一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置

摘要

一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置，有望代替胰岛素注射治疗糖尿病。其方法是：构建Gal4/UAS驱动表达的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N的病毒表达载体和Gal4/UAS驱动表达的胰岛素病毒表达载体；分别包装成病毒，转染至皮肤来源的成纤维细胞，然后进一步将修饰的成纤维细胞加载至组织工程支架后，移植于皮下。待再生组织在体内稳定后，蓝光照射局部皮肤，诱导VP16-CRY2和Gal4BD-CIB1N相互作用，进一步引起自身表达增加，形成正反馈；同时促进另一个载体上胰岛素的分泌。当撤掉蓝光后，系统转为静息状态，胰岛素停止分泌。该组织工程装置有望按需分泌胰岛素。

说明书

技术领域

本申请项目涉及一种能够精确调控胰岛素分泌的组织工程装置，属于生命科学、基础及临床医学、生物工程领域一项技术革新。

背景技术

胰岛素相对或者绝对的缺乏是糖尿病的重要病因，胰岛素注射是终末期糖尿病治疗的重要治疗手段。但是注射胰岛素给患者造成严重的经济负担和身体痛苦。另一方面，胰岛素的注射需要考虑饮食节律，从而保证血糖水平相对稳定。基于这样的需求，设计能够精确控制的“人工胰腺”成为糖尿病领域的热点和难点。光遗传学技术是遗传技术和光控技术结合之后产生的一项全新技术。人们可以借助光遗传学技术对活细胞或组织中的活细胞进行调控，开启或者关闭某个已经被研究的非常清楚的细胞功能。譬如，拟南芥中隐光色素CRY2和CIB1在蓝光照射下可以发生相互作用，通过诱导这种相互作用可以调控基因的表达。另一方面，蓝光照射在临床上已经用于新生儿黄疸的治疗，临床实践表明，这种光治疗的方法安全可靠。而随着遗传技术的进步，特别是病毒载体的进步和CRISPR/Cas9技术的发展，在细胞进行精确位点的基因编辑逐渐成为可能，有望显著提高基因治疗的安全性。组织工程技术可以为我们再生出需要的组织，代替体内功能异常的器官或组织，然而胰腺再生依然遥远。制作能够分泌胰岛素的组织成为一种现实而可行的选择。另外，通过光路控制胰岛素基因的时空表达有望精确调控细胞的生物学行为，从而为胰岛素的节律性分泌带来新的希望。本发明综合上述技术的优势，设计了一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置，有望代替胰岛素注射治疗糖尿病。

发明内容

本申请提出了一种光控胰岛素节律性分泌的组织工程装置，有望代替胰岛素注射治疗糖尿病。本发明解决的技术问题包括：1)构建了受光调控的VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N正反馈系统，2)构建了受光调控的胰岛素病毒表达系统，3)构建了基于细胞移植和组织工程装置，在蓝光照射下能够持久按需分泌胰岛素。

本申请的有益效果是，能够替代胰岛素注射治疗，用于重度、难治性糖尿病的治疗，具有重要的社会及经济效益。

附图说明

下面结合附图对本发明专利进一步说明：附图1A是能够受光调控的Gal4AD-CIB1N-IRES-Gal4BD-CIB1N表达载体的基本结构，附图1B是Gal4/UAS系统驱动表达突变胰岛素前体的表达载体的基本结构，附图1C是突变的胰岛素前体和野生型胰岛素前体的序列特征。附图2基因表达调控原理，当没有光照射时，只有本底水平的VP16-CRY2和Gal4BD-CIB1N的表达，且二者不能相互作用，当有蓝光照射时，本底的VP16-CRY2和Gal4BD的相互作用，通过结合启动子区Gal4结合位点，诱导其自身表达增加，形成正反馈。当VP16-CRY2和Gal4BD的高表达且相互作用时，载体表达大量胰岛素前体，后者进一步被加工成熟、进而分泌。附图3A是蓝光照射不同时间后，VP16-CRY2、Gal4BD的表达情况；附图3B是蓝光照射不同时间后Insulin的表达情况，附图3C是指蓝光照射1小时后，撤掉蓝光，不同时间分泌胰岛素的情况。附图4显示对照、白光照射感染目标病毒载体的细胞、蓝光照射感染目标病毒载体的细胞的三种细胞增殖情况，结果显示细胞增殖基本没差别。附图5A显示PLGA支架的大体结构，附图5B显示PLGA支架的微观结构，附图5C显示感染VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N病毒载体和Insulin病毒载体的成纤维细胞加载至PLGA支架后移植于皮下，形成稳定的结构。附图6A显示在蓝光刺激下，体内诱导糖尿病小鼠表达产生胰岛素；附图6B显示蓝光照射处理后，糖耐量显著改善。附图7A显示蓝光照射治疗后，糖尿病小鼠体重显著恢复，附图7B显示蓝光照射治疗后，糖尿病小鼠糖尿病血糖降低。

