5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物及其制备方法和应用

摘要

5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物及其制备方法和应用。制备方法：1)合成中间体丙酮酸乙酯对硝基苯腙；2)制备中间体5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯；3)制备中间体5-氨基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯；4)制备中间体5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-羧酸乙酯；5)制备中间体5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼；6)制备N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物。所述一类N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物可在制备预防或治疗涉及CDK9受体相关疾病药物中应用。反应成本低，产率高，反应过程简单易控制，具有抗癌活性。

说明书

技术领域

本发明涉及一类N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

研究表明，细胞周期依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)功能异常所引起的细胞周期调控紊乱在各种肿瘤细胞中普遍存在，是导致多种肿瘤发生的重要因素。CDKs家族目前已经发现的有13个成员(CDK1-CDK13)，根据其功能不同主要分为两大类：调控细胞周期的CDKs和调节基因转录的CDKs，CDK9属于后者。CDK9是正性转录延伸因子b(positivetranscription elongation factorb,P-TEFb)中的催化亚基成分，能磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymerase Ⅱ)和一些负性转录延长因子从而使转录从起始暂停部位得以延伸。CDK9/CyclinT1的功能异常与多种疾病的发生密切相关，因此CDK9/CyclinT为艾滋病和肿瘤等重大疾病提供颇有应用前景的药物治疗靶点。近年来，已经有多种CDK抑制剂作为抗肿瘤药物的靶点进入临床治疗或试验阶段，如Flavopiridol、R-Roscovitine等。

开发CDKs抑制剂抑制其在细胞内的功能，进而达到抗肿瘤的目的，具有很好的应用前景。因此设计合成具有生物利用度高、抗癌活性明显和毒性低等优点的CDKs抑制剂是目前研究的热点。本发明涉及一类N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基吲哚-2-碳酰肼衍生物及其制备方法，以及该类衍生物作为CDK9的抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

发明内容

本发明的第一目的在于提供具有新结构的一类N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物及其制备方法。

本发明的第二目的在于提供一类N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物在制备预防或治疗涉及CDK9受体相关疾病药物中的应用。

所述一类N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物的结构式为：

其中，R₁代表C₁-C₈的烷基，未取代的芳基；R₂代表C₁-C₈的烷基，取代或未取代的芳基。

所述一类N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物的制备方法，包括以下步骤：

1)合成中间体丙酮酸乙酯对硝基苯腙；

2)制备中间体5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯；

3)制备中间体5-氨基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯；

4)制备中间体5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-羧酸乙酯；

5)制备中间体5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼；

6)制备N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物。

在步骤1)中，所述合成中间体丙酮酸乙酯对硝基苯腙的具体方法可为：在反应瓶中，先依次加入对硝基苯肼、无水乙醇；再加入丙酮酸乙酯，升温加热回流反应，薄层色谱法(TLC)检测反应完全后，停止反应，反应液冷却至室温，抽滤，收集滤饼，烘干得黄色固体产物丙酮酸乙酯对硝基苯腙，收率89％～95％；所述硝基苯肼、无水乙醇和丙酮酸乙酯的摩尔配比为1∶(5～15)∶1.2；所述升温加热回流反应的时间可为1～2h。

在步骤2)中，所述制备中间体5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯的具体方法可为：在反应瓶中，先依次加入丙酮酸乙酯对硝基苯腙、多聚磷酸；再升温反应，TLC检测反应完全后，停止反应，反应液冷却至室温，加冰水，抽滤，收集滤饼，烘干得绿色固体产物5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯，收率88％～95％；所述丙酮酸乙酯对硝基苯腙和多聚磷酸的摩尔配比为1∶(10～15)。所述升温反应的温度可为80～100℃，升温反应的时间可为1～2h。

在步骤3)中，所述制备中间体5-氨基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯的具体方法可为：在反应瓶中，先依次加入乙醇、水、乙酸、铁粉；再升温到65～78℃，分批加5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯，保温反应1～2h，TLC检测反应完全后，停止反应，反应液热过滤，滤液减压浓缩除去溶剂；浓缩后在滤液中依次加入水和乙酸乙酯，最后用碳酸氢钠调pH至7～8；过滤，分液，有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液减压浓缩得到的粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，v/v)得红色固体产物5-氨基吲哚-2-羧酸乙酯，收率70％～85％；所述5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯、铁粉、乙醇、水、乙酸乙酯的摩尔配比为1∶4∶40∶133∶25；所述在滤液中依次加入水和乙酸乙酯可在滤液中依次加入与乙醇等体积的水和与乙醇等体积的乙酸乙酯。

