一种低温生产几丁质酶的菌株及其发酵方法

摘要

本发明涉及一种新交替假单胞菌属的海洋细菌，具体的说是一种低温生产几丁质酶的新菌及其发酵方法研究，命名为Pseudoalteromonas sp.DL-6，该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2013年12月13日，其保藏编号为CGMCC NO.8580。本发明对该菌发展了一套培养技术，能从该菌稳定发酵生产几丁质酶。

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种交替假单胞菌属的海洋细菌，特别是一种低温生产几丁质酶的菌株及其发酵方法研究。该发明生产的几丁质酶主要应用于食品工业、酿造、发酵、医药等行业。 

背景技术

几丁质酶是催化几丁质水解生成N-乙酰氨基葡萄糖的酶。几丁质(Chitin)又称甲壳质或甲壳素，是一种由N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的生物直链多聚物，广泛分布与自然界。自然界每年生成的几丁质约一百亿吨，陆地储量仅次于纤维素，海洋环境中含量最丰富的多糖。 

目前已确定出3种以氢键相连的天然结晶形态：含量最大的α-几丁质，由两条反向平行链组成，多氢键相连，浸水不胀；β-几丁质，由两条同向平行链构成，分子链间的氢键较小几丁质少的多，遇水会膨胀；γ-几丁质，为三条链，两条同向，一条反向，类似于α-和β-几丁质的混和晶体。几丁质由于分子内氢键较强，所以稳定性强、溶解性能差(不溶于水、稀酸、稀碱和一般有机溶剂)。 

几丁质若脱乙酰化即成壳聚糖(chitosan)，是啤酒酵母的子囊孢子外壳、毛霉细胞壁的主要成分。壳聚糖的溶解性大为改善，虽不能直接溶于水但却能溶于酸或酸性水溶液中。几丁质分子中的氨基并非全部置换成N-乙酰氨基基团，分子中还存在一些游离的氨基基团，几丁质正是通过这种呈碱性的氨基基团与适当的离子基团如β-葡萄糖胺、特定蛋白质等结合成络合物或共价化合物。几丁质及其衍生物在食品、医药、化工、生物、农业、纺织、印染、造纸、环保等众多领域中均具有极其重要的用途。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种能低温生产几丁质酶的新菌种，并提供该新菌种的分离培养方法和发酵研究。 

本发明所述的低温生产几丁质酶生产菌株DL-6，即Pseudoalteromonas sp.DL-6菌株（CGMCC NO.8580）分离自辽宁省大连星海湾的海洋底泥中，经形态学、16S rDNA分析表明它属于假交替单胞菌属(又称交替假单胞菌属,下同)，命名为低温生产几丁质酶菌株DL-6，即Pseudoalteromonas sp.DL-6。申请人已针对该菌 发展了一套培养技术，能从该菌稳定低温发酵生产几丁质酶。该菌株已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2013年12月13日，其保藏编号为CGMCC NO.8580。 

所述低温几丁质酶菌株的生物化学特征为： 

菌落形态特征为：菌落为淡黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐、易挑取。通过简单染色、革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色等方法对该菌株生物学特性进行初步鉴定，结果表明该菌株为细菌，杆状、0.1-0.5μm×1.3-2.0μm、革兰氏阴性、无荚膜、无芽孢、端生鞭毛。遗传学特征： 

所述低温生产几丁质酶菌株DL-6，即Pseudoalteromonas sp.DL-6的16S rDNA全基因碱基序列（表1）；菌株16S rDNA全基因序列共1450bp(Genbank登录号为：KF208362)； 

1    acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggtaa cagaaagtag cttgctactt 

61   tgctgacgag cggcggacgg gtgagtaatg cttgggaaca tgccttgagg tgggggacaa 

121  cagttggaaa cgactgctaa taccgcataa tgtctacgga ccaaaggggg cttcggctct 

181  cgcctttaga ttggcccaag tgggattagc tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg 

241  acgatcccta gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga 

301  ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat 

361  gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt tcagtcagga ggaaaggtta 

421  gtagttaata cctgctagct gtgacgttac tgacagaaga agcaccggct aactccgtgc 

481  cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcgag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt 

541  acgcaggcgg tttgttaagc gagatgtgaa agccccgggc tcaacctggg aactgcattt 

601  cgaactggca aactagagtg tgatagaggg tggtagaatt tcaggtgtag cggtgaaatg 

661  cgtagagatc tgaaggaata ccgatggcga aggcagccac ctgggtcaac actgacgctc 

721  atgtacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 

781  atgtctacta gaagctcgga acctcggttc tgtttttcaa agctaacgca ttaagtagac 

841  cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 

901  cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctaca cttgacatac 

961  agagaactta ccagagatgg tttggtgcct tcgggaactc tgatacaggt gctgcatggc 

1021 tgtcgtcagc tcgtgttgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctatc 

