棉铃虫转运蛋白ABCC2及其编码基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及棉铃虫转运蛋白ABCC2及其编码基因和应用，基因ABCC2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明首先克隆得到棉铃虫转运基因ABCC2，通过降低靶标害虫对生物农药的防御能力，来增强农药的效果。从而将生物农药防治与昆虫基因沉默技术相结合，开辟了害虫防治的新领域。对于降低生物农药的使用量，增强害虫防治效果，提高食品安全，加强环境保护具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及棉铃虫转运蛋白ABCC2及其编码基因和应 用。

背景技术

棉铃虫是一种重要的多食性农业害虫，取食棉花、玉米、大豆、小麦、茄子、 番茄、辣椒等多种粮食蔬菜作物。阿维菌素是防治棉铃虫的重要生物药剂，目前使 用量较大，棉铃虫对阿维菌素产生抗性导致阿维菌素防治效果下降。

ABC转运体家族具有众多的成员，真核生物的ABC转运体具有将小分子化学物质 从细胞内转运到细胞外的功能，从而达到防御生物杀虫剂等小分子化合物的作用。 例如，果蝇(Dipoena melanogaster)被报道对阿维菌素的抗性与ABCB相关基因的 过量表达密切相关。被伊佛霉素处理过的恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)ABCC4 的表达量显著提高，从而降低对伊佛霉素的敏感性。而通过RNAi沉默ABCC4的恶性疟 原虫(Plasmodium falciparum)对伊佛霉素的敏感性增强。虽然，已经有很多实验 表明生物体对杀虫剂、杀菌剂、除草剂、抗生素和重金属的抗性与ABC转运体功能的 发挥密切相关。但是ABC转运体具体成员对具体杀虫剂的抗性作用的发挥，尤其是棉 铃虫中ABC转运体成员对具体杀虫剂抗性的功能还知道的很少。

通过在昆虫体内沉默ABC转运体相关基因增强昆虫对农药的敏感性，对于有效防 治农业害虫具有重要意义。根据不同ABC转运体的抗药性作用，探索具有增强一种或 几种生物农药药效的设计方法对于提高生物农药的效率，增强害虫防治效果具有重 要意义。

发明内容

本申请的目的是提供棉铃虫转运蛋白ABCC2。

本发明的再一目的是提供编码上述棉铃虫转运蛋白ABCC2的基因。

本发明的再一目的是提供编码上述棉铃虫转运蛋白ABCC2的基因的应用。

根据本发明的棉铃虫运蛋白ABCC2，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示： SEQ ID NO.1：

MGVENKNNVQNAEGPARKTYKRPNILSRIFLWWMCPVLITGNKRNVEESDLIPPS NLYNSERQGEYLERYWLAEIENATIENREPSLWKALRKAYWVSYMPGAIFIIIQSA ARTYQPLLFSQLLSYWSVDSEMTQQDAGLYALAMLGLNFVSMMCQHHNTLFVM RFSLKVKVACSSLLYRKLLRMTQVSVGEVAGGKLVNLLSNDITRFDYAFMFLHYL WIVPIQVAVVLYFLWEAAGFA

PFVGLFGVVILILPLQAGLTKLTTVVRRETAKRTDRRIKLMSEIIGGIQVIKMYAWE KPFQLVVKAARAFEMGALRKSIFIRSTFLGFMLFTERSIMFVTVLTLALTGTMITAT TIYPIQQYFSIIQFNVTLIIPMAIASYSEMMVSIERIQGFLSLDERSDMQVTPKMNGS NNNTLFKSKKSPLEVGIVPKKYSPSEVMAAKEMQDDPTQMDYPIRLNKVSASWT GSNSSSEMTLKNISLRIRKGKLCAIIGPVGSGKTSLLQLLLKELPLNSGTLDVSGKM SYACQESWLFPGTVRENILFGLTYEPTKYKEVCKVCSLLPDFKQFPYGDLSLVGER GVSLSGGQRARINLARAIYREADIYLLDDPLSAVDANVGRQLFDGCIKGYLTGRTC VLVTHQIHYLKAADFIVVLNEGSVENMGTYDELVKTGTEFSMLLSNQENDATENE KKDRPAMMRGISKISVKSDTEMEQKAQIQEAEERATGSLKFEVVLKYLSSVQSWC LVFTAFLVLLITQGAATTADYWLSFWTNQVDSYEQSLPDGVDPDTDMNAQIGLLT TAQYLYVFGGVILALIVMTLVRITAFVAMTMRASQNLHNTIYEKLIVTVMRFFDTN PSGRVLNRFSKDMGAMDELLPRSLLETIQMYLSLTSVLVLNATALPWTLIPTSVLIV IFVLMLRWYLNTAQAVKRLEGTTKSPVFGMINSTISGLSTIRSSGSQDRQMKLFDE AQNLHTSAFHTFFGGSTAFALYLDTLCLFYLGVVMSIFILGDFGDLIPVGSVGLAVS QSMVLTMMLQMAARFTADFLGQMTAVERVLEYTKLPTETNMEQGPTNPPKEWPS AGRVTFSNVYLNYSMEDPPVLKDLSFEIQSGWKVGVVGRTGAGKSSLIAALFRLS DISGSIKIDGVDTEGLAKKTLRSKISIIPQEPVLFSATLRYNLDPFDDYSDDDIWRAL EQVELKEGIPALDFKVAEGGTNFSMGQRQLVCLARAILRSNKILIMDEATANVDPQ TDALIQKTIRRQFASCTVLTIAHRLNTIMDSDRVLVMDQGEVAEFDHPHILLSNPNS KFFSMVRETGESMTRTLMEVAKAKYDSDNKEA

