，公开了一种TM7SF4基因干扰慢病毒，由前述TM7SF4基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对TM7SF4基因的小分子干扰RNA，从而抑制乳腺癌细胞的增殖。该TM7SF4基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，TM7SF4基因干扰核酸构建体或TM7SF4基因干扰慢病毒中的一种或多种的组合。

进一步的，所述药物组合物含有1～99wt%所述双链RNA、shRNA、TM7SF4基因干扰核酸构建体或TM7SF4基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗乳腺癌的肿瘤治疗药物中的应用。

该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。进一步的，所述肿瘤选自乳腺癌。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。

所述方法的对象可以为人。

本发明第六方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的TM7SF4基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，TM7SF4基因干扰核酸构建体，和/或所述的TM7SF4基因干扰慢病毒。

综上所述，本发明设计了针对人TM7SF4基因的9个RNAi靶点序列，构建相应的TM7SF4RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO：2的RNAi载体pGCSIL-GFP-TM7SF4-siRNA能够显著下调TM7SF4基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus，简写为Lv）作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-TM7SF4-siRNA能够靶向地将针对TM7SF4基因的RNAi序列高效导入肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞，降低TM7SF4基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的TM7SF4基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。

本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人TM7SF4基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中TM7SF4基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1：pGCSIL-GFP质粒DNA图谱

图2：TM7SF4-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后，TM7SF4mRNA的表达水平显著降低

图3：TM7SF4-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后，引起细胞增殖抑制

图4：TM7SF4-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞后，细胞克隆形成能力下降

图5：TM7SF4-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞后，促进细胞凋亡

具体实施方式

本发明基于多种真核翻译起始因子和肿瘤的发生发展密切相关，TM7SF4作为一种真核翻译起始因子，推测其可能可能参与了恶性肿瘤的发生和发展。

本发明涉及了一组针对人TM7SF4基因的小分子干扰RNA（siRNA）序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人TM7SF4mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30（优选15-27，更优选19-23）个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源TM7SF4基因的表达。

发明人发现，采用RNAi方法下调人TM7SF4基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，这一研究成果表明TM7SF4基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对TM7SF4基因的siRNA，筛选出了可有效抑制TM7SF4的表达进而抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一系列干扰人TM7SF4基因的小干扰RNA（siRNA）序列，构建了可特异性沉默TM7SF4基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人TM7SF4基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调TM7SF4基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明TM7SF4基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默TM7SF4基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。

本发明的设计思路为：

本发明通过如下方法来筛选获得一种人TM7SF4基因RNAi慢病毒：从Genbank中调取人TM7SF4基因序列；预测siRNA位点；合成针对TM7SF4基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达TM7SF4基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体（Packing Mix，Sigma-aldrich公司）共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默TM7SF4基因的慢病毒。

基于上述方法，本发明提供了9个干扰TM7SF4基因的有效靶点（具体如SEQ ID NO1-9所示），构建了特异干扰人TM7SF4基因的慢病毒。

同时本发明还公开一种人TM7SF4基因RNAi慢病毒（TM7SF4-RNAi）及其制备与应用。

本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低TM7SF4基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，TM7SF4基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，TM7SF4基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的TM7SF4基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如［美］Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1针对人TM7SF4基因RNAi慢病毒的制备

1.筛选针对人TM7SF4基因的有效的siRNA靶点

从Genbank调取TM7SF4（NM_030788）基因信息；设计针对TM7SF4基因的有效的siRNA靶点。表1列出了其中9条针对TM7SF4基因的有效siRNA靶点序列。

表1靶向于人TM7SF4基因的siRNA靶点序列

SEQ ID NO.TargetSeq起始位点1GGAGGAAGTATGTCATCAT8692CTGTTGTCCTCTATCCTTA12223CAAGGAACTCAAGATATTA10814GTGAGCAAGCAGTTTCAAA10185ACAGCTAAATGACAGCAAA5996TGTTTGGTTGCTCTTATTT1567TAAGTCTTTGGGAGATTTA828GACTCCTAAAGAAAGGAAA9029TGAGTCTCTATCTTACAAA1366

2.慢病毒载体的制备

针对siRNA靶点（以SEQ ID NO：2为例）合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列（表2）；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体（上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1），使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

5’颈环颈3’SEQ正义链CCGGgaCTGTTGTCCTCTATCCTTATTCAAGAGATAAGGATAGAGGACAACAGtcTTTTTG10反义链AATTCAAAAAgaCTGTTGTCCTCTATCCTTATCTCTTGAATAAGGATAGAGGACAACAGtc11

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37℃，反应1h）的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系（连接体系如表5所示）中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物（上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’（SEQ ID NO：14）；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’（SEQ ID NO：15），进行PCR鉴定实验（PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2）。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO：2的表达RNAi的载体，命名为pGCSIL-GFP-TM7SF4-siRNA。

构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’（SEQ ID NO：16）。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列（表3）,其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-TM7SF4-siRNA。

表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

5’颈环颈3’SEQ正义链CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG12反义链AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA13