1081 cttagttgct agcaggtaat gctgagaact ctaaggagac tgccggtgat aaaccggagg 

1141 aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgtgt agggctacac acgtgctaca 

1201 atggcgcata cagagtgctg cgaacctgcg aaagtaagcg aatcacttaa agtgcgtcgt 

1261 agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcgtat 

1321 cagaatgacg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 

1381 gtgggttgct ccagaagtag atagtctaac cctcgggagg acgtttacca cggagtgatt 

1441 catgactggg 

本发明菌株与交替假单胞菌属有相似性，用Mega5.0软件对其16S rDNA序列进行系统学分析，并用邻接法（Neigbor-Joining）构建系统树表明本菌株与交替假单胞菌属属于同一类群，关系最紧密。16S rDNA序列分析表明，与Genbank国际基因序列数据库记录的最 相似的菌株Pseudoalteromonas.undina strain NCIMB2128（WP_010389313.1）的相似性为97%。 

本发明所述的一种微生物低温发酵生产几丁质酶的方法具体包括以下步骤： 

（1）按常规方法将所述菌株接种于固体种子培养基上，在4～30℃培养48-96h； 

（2）按常规方法将几丁质酶产生菌在4～30℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子； 

（3）将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的1～9%接种量接入液体发酵培养基中，在14～20℃培养48～96h时，即微生物发酵生产低温几丁质酶结束； 

（4）将(3)的发酵液在4,000～8,000g离心收集液体，获取发酵物； 

（5）根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的发酵液经10000g离心10min去除菌体，上清液经60%饱和硫酸铵在4摄氏度搅拌过夜，12000g离心30min，收集沉淀，用一定量的PBS缓冲液（0.02～0.05M，pH7.0-8.0）重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，制备成液体酶制剂。 

本发明的优点： 

本发明所述的低温生产几丁质酶菌株（Pseudoalteromonas sp.）DL-6的优点： 

1.本说明交替假单胞菌低温生产几丁质酶活性高，对目前几丁质酶日益增加的需求，本发明为之找到了一条新的生产途径。 

2.该交替假单胞菌株生产低温几丁质酶最适温度为14～20℃，无需加热/冷却等耗能，降低生产成本，满足工业生产需求。 

3.本说明菌株具有生产降解胶体或粉状几丁质能力，低温条件下能稳定生产几丁质酶，在此之前未见相关报道。 

附图说明

图1.低温生产几丁质酶菌株的菌落； 

图2.低温生产几丁质酶菌株的生长曲线；该菌株延滞期为0～6h；对数期为6～24h；稳定期为24～60h，衰亡期为60～70h。 

图3.低温生产几丁质酶菌株的产酶曲线。 

具体实施方式

实施例1 

低温生产几丁质酶菌株（Pseudoalteromonas sp.）DL-6的分离和纯化。 

1.菌株的分离： 

（1）采集样品 

采集辽宁省大连市星海湾（123。371，E,39。6972，N）海洋底泥，取10g，加无菌水90ml，制成菌悬液。 

（2）菌株分离 

取菌悬液1ml，用无菌水依次稀释10^-3-10^-6倍，于几丁质酶筛选固体培养基上划线，几丁质酶筛选培养基（g/L）：胶体几丁质1%；蛋白胨0.5%；琼脂粉1.5%；刚果红（10mg/ml）0.5ml/100ml；原地（123°371’E,39°6972’N）海水配制。 

2.菌株的纯化 

按照微生物纯种分离的常规方法，将上述培养基于15℃放置2-3天。挑取多个单菌落，接种到新的卡拉胶固体培养基上，至少重复10次，纯化菌落。再在液体培养基中进行发酵检验，结果得到一株低温几丁质酶产量较高的菌株。 

液体种子培养基：牛肉膏1.0g；胰蛋白胨5.0g；海水1.0L，121℃高压蒸气灭菌30min； 

发酵培养基：胶体或细粉几丁质5.0g；蛋白胨5.0g；海水1.0L，121℃高压蒸气灭菌30min。 

实施例2 

低温生产几丁质酶菌（Pseudoalteromonas sp.）DL-6的分离鉴定： 

（1）低温生产几丁质酶菌株（Pseudoalteromonas sp.）DL-6的菌落形态特征（如图1）： 

菌落为淡黄色、不透明、表面光滑、边缘整齐、易挑取。通过简单染色、革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色等方法对该菌株生物学特性进行初步鉴定，结果表明该菌株为细菌，其形状为杆状、0.1-0.5μm×1.3-2.0μm、革兰氏阴性、无荚膜、无芽孢、端生鞭毛。遗传学特征： 