本发明还提供了编码上述棉铃虫转运蛋白ABCC2的基因，根据本发明的具体实 施方式，基因ABCC2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

ATGGGCGTAGAAAATAAGAATAATGTACAAAATGCGGAAGGTCCGGCCCGCAA GACTTACAAAAGACCGAACATTTTATCCCGTATATTTCTCTGGTGGATGTGTCCT GTGCTCATAACTGGTAACAAAAGAAATGTAGAAGAATCAGATCTTATACCGCCC AGTAATTTATATAATTCAGAAAGACAAGGAGAATATCTTGAAAGATACTGGTTG GCAGAGATAGAAAATGCAACAATTGAGAATCGGGAGCCATCACTATGGAAGGC ATTACGAAAGGCCTACTGGGTCTCCTATATGCCAGGAGCTATTTTTATCATCATTC AATCTGCAGCCAGGACGTATCAGCCGCTGTTGTTTTCTCAGCTACTGTCTTACT GGTCGGTGGACAGTGAAATGACTCAGCAAGACGCTGGCCTGTATGCTCTCGCC ATGCTGGGGCTGAACTTCGTCTCCATGATGTGTCAGCACCACAACACATTGTTT GTTATGCGGTTCAGTTTGAAAGTCAAGGTTGCCTGTTCTTCGCTCTTGTATAGG AAGTTGCTCCGCATGACCCAAGTGTCTGTAGGTGAGGTGGCAGGTGGAAAGCT CGTGAACTTGCTGTCCAACGATATCACGAGGTTTGACTACGCTTTCATGTTCCTT CACTATTTGTGGATCGTGCCTATCCAAGTGGCTGTTGTCTTATACTTCTTGTGGG AGGCAGCTGGCTTCGCGCCCTTCGTCGGTCTCTTTGGAGTCGTTATACTGATTTT ACCACTGCAAGCTGGTTTGACGAAGCTCACAACTGTTGTAAGACGTGAGACGG CTAAGAGAACGGACAGGCGAATTAAACTAATGAGTGAAATTATTGGTGGTATTC AGGTCATTAAAATGTACGCCTGGGAGAAACCGTTCCAGCTGGTTGTGAAGGCA GCCCGTGCCTTTGAAATGAGTGCCCTCAGGAAGTCCATCTTCATCAGGAGTACT TTCCTAGGGTTTATGTTGTTCACTGAAAGAAGCATCATGTTTGTCACAGTGTTG ACACTCGCTCTCACAGGCACTATGATTACTGCTACCACGATATATCCTATTCAGC AGTACTTCAGTATTATTCAGTTCAATGTAACACTGATTATTCCTATGGCAATCGCA AGTTATTCCGAGATGATGGTGTCCATCGAACGTATCCAGGGATTCCTTAGTTTGG ACGAGCGGTCAGACATGCAAGTGACTCCAAAAATGAATGGATCTAACAATAAC ACTTTGTTTAAATCCAAGAAGTCACCGCTTGAAGTAGGCATCGTGCCTAAGAAA TACTCGCCTAGCGAAGTTATGGCTGCAAAGGAGATGCAGGATGATCCTACCCAG ATGGACTATCCTATCAGGCTTAACAAAGTAAGCGCATCGTGGACCGGCAGCAAT AGTTCTTCAGAAATGACACTTAAGAATATATCGTTACGTATACGTAAAGGAAAAT TGTGTGCTATCATTGGTCCTGTGGGGTCTGGAAAGACGTCTCTACTGCAACTAC TATTAAAAGAATTACCATTGAATAGTGGTACGCTTGACGTGAGTGGAAAACTGT CTTACGCTTGTCAAGAGTCCTGGCTGTTCCCAGGCACAGTACGAGAAAACATT TTGTTTGGTCTAACCTACGAACCCACAAAATACAAAGAGGTTTGCAAGGTGTG TTCGTTGCTGCCTGACTTCAAGCAGTTCCCGTATGGTGACCTGTCTTTAGTGGG AGAGCGAGGAGTGTCCCTGTCAGGTGGTCAAAGAGCCAGGATTAACTTGGCCA GAGCAATTTATCGTGAGGCCGACATTTACTTGCTGGATGATCCTCTATCTGCAGT AGACGCTAATGTAGGCAGACAACTGTTTGACGGCTGCATCAAAGGCTACCTCA CTGGAAGAACTTGCGTCTTGGTCACCCATCAGATCCATTACCTCAAAGCTGCTG