一种酞菁基化合物、制备方法及作为单、双光子荧光探针在癌症靶向及线粒体标记中的应用

摘要

本发明涉及一种酞菁基化合物、制备方法及作为单、双光子荧光探针在癌症靶向及线粒体标记中的应用，该酞菁基化合物具有式(I)的结构，是一种不对称的酞菁金属配合物，R表示含有RGD序列的多肽，n为0-6；不仅对癌细胞具有特有的选择性，同时在活细胞线粒体中专一定位，是一种多功能荧光分子探针。本发明还提供所述酞菁基化合物的制备方法，工艺简单，适用范围广。酞菁基化合物克服了酞菁普遍存在的光毒性，在12J/cm2的红光照射能量下，细胞成活率在95％以上，在单、双光子肿瘤成像和线粒体成像中具有良好的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种酞菁基化合物及其制备方法，该酞菁基化合物可癌症靶向荧光成像及活 细胞线粒体荧光成像，可作为单、双光子荧光探针应用，属于有机功能材料领域。

背景技术

当前癌症治疗的一个重大挑战就是怎么有效的区分肿瘤和健康组织。由于癌细胞与正常 细胞具有必然的不同之处，所以癌症诊断和治疗方法主要是基于这些不同点而进行。癌细胞 表面存在的特有受体作为肿瘤细胞的标记物一直以来吸引着研究者的兴趣。利用对该受体具 有特有亲和力的配体做为靶向分子，并与显影剂或抗癌药物相交联，可以有效的实现药物在 肿瘤中的聚集从而对癌症进行示踪诊断和治疗。与正常细胞相比，癌细胞很重要的一个特 点就是α_vβ₃整合素在其表面的过度表达，尤其是在乳腺癌、前列腺癌中。研究表明，具有 RGD序列的多肽可以特异的与癌细胞或肿瘤血管表面的α_vβ₃整合素(Integrin)结合，是一 类非常有价值的靶向因子。其中，环状多肽c-RGDyK是一种已证实的能够与α_vβ₃整合素进 行特异性结合的稳定小分子多肽，作为靶向因子广泛应用于多种探针材料。

由于红光及近红外光荧光探针能对深层组织成像的特点，使得该类荧光探针吸引了人们 极大的研究兴趣。酞菁作为一种大环共轭配合物，由于其优异的光化学及光物理性，使其不 仅能在红光-近红外区域(>680nm)具有强吸收而且具有红光-近红外区域发射的特点，从 而使其成为一类新型的红光-近红外荧光分子探针。然而，酞菁在荧光发射的过程中会伴随 着单线态氧的产生，从而对研究对象尤其是生物组织具有极大的破坏性，而不利于对生物过 程的延续研究。这一特点大大限制了酞菁作为红光-近红外荧光探针的应用。所以，迄今为 止，不具有光毒性的酞菁类荧光探针未见报道,而且不具光毒性且能同时单、双光子线粒体 成像的酞菁类荧光探针更未见报道。

另外，双光子荧光成像由于具有分辨率高，三维成像及对探针光漂白小等优点，使其在 对生物的特异性结构和位点识别中具有重要的作用。近年来，虽然双光子荧光技术迅速发展， 而专用的双光子荧光探针的开发却为能及时跟上。因此，开发研制具有实际应用价值的双光 子荧光探针是大势所趋。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种酞菁基化合物、制备方法与应用。

术语说明：

RGD序列：由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸组成，存在于多种细胞外基质中，可与11种 整合素特异性结合，能有效地促进细胞对生物材料的粘附，常规市购产品。

c(RGDyK)：序列为cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Tyr-Lys)，常规市购产品。