16S rDNA碱基序列；菌株16S rDNA全基因序列共1450bp(Genbank登录号为：KF208362)。 

低温生产几丁质酶菌株DL-6（Pseudoalteromonas sp.DL-6）CGMCC NO.8580的16S rDNA序列。 

1    acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgagcggtaa cagaaagtag cttgctactt 

61   tgctgacgag cggcggacgg gtgagtaatg cttgggaaca tgccttgagg tgggggacaa 

121  cagttggaaa cgactgctaa taccgcataa tgtctacgga ccaaaggggg cttcggctct 

181  cgcctttaga ttggcccaag tgggattagc tagttggtga ggtaatggct caccaaggcg 

241  acgatcccta gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga 

301  ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat 

361  gccgcgtgtg tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt tcagtcagga ggaaaggtta 

421  gtagttaata cctgctagct gtgacgttac tgacagaaga agcaccggct aactccgtgc 

481  cagcagccgc ggtaatacgg agggtgcgag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt 

541  acgcaggcgg tttgttaagc gagatgtgaa agccccgggc tcaacctggg aactgcattt 

601  cgaactggca aactagagtg tgatagaggg tggtagaatt tcaggtgtag cggtgaaatg 

661  cgtagagatc tgaaggaata ccgatggcga aggcagccac ctgggtcaac actgacgctc 

721  atgtacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 

781  atgtctacta gaagctcgga acctcggttc tgtttttcaa agctaacgca ttaagtagac 

841  cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag 

901  cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctaca cttgacatac 

961  agagaactta ccagagatgg tttggtgcct tcgggaactc tgatacaggt gctgcatggc 

1021 tgtcgtcagc tcgtgttgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccctatc 

1081 cttagttgct agcaggtaat gctgagaact ctaaggagac tgccggtgat aaaccggagg 

1141 aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatggc ccttacgtgt agggctacac acgtgctaca 

1201 atggcgcata cagagtgctg cgaacctgcg aaagtaagcg aatcacttaa agtgcgtcgt 

1261 agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcgtat 

1321 cagaatgacg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga 

1381 gtgggttgct ccagaagtag atagtctaac cctcgggagg acgtttacca cggagtgatt 

1441 catgactggg 

实施例3 

交替假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）DL-6菌株CGMCC：8580的发酵工艺： 

1）将交替假单胞菌划线于固体培养基上，在4～30℃（在此可为20℃）培养48-96h（在此可为48h）； 

2）按常规方法将低温几丁质酶产生菌在4～30℃（在此可为20℃，24h）逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子； 

3）将液体一级种子或二级种子,按发酵液体积的1～9%（在此可为9%）接种量接入液体发酵培养基中，在14～20℃（在此可为15℃）培养48～96h（在此可为96h）时，即微生物发酵生产低温几丁质酶结束； 

4)将(3)的发酵液在4,000～8,000g（在此可为5000g）离心收集液体，获取发酵物； 

5）将(4)得到的发酵液经10000g离心10min去除菌体，上清液经60%饱和硫酸铵在4℃搅拌过夜，12000g离心30min，收集沉淀，用PBS缓冲液（0.02～0.05M，pH7.0-8.0）（在此可为0.02M，pH7.2）重新溶解沉淀，再用相同缓冲液透析除盐，制备成液体酶制剂。 

6)该菌株低温发酵产几丁质酶活性（3，5二硝基水杨酸法）高达9.87U/mL。 

所述固体种子培养基：牛肉膏1.0g；胰蛋白胨5.0g；琼脂粉15.0g；海水1.0L，121℃高压蒸气灭菌30min； 

所述液体种子培养基：牛肉膏1.0g；胰蛋白胨5.0g；海水1.0L，121℃高压蒸气灭菌30min； 

所述发酵培养基：细粉几丁质5.0g；蛋白胨5.0g；海水1.0L，121℃高压蒸气灭菌30min。 

实施例4 

低温几丁质酶生产菌株生长曲线测定 

将纯化后的平板，挑取单菌落接入液体种子培养基，作为种子液，15℃，160rpm振荡培养24h后，1%接种液体种子培养基，15℃，160rpm振荡培养，每隔2-4h测定菌液OD_600nm，以空白培养基调零，约70h，绘制生长曲线（如图2）。 

图2.低温生产几丁质酶菌株的生长曲线该菌株延滞期为0～6h；对数期为6～24h；稳定期为24～60h，衰亡期为60～70h。 

实施例5 

低温生产几丁质酶菌株的产酶曲线 

挑取适量菌落于发酵培养基中，于15℃，160rpm培养，每隔两小时测定低温几丁质酶酶活（如图3）。 

所述发酵培养基（g/L）：胶体或细粉几丁质5.0g；蛋白胨5.0g；海水1.0L，121℃高压蒸气灭菌30min。