ATTTTATTGTAGTCCTTAACGAGGGTTCCGTCGAGAATATGGGCACGTATGATGA GCTGGTGAAGACAGGAACTGAGTTCTCGATGCTGCTATCCAACCAAGAAAATG ACGCAACTGAAAACGAAAAGAAAGATCGACCAGCAATGATGCGAGGAATATC AAAAATCTCAGTGAAGAGCGACACCGAAATGGAACAGAAGGCTCAAATACAG GAGGCTGAAGAGAGAGCAACGGGCAGCTTGAAGTTCGAGGTGGTGTTGAAGT ACCTGAGCTCCGTCCAGTCCTGGTGTCTGGTGTTCACGGCGTTCCTTGTGCTGC TGATCACGCAAGGCGCTGCCACCACGGCCGACTATTGGTTGAGTTTCTGGACTA ATCAAGTGGATTCTTATGAACAATCGTTACCTGATGGCGTGGAACCAGATACTG ACATGAACGCACAAATTGGTTTACTTACAACTGCCCAGTACCTATACGTTTTCG GCGGAGTTATATTGGCTTTGATAGTCATGACCCTCGTCAGAATCACAGCTTTCGT AGCGATGACAATGCGAGCTTCTCAAAATCTTCACAACACTATTTACGAAAAATT GATTGTGACTGTAATGAGATTTTTCGATACCAATCCTTCTGGTCGTGTGCTGAAC AGATTCTCAAAAGACATGGGTGCTATGGATGAGCTTCTACCTCGCAGTCTTTTA GAAACTATTCAGATGTACCTGTCTCTCACCAGTGTGTTGGTACTGAACGCCACA GCATTGCCCTGGACGCTCATACCTACCTCCGTGTTGATTGTCATCTTCGTGCTCA TGTTGAGATGGTACCTGAATACAGCTCAGGCTGTCAAACGTTTGGAAGGCACA ACCAAGAGTCCTGTATTTGGAATGATCAACTCCACTATTTCTGGACTCTCCACTA TCAGAAGTTCGGGTTCCCAGGATAGACAGATGAAAATGTTTGATGAAGCGCAG AATCTCCACACAAGTGCTTTCCACACATTCTTCGGCGGTTCTACGGCATTTGCAT TGTATCTCGATACTTTGTGCTTGACCTACCTCGGAGTTGTCATGTCAATCTTCATT TTGGGCGACTTTGGTGATTTGATCCCGGTGGGAAGCGTCGGTCTGGCCGTCAG TCAGTCCATGGTGCTGACCATGATGTTGCAGATGGCAGCCAGGTTTACAGCTGA CTTCTTGGGACAAATGACGGCTGTGGAGAGAGTGCTGGAATACACCAAGCTAC CCACGGAGACGAATATGGAACAAGGACCAACCAACCCACCCAAAGAATGGCC CAGTGCTGGCAGAGTGTCGTTCTCAAATGTGTACCTGAATTATTCCATGGAAGA CCCACCGGTGCTGAAGGACTTAAACTTCGAAATTCAAAGCGGTTGGAAGGTTG GAGTTGTAGGCAGAACAGGAGCCGGCAAGTCATCACTCATTGCGGCTTTGTTC CGGCTTAGCGACATAAGCGGCAGCATCAAAATTGACGGCGTGGACACCGAAGG ATTAGCCAAAAAGACTTTGAGATCGAAAATATCAATTATTCCGCAAGAGCCGGT GCTGTTCTCGGCTACTCTGCGATACAATTTGGATCCGTTCGACGATTACAGCGA CGACGATATTTGGAGGGCGTTGGAACAGGTGGAATTAAAAGAAGGAATACCGG CTCTAGACTTCAAAGTAGCTGAAGGTGGTACTAACTTCTCTATGGGACAACGTC AACTGGTGTGCTTGGCGCGTGCCATTCTTCGGTCTAATAAAATACTCATCATGGA CGAAGCTACCGCTAATGTCGATCCTCAGACGGACGCTTTGATCCAAAAGACGAT CCGTCGCCAGTTCGCGTCGTGCACGGTGCTCACCATCGCGCATCGACTGAACA CCATCATGGACTCCGACCGAGTGCTGGTCATGGACCAGGGCGAGGTGGCCGAG TTCGACCACCCCCACATCTTGCTCAGCAACCCCAATAGCAAGTTCTTCTCTATG GTCCGGGAGACAGGAGAAAGCATGACAAGGACCTTAATGGAGGTCGCTAAGG CCAAATATGATAGTGATAATAAGGAGGCTTAA