在步骤4)中，所述制备中间体5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-羧酸乙酯的具体方法可为：在反应瓶中，先依次加入5-氨基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯、甲苯、碳酸钾、脂肪酰氯或苯甲酰氯；再升温反应，TLC检测反应完全后，停止反应，冷却，过滤，水洗，干燥；得到的粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，v/v)得白色固体产物5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯，收率70％～85％；所述5-氨基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯、甲苯、碳酸钾、脂肪酰氯或苯甲酰氯的摩尔配比为1∶20∶1∶1.2；所述升温反应的温度可为70～80℃，升温反应的时间可为4～5h。

在步骤5)中，所述制备中间体5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼的具体方法可为：在反应瓶中，先依次加入5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-羧酸乙酯、乙醇、水和肼；再升温回流反应，TLC检测反应完全后，停止反应，冷却，过滤，干燥，得白色固体产物5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼，收率70％～80％；所述5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-羧酸乙酯、乙醇、水和肼的摩尔配比为1∶34∶64.3；所述升温回流反应的时间可为8～10h。

在步骤6)中，所述制备N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物的具体方法可为：在反应瓶中，先依次加入5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼、乙醇、脂肪醛或未取代或取代的芳基醛；再升温回流反应，TLC检测反应完全后，停止反应，冷却，过滤，干燥，得白色固体产物N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物，收率70％～80％；所述5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼、乙醇、脂肪醛或未取代芳基醛或取代的芳基醛的摩尔配比为1∶10∶1；所述升温回流反应的时间可为8～10h。

所述一类N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物可在制备预防或治疗涉及CDK9受体相关疾病药物中应用。

所述CDK9受体相关疾病包括但不限于肿瘤。

本发明反应成本低，产率高，反应过程简单易控制，适用于工业化生产，且该类衍生物具有一定的抗癌活性，可用于制备抗肿瘤药物和研究该类化合物的构效关系。

附图说明

图1为(E)-N'-(2,3-二甲氧基苯亚甲基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼对CDK9激酶活性浓度依赖性的抑制效果图。在图1中，横坐标为样品浓度(μmol/mL)；纵坐标为变化率(％)；DMSO为阴性对照，flavopiridol为阳性对照。

图2为(E)-N'-(2,3-二甲氧基苯亚甲基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼对CDK9激酶活性时间依赖性的抑制效果图。在图2中，横坐标为样品浓度(μmol/mL)；纵坐标为变化率(％)；DMSO为阴性对照，flavopiridol为阳性对照。

图3为(E)-N'-(2,3-二甲氧基苯亚甲基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼对RNA聚合酶Ⅱ的CTD ser2磷酸化水平抑制效果图。在图3中，DMSO为阴性对照，a-Tubulin为内参。

具体实施方式

为了便于理解本发明，现结合具体实施方式对本发明作进一步说明，以进一步诠释本发明，但不构成对本发明的任何方式的限制。

实施例1：丙酮酸乙酯对硝基苯腙的合成

在250mL干燥双颈瓶中依次加入对硝基苯肼(10g,0.065mol)和无水乙醇(85mL)，再在搅拌状态下滴加丙酮酸乙酯(8.14g,0.072mol)，滴加结束后升温加热至回流，搅拌反应2h后，TLC检测反应结束，停止反应。反应液冷却至室温，抽滤，收集滤饼，烘干得黄色固体产物丙酮酸乙酯对硝基苯腙13.8g。收率89.6％。熔点(m.p.)：197～199℃。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ8.21(d,J＝8.99Hz,2H),8.09(s,1H),7.28(d,J＝8.99Hz,2H),4.32-4.39(m,2H),2.17(s,3H),1.40(t,J＝7.06Hz,3H)。