本发明的技术方案如下：

一种如式(I)所示的酞菁基化合物：

式(I)中，M＝Zn²⁺、Ni²⁺、Mg²⁺、Pd²⁺、Al³⁺或2H⁺，n＝0-6，R表示含有RGD序 列的多肽。

根据本发明，优选的，M＝Zn²⁺；

优选的，n＝0-3，进一步优选，n＝1；

优选的，R为c-RGDyK。

根据本发明，最优选的，所述的酞菁基化合物结构如式(II)所示：

M＝Zn²⁺。

根据本发明，上述式(I)所示的酞菁基化合物的制备方法，包括步骤如下：

(1)以4-羟基邻苯二腈为起始原料，在碱性条件下于N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，与 BrCH₂(CH₂CH₂)_nCOOR₁反应，制备如下式(a)所示的4-取代-二氰基苯；反应温度室温， 搅拌反应16-36小时；

R₁表示-CH₃或-CH₂CH₃，n＝0-6；

(2)将步骤(1)所得的产物4-取代-二氰基苯(a)和4-[(4-叔丁基)苯氧基]邻苯二腈(b) 作为反应物，加入直链醇R₂OH溶剂中，加入或不加入金属盐，催化剂为1,8-二氮杂二环- 双环(5,4,0)-7-十一烯(DBU)，氮气保护下，在120-180℃温度下，搅拌反应4～24小时， 制备如式(c)的金属或氢的不对称酞菁配合物；金属盐为金属的氯化盐、醋酸盐或硫酸盐；

式(c)中，R₂表示-C_mH_2m+1，m＝5,6,7或8；M＝Zn²⁺、Ni²⁺、Mg²⁺、Pd²⁺、Al³⁺或 2H⁺，n＝0-6；

(3)将步骤(2)所得产物金属或氢的不对称酞菁配合物(c)溶于四氢呋喃中，然后 逐滴加入到水/甲醇的饱和NaOH溶液中，设定反应温度为40～60℃，搅拌反应16-36h； 减压除去有机溶剂，然后加入盐酸溶液至pH＝2～3，所得沉淀过滤、洗涤后真空干燥得 到如式(d)的含有一个羧基的金属或氢的不对称酞菁配合物；

式(d)中，M＝Zn²⁺，Ni²⁺，Mg²⁺，Pd²⁺，Al³⁺或2H⁺；n＝0-6；

(4)将步骤(3)所得产物含有一个羧基的金属或氢的不对称酞菁配合物(d)作为反应 物，与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)一同加 入四氢呋喃中，室温下搅拌反应24-72h；减压除去有机溶剂，然后将所得产物与含RGD序 列的多肽共同加入N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，催化剂为N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)，反应 温度室温，搅拌反应24-48小时，制得式(I)中的酞菁基化合物。

根据本发明的方法，优选的，步骤(1)中4-羟基邻苯二腈与BrCH₂(CH₂CH₂)_nCOOR₁(n＝ 0-6,R₁＝CH₃或CH₂CH₃)的摩尔比为1：2～5。

根据本发明的方法，优选的，步骤(1)中碱性条件是加入K₂CO₃；每毫摩尔反应物4-羟 基邻苯二腈，K₂CO₃用量为3-10mmol。

根据本发明的方法，优选的，步骤(1)中，每毫摩尔反应物4-羟基邻苯二腈，N,N-二甲 基甲酰胺用量为2-5mL。

根据本发明的方法，优选的，步骤(2)中，反应物4-[(4-叔丁基)苯氧基]邻苯二腈和反应 物4-取代-二氰基苯的投料摩尔比为10：1～4，进一步优选为10：1。

根据本发明的方法，优选的，步骤(2)中，反应物4-[(4-叔丁基)苯氧基]邻苯二腈和与金 属盐的投料摩尔比为1：0.25～2。

根据本发明的方法，优选的，步骤(2)中，R₂OH溶剂为正戊醇、正庚醇或正辛醇。

根据本发明的方法，优选的，步骤(2)中，每毫摩尔反应物4-[(4-叔丁基)苯氧基]邻苯二 腈,催化剂DBU用量为0.2-0.8mL，R₂OH溶剂的用量为5-15mL。

根据本发明的方法，优选的，步骤(3)中，水/甲醇的体积比为水：甲醇＝1：5-10；优选 的，每毫摩尔不对称酞菁配合物，四氢呋喃的用量为15-60mL，水/甲醇的饱和NaOH溶液 用量为500-1000mL。

根据本发明的方法，优选的，步骤(4)中，反应物的中的含RGD序列的多肽优选为环状 多肽c-RGDyK。

根据本发明的方法，优选的，步骤(4)中，反应物含有一个羧基的金属或氢的不对称酞菁 配合物、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的投料 摩尔比为1：2～4：2～4，进一步优选为1:2:2.