具体的实施方式

1.设计、包装光控的VP16-CRY2和Gal4BD-CIB1N共表达病毒系统

(1)通过公司合成序列，其特征是：包括cPPT、启动子Gal4/UAS、VP16-CRY2、IRES、Gal4BD-CIB1N，具体序列见序列表；然后将上述序列克隆至pUC57载体，命名为

pUC57-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N。

(2)通过Clal+BstBl双酶切pUC57-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N和pWPI载体，然后将上述含有cPPT、启动子Gal4/UAS、VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N的序列克隆至pWPI载体，称为pWPI-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N。

(3)连接产物转化入高效率的Stbl3E.Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新抽提质粒，供病毒包装使用。

(4)将提取好的高纯度pWPI-Gal4/UAS-VP16-CRY2-IRES-Gal4BD-CIB1N、psPAX2、pMD2G按照10∶5∶1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0.45μm滤器过滤培养基，获得含有病毒的培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。

2.设计、包装光控的胰岛素病毒表达系统

(1)通过公司合成序列，其特征是：包括cPPT、启动子Gal4/UAS、突变的胰岛素前体表达框，具体序列见序列表；然后将上述序列克隆至pUC57载体，命名为pUC57-Gal4/UAS-mProinsulin。其中突变的Proinsulin A/B链与C-肽相连部位突变成furin剪切位点，使得Insulin能够在非内分泌细胞表达、分泌。

(2)通过Clal+BstBl双酶切pUC57-Gal4/UAS-mProinsulin和pWPI载体，然后将上述Gal4/UAS-mProinsulin的片段克隆至pWPI载体，称为pWPI-Gal4/UAS-mProinsulin。

(3)连接产物转化入高效率的Stbl3E.Coli中，转化后的细菌涂板于带有Amp抗性的LB细菌培养板；挑选克隆并鉴定正确后，重新大量抽提质粒，供病毒包装使用。

(4)将预先提取好的高纯度pWPI-Gal4/UAS-mProInsulin、psPAX2、pMD2G按照质量比10∶5∶1的比例转染入包装细胞HEK293细胞。转染12h后撤换培养基，继续培养36h，收集上清，2000g离心5min，去除细胞碎片，然后0.45μm滤器过滤培养基，获得含有病毒的培养液。在此基础上，进一步通过CsCl法纯化病毒。

3.细胞学检测基因修饰过的成纤维细胞在光诱导下胰岛素分泌的情况

(1)麻醉C57/B6小鼠后，颈椎脱臼处死小鼠，背部皮肤脱毛后取小鼠背部皮肤，大小约2×3cm²。剪碎皮肤组织块，至组织块大小能够自由通过10ml的Tip头。加入0.3％的胶原酶37度孵育1h，然后将消化液通过100μm的筛子，收集滤液，1000g离心5min，获得消化的单个细胞的细胞团。将细胞沉淀重悬，铺板培养。

(2)将上述单个细胞传代至10cm培养板中，至细胞密度达到80％时，同时感染前述的两种病毒。感染方法为：使病毒液复温至室温，取8ml细胞培养基、100μl病毒液(MOI＝30)和终浓度为8μg/ml的Polybrene混合后，加入细胞中。在37℃、5％CO2和95％相对湿度的孵箱培养16h，更换新鲜培养基。

(3)将细胞重新接种于48孔板，相邻的孔不接种细胞。采用蓝光照射(460nm，10W，光源距离细胞10cm)细胞，分别照射15min，30min、45min和60min，于照射后半个小时检测CRY2、CIB1和Insulin的表达及培养基中新分泌的胰岛素情况。结果发现，与对照相比，照射时间越长，胰岛素的分泌越多；随着时间的推移，胰岛素的分泌先升高，后降低。

4.细胞学检测基因修饰过的成纤维细胞增殖情况

(1)细胞处理同上

(2)MTT检测上述基因修饰的成纤维细胞的增殖情况。具体方法为将上述基因修饰的细胞和对照未经转染的细胞同时按1000/孔的密度铺板于96孔板，每天MTT检测细胞增殖情况。结果显示，基因改造后细胞增殖没有显著差异。