实施例2：5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯的制备

在干燥的500mL反应瓶中，先分别加入丙酮酸乙酯对硝基苯腙(10g,0.042mol)，多聚磷酸(110g)，再在搅拌状态升温到100℃，保温反应2h。TLC检测反应结束后，停止反应。反应液冷却至室温，加大量的冰水，抽滤，收集滤饼，烘干得绿色固体产物5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯8.9g，收率90.2％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ12.58(brs,1H),8.71(d,J＝2.02Hz,1H),8.12(dd,J＝2.20,9.17Hz,1H),7.61(d,J＝9.17Hz,1H),7.42(d,J＝0.92Hz,1H),4.37(q,J＝7.09Hz,2H),1.35(t,J＝7.15Hz,3H)。

实施例3：5-氨基吲哚-2-羧酸乙酯的制备

在干燥的250mL反应瓶中，先依次加入乙醇(80mL)，水(20mL)，乙酸(10mL)，铁粉(8.624g,0.154mol)；再在搅拌状态升温到75℃，分批加5-硝基吲哚-2-羧酸乙酯(9g,0.0385mol)，保温反应2h。薄层色谱法检测反应已充分，停止反应。反应液热过滤，滤液冷却后减压浓缩除去溶剂；浓缩得到的粘稠液体中加入80mL水后，再在搅拌下加入80mL乙酸乙酯，并用碳酸氢钠调pH为7～8；液体过滤后分液，有机相用15g无水硫酸钠干燥5h，抽滤，滤液减压浓缩得到的固体用硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，v/v)得红色固体产物5-氨基吲哚-2-羧酸乙酯6.1g，收率77.7％。

波谱数据：1H-NMR(600MHz,DMSO-d6):δ11.38(brs,1H),7.16～7.19(m,1H),6.84(dd,J＝0.83,2.11Hz,1H),6.69～6.73(m,2H),4.63(brs,2H),4.29(q,J＝7.09Hz,2H),1.31(t,J＝7.15Hz,3H)；13C-NMR(150MHz,DMSO-d6):δ161.9,142.5,132.0,128.2,127.1,117.2,113.2,106.6,103.6,60.6,14.8。

实施例4：5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯的制备

在干燥的100mL的反应瓶中，先依次加入5-氨基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯(2.04g,0.01mol),甲苯(20mL)，碳酸钾(1.38g,0.01mol)，苯甲酰(1.37mL,0.012mol)；再在搅拌状态升温到70-80℃，保温反应4-5h。TLC检测反应已完全，停止反应。冷却，过滤，用水(20mL)洗涤滤饼2次，滤饼在60℃的真空干燥箱干燥6-8h后；得到的粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，v/v)得白色固体产物2.55g 5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯，收率82.79％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆)δ11.87(brs,1H),10.23(brs,1H),8.16(s,1H),7.99(d,J＝7.34Hz,2H),7.56～7.61(m,2H),7.50～7.55(m,2H),7.43(d,J＝8.80Hz,1H),7.15(s,1H),4.35(q,J＝7.09Hz,2H),1.35(t,J＝7.15Hz,3H)；13C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ165.7,161.7,135.7,135.0,132.6,131.8,128.8,128.3,128.1,127.0,120.6,113.7,112.9,108.2,60.9,14.8；HRMS:calcd for C₁₈H₁₆N₂O₃[M+H]⁺309.1234 found 309.1225,calcd for C₁₈H₁₆N₂O₃Na[M+Na]⁺331.1053 found 331.1053。

实施例5：中间体5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼的制备

在干燥的100mL的反应瓶中，先依次加入5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯，(3.08g,0.01mol),乙醇(20mL)，水和肼(20mL)；再在搅拌状态升温到回流，保温反应8-10h。TLC检测反应已完全，停止反应。冷却，过滤，滤饼在60℃的真空干燥箱干燥6-8h后得白色固体产物5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼2.32g。收率78.9％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.58(s,1H),10.14(s,1H),9.76(brs,1H),8.07(s,1H),7.97(d,J＝7.15Hz,2H),7.57(s,1H),7.56～7.60(m,1H),7.51～7.55(m,2H),7.47(dd,J＝1.65,8.80Hz,1H),7.39(s,1H),7.38(s,1H),7.07(d,J＝1.47Hz,1H),4.50(s,2H)；¹³C-NMRδ(150MHz,DMSO-d₆)δ165.6,161.6,135.8,133.9,132.2,131.7,131.6,128.8,128.0,127.3,118.9,113.3,112.5,102.4；HRMS:calcd for C₁₆H₁₄N₄O₂[M+H]⁺295.119 found 295.1182,calcd for C₁₆H₁₄N₄O₂Na[M+Na]⁺317.1009 found 317.1004。