根据本发明的方法，优选的，步骤(4)中，每毫摩尔含有一个羧基的金属或氢的不对称酞 菁配合物，四氢呋喃的用量为15-60mL。

根据本发明的方法，优选的，步骤(4)中，反应物含有一个羧基的金属或氢的不对称酞菁 配合物、含RGD序列的多肽投料摩尔比为1：1～2。

根据本发明的方法，优选的，步骤(4)中，每毫摩尔反应物含有一个羧基的金属或氢的不 对称酞菁配合物，催化剂N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)的用量为0.15-0.5mL，N,N-二甲基甲 酰胺的用量为5-15mL。

根据本发明的方法，优选的，步骤(4)中还包括反应产物的分离提纯步骤，将反应混 合物冻干后溶于THF过滤，滤渣用DMSO洗下，冻干，即得提纯后的式(I)中的酞菁基化合 物。

本发明如特殊说明，均按本领域常规操作。

本发明的反应路线如下：

根据本发明，所述酞菁基化合物作为单、双光子荧光探针在靶向癌细胞荧光成像中的 应用；优选的，在前列腺癌细胞荧光成像中的应用。

根据本发明，所述酞菁基化合物作为单、双光子荧光探针在标记或显示线粒体在活细 胞中的分布的应用。

本发明的有益效果如下：

1、本发明所述的酞菁基化合物对具有α_νβ₃高度表达的癌症细胞具有良好的亲和力，优 选成像癌症细胞并在细胞的线粒体中专一定位。

2、本发明所述的酞菁基化合物克服了酞菁普遍存在的光毒性，在12J/cm²的红光照射能 量下，细胞成活率在95％以上，并且具有双光子荧光活性吸收截面大的特点，在单、双光子 肿瘤成像和线粒体成像中具有良好的应用价值。

附图说明

图1是实施例1中所得式(II)所示酞菁基化合物的紫外可见吸收光谱。

图2是实验例1中所得式(II)所示酞菁基化合物对前列腺癌细胞DU145的选择性吸收 (以不含RGD的化合物d作为参比)。

其中，a、c图为细胞的形貌图；b图为式(II)所示酞菁基化合物在细胞内的荧光成像 图，d图为化合物d在细胞中的荧光成像图。

图3.是实验例2中式(II)所示酞菁基化合物和线粒体红对前列腺癌细胞DU145共染色 后的单光子荧光照片。

其中，a图为式(II)所示酞菁基化合物的细胞荧光成像；b图为线粒体红的细胞荧光成像； c图为a、b的叠加图；d图为细胞的形貌图。

图4.是实验例2中式(II)所示酞菁基化合物在前列腺癌细胞PC3中的双光子荧光成像 图。

其中，a图为细胞相衬图，b图为式(II)所示酞菁基化合物细胞中的双光子荧光成像。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例1、式(II)所示酞菁基化合物的制备

(1)4-[3,4-二氰基苯氧基]丁酸乙酯(a)制备

称取0.55g(3.8mmol)4-羟基邻苯二腈和1.3g(6.9mmol)4-溴正丁酸乙酯，以及1.6g  K₂CO₃溶解在DMF(10mL)中，室温下搅拌24h，然后减压将DMF抽干，残渣溶于氯仿后 水洗三次，收集有机层并在减压下除去有机溶剂氯仿，粗品用硅胶柱色谱分离后得到白色固 体，产率83.6％。