5.基因修饰成纤维细胞皮下移植治疗糖尿病的效果观察

(1)PLGA支架制备

采用聚乳酸-羟基乙酸共聚物poly(lactic-co-glycolic acid)(PLGA)制备大小为5×3mm(dia.×height)的支架。具体方法为：将3g的85∶15PLGA(Sigma Aldrich)溶于30ml二氯甲烷(DCM)。以直径为125-500μm的NaCl晶体为致孔剂，将上述PLGA溶液倾倒于NaCl晶体上并搅拌均匀，同时使得液面高度为3mm。第二天，将上述固体用水洗涤，去除NaCl晶体，形成多孔的PLGA支架。最后采用直径为5-mm的活检针打孔出直径为5-mm的支架，-20℃保存备用。

(2)PLGA支架消毒与细胞加载

使用Anprolene气体消毒器对PLGA支架支架进行环氧乙烷消毒，消毒模式选择24h循环。将转染病毒的成纤维细胞培养至对数生长期，0.25％胰酶37℃消化1min，并用两倍体积培养基中和，计数，1200rpm室温离心5min，去上清，将细胞重悬并使细胞密度为2.5×10⁷。与此同时将PLGA生物支架置于培养基中，37℃、5％CO₂和95％相对湿度的孵箱培养浸泡30分钟。取出PLGA支架置于无菌纱布上10分钟，沥干，然后将支架转移到空白的12孔板中，每个支架上滴加40μl细胞悬液(细胞总数为1×10⁶/支架)。37℃、5％CO₂和95％相对湿度孵育2h，随后用于糖尿病小鼠的皮下移植。

(3)糖尿病模型制备

采用C57/BL6小鼠制作模型，具体方法是按50mg/kg连续5天注射链脲佐菌素(Streptozocin，STZ)，在造模后的72小时进行血糖监测，其血糖值大于16.7mmol/l，判定造模成功。

(4)PLGA支架和成纤维细胞复合体的皮下移植

造模成功的C57/B16小鼠称重，使用吸入法进行麻醉(3.5％异氟醚诱导麻醉，2％异氟醚维持麻醉)。根据呼吸深度和频率、后肢脚趾捏反射判断和监控麻醉深度。使用脱毛剂去除小鼠背部皮肤，消毒切口处和周围皮肤：使用10％聚维酮碘和70％乙醇消毒纱布交替涂抹，重复三次。手术者穿一次性手术服、戴一次性手术帽、口罩和无菌手套。切口附近皮下注射2mg/kg的0.5％盐酸布比卡因局部浸润麻醉，然后沿小鼠背部中线作1.5-2cm切口，钝性分离两侧皮下组织，分别在、右两侧的皮下袋中放入接种载有成纤维细胞的PLGA生物支架，植入时，接种细胞面朝上与实验小鼠皮肤接触。4-0不可吸收尼龙缝线缝合创口。术后1-2周拆线。手术开始至术后2天内，每8-12小鼠皮下注射0.1mg/kg盐酸丁丙诺啡镇痛。术后密切观察实验小鼠状态和伤口恢复情况。

(5)小鼠蓝光照射对胰岛素分泌情况的影响

将小鼠分为2组，小鼠撤食4小时后，分别照射白光(白色荧光灯，20W)和蓝光(LED，20W，波长450nm)60min。放回笼子里并分别在30，60，120，180和240min时测试胰岛素水平。具体做法如下：用70％乙醇清洗尾部并在用消毒剪刀剪之前摩擦它以使其血液流通得更好，从大隐静脉血管中采集约30μl血样，分离血清并放射免疫(RIA)测定胰岛素水平。结果显示，蓝光照射组小鼠胰岛素呈现先升高后降低的表达趋势。

(6)小鼠蓝光照射对糖耐量的影响

配置10％葡萄糖的1X PBS溶液，0.2μm滤器过滤备用。注射葡萄糖前，先将小鼠饥饿16小时，然后分别照射白光和蓝光60min，1.5小时后，按照2mg葡萄糖/g体重的比例，腹腔内注射葡萄糖溶液。注射完将动物放回笼子里并分别在0，30，60，90和120min时测试血糖水平。结果显示，蓝光照射组小鼠的糖耐量显著增强。

(7)小鼠蓝光照射治疗

正常饲养移植有PLGA支架的糖尿病小鼠，于移植后10天将小鼠分为两组，每组5只：接受蓝光照射组和不接受蓝光照射的对照组。小鼠每天接受照射时间起始于晚上8点，持续时间为1小时；对照组接受白光照射相同时间；5周后测量小鼠基础代谢水平。检测小鼠代谢指标，具体包括小鼠体重和基础血糖检测。

①体重检测

于晨时08：00称重小鼠，结果显示经过蓝光照射治疗的小鼠体重显著恢复。

②基础血糖检测

小鼠撤食4小时后，采用ACCU-CHEK舒适度曲线血糖测试仪检测小鼠血糖水平。结果显示，蓝光照射组与白光对照组相比，基础血糖水平显著降低。