本发明还提供了上述棉铃虫基因ABCC2的应用。根据本发明的技术实施方案， 将棉铃虫体内的对阿维菌素具有抗性的ABCC2基因进行下调表达，以增强棉铃虫对 阿维菌素的敏感性，具体有两个实施方法：

其一，通过体外合成ABCC2基因的dsRNA，将其与阿维菌素混合制成dsRNA和 阿维菌素均能稳定存在的混配药剂，并喷洒到寄主植物或者昆虫表面，棉铃虫通过 取食或者体表摄入dsRNA时，其ABCC2被下调表达，对阿维菌素的敏感性增强。与 此同时棉铃虫摄入阿维菌素药剂，从而被阿维菌素更容易地杀死。

其二，在植物体内表达合成昆虫dsRNA的方法已经在棉花、玉米、水稻等作物 中得到实践，并被证明可以很好的沉默目的基因。通过转基因的方法在寄主植物体 内表达ABCC2基因的dsRNA，当棉铃虫取食寄主植物的同时也摄入了ABCC2基因的 dsRNA，从而使其ABCC2基因处在被抑制表达的状态，对阿维菌素会更为敏感。当 昆虫再取食或者体表摄入阿维菌素药剂时，就会被阿维菌素更容易地杀死。

本发明首先克隆得到棉铃虫阿维菌素抗性基因ABCC2，通过降低靶标害虫对生 物农药的防御能力，来增强农药的效果。从而将生物农药防治与昆虫基因沉默技术 相结合，开辟了害虫防治的新领域。对于降低生物农药的使用量，增强害虫防治效 果，提高食品安全，加强环境保护具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中饲喂dsRNA后棉铃虫ABCC2的沉默效果。

图2为本发明实施例1中化ABCC2沉默后阿维菌素对棉铃虫的生测效果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实 施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商 品。

实施例1棉铃虫阿维菌素抗性基因ABCC2克隆

根据RNA sequence测序结果，拼接得到了尽可能长的棉铃虫HaABCC2基因片 段，设计引物5’RACE-R1：GTGAAGGAACATGAAGGCGTAGT和5’RACE-R2： AGTTCAGCCCCAGCATGGCGAGA扩增HaABCC2基因的5’片段。设计引物 3’RACE-F1：CAGTCCTGGTGTCTGGTGTTCA和3’RACE-F2扩增HaABCC2基因 3’片段。5’和3’片段分别进行克隆测序并且与已知片段进行组装，获得完整的cDNA 序列。依据组装的cDNA序列设计引物HaABCC2F：

CTTCAGGAATTGCTCACATTAGG和HaABCC2R：

CTTTATGTAAACAATAAATTAGTATTAAA进行ORF的扩增并且克隆测序验证。 PCR反应。条件:94℃预热4min，94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸3min, 共35个循环，72℃延伸10min。

实施例2棉铃虫阿维菌素抗性基因ABCC2降低靶标害虫对生物农药的防御能力

设计含有T7启动子的引物ABCC2RNAiF

5’TAATACGACTCACTATAGTGGGCGACTTTGGTGATTTG’3，

ABCC2RNAiR 5’TAATACGACTCACTATATTTGATGCTGCCGCTTATGT’3，以 ABCC2cDNA为模版进行PCR扩增目的片段。回收目的片段，并以此为模板采用体 外合成dsRNA的方法大量合成目的基因的dsRNA，将dsRNA掺入到棉铃虫饲料里。 当棉铃虫取食饲料时会一起将目标基因的dsRNA取食入体内。在棉铃虫取食后24小 时、72小时和120小时后分别取中肠进行目标基因表达水平鉴定。检测发现取食 dsRNA的棉铃虫目标基因被下调表达50％左右。将棉铃虫ABCC2基因被下调表达的 个体放到含有3ug/ml阿维菌素的人工饲料上进行生测。结果发现ABCC2被下调表达 的棉铃虫对阿维菌素的敏感性显著增强，在1、2、3、4天后，其存活数均显著地低 于对照(图2)。

可见，本发明基于分子层面降低害虫抗药性的设计方法，对于提高生物农药的 药效，增强害虫防治效果具有重要意义。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但 在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易 见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明 要求保护的范围。