¹H NMR(300MHz,CDCl₃,25℃,TMS):δ＝7.72-7.70(d,J＝8.7Hz,1H,ArH),7.27-7.17 (m,2H,ArH),4.20-4.10(m,4H,CH₂),2.52(t,J＝7.2Hz,2H,CH₂),2.20-2.12(m,2H,CH₂),1.27 (t,J＝7.2Hz,3H,CH₃)；

(2)三[(4-叔丁基)苯氧基]-一[(4-正丁酸戊酯)苯氧基]酞菁锌(c)制备

将0.1g(0.4mmol)4-[3,4-二氰基苯氧基]丁酸乙酯(a)、1.1g(4mmol)4-[(4-叔丁基)苯氧基] 邻苯二腈(b)和二水合醋酸锌0.4g(1.8mmol)以及催化剂1，8-二氮杂二环-双环(5,4,0)-7-十 一烯(DBU)溶解在正戊醇(15mL)中；氮气保护下，将反应混合物加热至145℃搅拌反应8h。 将反应混合物中的易挥发组分在减压下除去，冷却至室温并加入甲醇使产物析出，过滤出沉 淀并用甲醇洗涤。粗品以硅胶柱色谱分离得蓝绿色固体，产率21％。

¹H NMR(300MHz,[D₆]DMSO,25℃,TMS):δ＝8.84-8.64(m,3H,ArH),8.61-8.48(m,1H, ArH),8.39-8.20(m,3H,ArH),8.13-8.03(m,1H,ArH),7.71-7.63(m,9H,ArH),7.54-7.43(m,7H, ArH),4.37-4.52(br,2H,CH₂),4.14-4.26(m,2H,CH₂),3.77-3.71(m,2H,CH₂),2.71-2.80(m,2H, CH₂),2.30-2.35(m,2H,CH₂),1.88-1.65(m,4H,CH₂),1.37-1.44(m,27H,CH₃),0.84-0.88(m, 3H,CH₃)；

(3)三[(4-叔丁基)苯氧基]-一[(4-正丁酸)苯氧基]酞菁锌(d)制备

将0.1g(0.08mmol)三[(4-叔丁基)苯氧基]-一[(4-正丁酸戊酯)苯氧基]酞菁锌(c)溶解在 THF(5mL)中，然后逐滴加入水/甲醇(1:10，体积比)的饱和NaOH溶液中(200mL)。将反应 混合物升温至45℃，搅拌反应24h。在减压条件下除去反应混合物中的有机溶剂THF和甲 醇，然后滴加1M的盐酸直至pH＝3.所得沉淀过滤并以清水进行洗涤，真空干燥后得到蓝绿 色固体，产率93％。

¹H NMR(400MHz,[D₆]DMSO,27℃,TMS):δ＝8.71(br,2H,ArH),8.54(br,1H,ArH), 8.30(br,2H,ArH),8.06(br,1H,ArH),7.49-7.66(br,18H,ArH),4.46(br,2H,CH₂),3.62-3.75(m, 2H,CH₂),2.32(m,2H,CH₂),1.43(s,27H,CH₃)；

(4)式(II)所示酞菁基化合物的制备

将15mg(0.01mmol)三[(4-叔丁基)苯氧基]-一[(4-正丁酸)苯氧基]酞菁锌(d)、14mg(0.02 mmol)NHS和28mg(0.02mmol)EDC·HCl溶解在THF(4mL)中。室温下搅拌24h后减压除去 THF，残渣溶于氯仿后水洗三次。收集有机层并在减压下除去有机溶剂氯仿，冻干后再将其 与13mg(0.02mmol)c-RGDyK和0.2mL DIPEA溶解在DMF(1mL)中，室温搅拌48h。将反 应混合物冻干后溶于THF过滤，滤渣用DMSO洗下，冻干后得绿色固体。MALDI-TOS/MS: 1759.295[M+K⁺](理论计算值为1759.612)。