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37℃，反应1h）的载体

表4pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

试剂体积(μl)pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl)2.010×buffer5.0100×BSA0.5Age I(10U/μl)1.0EcoR I(10U/μl)1.0dd H₂O40.5

Total50.0

表5载体DNA和双链双链DNA Oligo连接反应体系

试剂阳性对照(μl)自连对照(μl)连接组(μl)线性化的载体DNA(100ng/μl)1.01.01.0退火的双链DNA Oligo(100ng/μl)1.0-1.010×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液1.01.01.0T4噬菌体DNA连接酶1.01.01.0dd H₂O16.017.016.0Total20.020.020.0

表6-1PCR反应体系

试剂体积(μl)10×buffer2.0dNTPs(2.5mM)0.8上游引物0.4下游引物0.4Taq聚合酶0.2模板1.0ddH₂O15.2Total20.0

表6-2PCR反应体系程序设定

3.包装TM7SF4-siRNA慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-TM7SF4-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。

转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5%CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix（PVM）20μl，PEI12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。

将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5%CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置（Millipore）纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：（1）4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；（2）0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；（3）4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；（4）离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；（5）把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO:14所示。对照慢病毒的包装过程同TM7SF4-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-TM7SF4-siRNA载体。

实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测TM7SF4基因的沉默效率

处于对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×10⁴/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（MOI，MCF-7:10）值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA（逆转录反应体系见表7，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活）。

采用TP800型Real time PCR仪（TAKARA）进行实时定量检测。TM7SF4基因的引物如下：上游引物5’-TCCAGCATTTGGGAGTTTG-3’（SEQ ID NO：17）和下游引物5’-AGCATTCCTGCCTTCACG-3’（SEQ ID NO：18）。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’（SEQ ID NO：19）和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’（SEQ ID NO：20）。按表8中的比例配置反应体系。

表7逆转录反应体系

试剂体积(μl)5×RT buffer4.010mM dNTPs2.0RNasin0.5M-MLV-RTase1.0DEPC H₂O3.5Total11.0

表8Real-time PCR反应体系

试剂体积(μl)SYBR premix ex taq:10.0上游引物（2.5μM）：0.5下游引物（2.5μM）：0.5

cDNA1.0ddH₂O8.0Total20.0

设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-^ΔΔCt分析法计算侵染了TM7SF4mRNA的表达丰度。侵染对照病毒（Lv-Scr-siRNA）的细胞作为对照。实验结果（图2）表明，人乳腺癌MCF-7细胞中TM7SF4mRNA的表达水平下调了62.6%。

实施例3检测侵染TM7SF4-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×10⁴/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数（MOI，MCF-7:1），加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2×10⁴/ml），以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5%CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器（Thermo Fisher）检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线（结果如图3所示）。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度。

实施例4：侵染TM7SF4-siRNA慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力的检测

将人乳腺癌MCF-7细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15%。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将TM7SF4-siRNA慢病毒按照MOI（MOI，MCF-7:1）加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90%。

将处于对数生长期的感染病毒后的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；细胞计数后接种于6孔板中（200个细胞/孔），将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途隔3day进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；实验终止时用多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤细胞后，Giemsa染色，拍照。

如图4结果所示克隆形成实验检测肿瘤细胞感染TM7SF4-siRNA后克隆形成能力结果示意图，以MCF-7细胞为例，与未干扰（control）及对照干扰（NC组）相比，RNA干扰降低TM7SF4基因的表达（KD组）后，肿瘤细胞形成的克隆斑数目显著减少、克隆斑的体积明显减小；表明TM7SF4沉默导致肿瘤细胞形成克隆的能力下降。

平板克隆形成实验检测降低TM7SF4的表达后，MCF-7细胞肿瘤细胞的克隆形成能力下降。

我们同时做了其它多种肿瘤细胞系，得到类似的结果。

实施例5：侵染TM7SF4-siRNA慢病毒的肿瘤细胞细胞凋亡水平检测

MCF-7细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15%。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将TM7SF4-siRNA慢病毒按照MOI（MOI，MCF-7:1）加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90%。

将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；接种于96孔板，每孔100ul；置37℃5%CO2培养箱培养；培养36h后，弃培养液，4℃预冷的85%乙醇固定细胞；PBS洗板两次；RNase处理细胞后，PI染色，避光15min。将96孔板在TTP仪器上，使用预设的分析subG1期的template进行扫描分析，得到结果。

如图5中TTP检测肿瘤细胞感染TM7SF4-siRNA后凋亡情况示意图结果所示，以MCF-7细胞为例。PI染色-TTP法检测降低TM7SF4的表达后，MCF-7细胞肿瘤细胞的细胞凋亡小体（subG1期）比例的变化。发现下调TM7SF4基因表达后肿瘤细胞的凋亡比例增加。与未干扰（control）及对照干扰（NC组），RNA干扰降低TM7SF4基因的表达（KD组）后，凋亡肿瘤细胞产生的凋亡小体的数目显著增多；表明TM7SF4沉默导致肿瘤细胞凋亡。PI染色-TTP法检测降低TM7SF4的表达后，MCF-7细胞肿瘤细胞的细胞凋亡小体（subG1期）比例的变化。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。