本实施例制得的式(II)所示酞菁基化合物的紫外可见吸收光谱如图1所示。

实施例2、中心离子为Ni²⁺的酞菁基化合物的制备

详细步骤同实施例1，不同的是：步骤(2)中金属盐改为醋酸镍。

实施例3、中心离子为Mg²⁺的酞菁基化合物的制备

详细步骤同实施例1，不同的是：步骤(2)中金属盐改为氯化镁。

实施例4、中心离子为Al³⁺的酞菁基化合物的制备

详细步骤同实施例1，不同的是：步骤(2)中金属盐改为醋酸铝。

实施例5、中心离子为2H⁺的酞菁基化合物的制备

详细步骤同实施例1，不同的是：步骤(2)中不加任何金属盐。

实验例1、式(II)所示酞菁基化合物在前列腺癌细胞DU145中的选择性摄取试验

DU145细胞株贴壁培养于含10wt％牛血清的培养液中，在37℃,5％CO₂的饱和湿度培 养箱中培养。将培养好的细胞用浓度为0.4wt％台盼蓝染液进行1:1体积比染色三分钟后，进 行活细胞计数。计算细胞密度后，用培养液将细胞稀释并转移到培养皿中。待细胞贴壁以后， 将配置好的含样培养液加入，在培养箱中培养4小时。然后取出细胞，用PBS洗两遍，并 用胰酶消化转移到离心管中。以DMF进行萃取，并根据测得的UV-Vis谱图(图1)的酞菁 吸收峰来计算细胞的摩尔吸收量。以实施例1步骤(3)制得的化合物d的细胞摄取率作为 对比，结果如图2所示。

结果发现，式(II)所示酞菁基化合物在DU145中的摄取比不含RGD的同系物化合物d 的细胞摄取率高出数倍以上，证实了本发明的式(II)所示酞菁基化合物对癌细胞有良好的选 择性吸收性能。

由图2可知，式(II)所示酞菁基化合物在细胞中的荧光强度(图2b)大大高于化合物d 在细胞中的荧光强度(图2d)。

实验例2、式(II)所示酞菁基化合物在前列腺癌活细胞DU145及PC3中单、双光子成 像及线粒体定位试验

将接种好的细胞爬片用PBS洗三遍，然后将含有式(II)所示酞菁基化合物的培养基加入 并在培养箱中培养1小时。染色后的细胞爬片取出，洗去多余的染液，再用PBS稀释的线 粒体红溶液在培养箱中染色30分钟。染色后的细胞爬片取出，洗去多余的染液，细胞生长 面朝下盖在载玻片上，在宽场显微镜和双光子显微镜下观察细胞荧光分布及亮度变化。用商 业化线粒体红探针作为对比。结果如图3、4所示，其中：图3为式(II)所示酞菁基化合物和 线粒体红对前列腺癌细胞DU145共染色后的单光子荧光照片；图4为式(II)所示酞菁基化合 物在前列腺癌细胞PC3中的双光子荧光成像图。

由图3、4可知，式(II)所示酞菁基化合物在单、双光子激发下均能很好的荧光成像， 并且线粒体红探针和式(II)所示酞菁基化合物在细胞内的荧光分布区域相吻合，因此证实了 本发明酞菁基化合物能专一成像线粒体。

实验例3、光毒性实验

将培养至贴壁细胞的96孔板取出，倒出培养基，然后依次加入一系列含有不同浓度的 式(II)所示酞菁基化合物的培养基，并轻轻吹匀后，在培养箱中培养4小时。每种细胞平 行培养两板，一板进行光照，另一板避光实验。然后将光照组至于波长大于610nm的红光 光源中连续照射，总照射能量为12J/cm².再将光照和避光的96孔板均置于培养箱中继续培 养1天。最后，以MTT法测试细胞成活率。

实验结果：避光组和光照组的细胞成活率均在95％以上，说明该类酞菁基化合物具有可 以忽略的光毒性。