实施例6：5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯的制备

在干燥的100mL的反应瓶中，先依次加入5-氨基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯(2.04g,0.01mol),甲苯(20mL)，碳酸钾(1.38g,0.01mol)，乙酰氯(0.85mL,0.012mol)；再在搅拌状态升温到50～60℃，保温反应4～5h。TLC检测反应已完全，停止反应。冷却，过滤，用水(20mL)洗涤滤饼2次，滤饼在60℃的真空干燥箱干燥6～8h后；得到的粗产物用硅胶柱层析分离(洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝3∶1，v/v)得白色固体产物2.05g 5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯，收率83.33％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.80(s,1H),9.93(s,1H),8.02(s,1H),7.37(d,J＝1.00Hz,1H),7.35(t,J＝1.00Hz,1H),7.09(d,J＝1.83Hz,1H),4.33(q,J＝7.03Hz,2H),2.05(s,3H),1.34(t,J＝7.06Hz,3H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ168.3,161.7,134.6,133.0,128.2,127.0,119.3,112.9,111.9,108.1,60.8,24.4,14.8；HRMS calcd for C₁₃H₁₄N₂O₃[M+H]⁺247.1077 found 247.1075,calcd for C₁₃H₁₄N₂O₃Na[M+Na]⁺269.0897 found 269.0893。

实施例7：5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼的制备

在干燥的100mL的反应瓶中，先依次加入5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-羧酸乙酯，(2.46g,0.01mol),乙醇(20mL)，水和肼(20mL)；再在搅拌状态升温到回流，保温反应8～10h。TLC检测反应已完全，停止反应。冷却，过滤，滤饼在60℃的真空干燥箱干燥6～8h后得白色固体产物5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼1.96g。收率84.12％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.51(brs,1H),9.78(s,1H),9.72(s,1H),7.93(s,1H),7.32(d,J＝8.62Hz,1H),7.22(d,J＝8.80Hz,1H),7.01(s,1H),4.49(brs,2H),2.03(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ168.2,161.6,133.5,132.5,131.5,127.4,117.6,112.6,111.5,102.3,24.4；HRMS calcd for C₁₁H₁₂N₄O₂[M+H]⁺233.1033found 233.1031,calcd for C₁₁H₁₂N₄O₂Na[M+Na]⁺255.0852 found 255.0848。

实施8：N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物制备：(E)-N'-(亚丙基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼

在干燥的10mL反应瓶中依次加入乙醇(5mL)，5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼(0.059g,0.0002mol)，丙醛(0.0115g,0.0002mol)，再升温至回流反应8h。薄层色谱法检测反应结束后，停止反应。反应液冷却，过滤；乙醇洗涤滤饼，滤饼在45℃的真空干燥箱干燥4～8h后得白色固体产物(E)-N'-(亚丙基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼0.058g，收率86.82％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.74(brs,1H),11.47(brs,1H),10.18(s,1H),8.14(s,1H),7.99(d,J＝7.34Hz,2H),7.77(brs,1H),7.58(d,J＝7.15Hz,1H),7.55(s,1H),7.50～7.54(m,3H),7.42(d,J＝8.62Hz,1H),7.22(brs,1H),2.27～2.35(m,2H),1.09(t,J＝7.43Hz,3H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ165.7,157.8,152.9,135.7,134.3,132.4,131.8,131.3,128.8,128.0,127.2,119.6,113.4,112.6,103.6,25.9,11.2；HRMS:calcd for C₁₉H₁₈N₄O₂[M+H]⁺335.1503 found335.1493,C₁₉H₁₈N₄O₂Na[M+Na]⁺357.1322 found 357.1311。

实施例9：N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物制备：(E)-N'-(苯基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼

在干燥的10mL反应瓶中依次加入乙醇(5mL)，5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼(0.059g,0.0002mol)，苯甲醛(0.021g,0.0002mol)，再升温至回流反应8h。薄层色谱法检测反应结束后，停止反应。反应液冷却，过滤；乙醇洗涤滤饼，滤饼在45℃的真空干燥箱干燥4～8h后得白色固体产物(E)-N'-(苯基)-5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼0.062g，收率81.15％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.92(brs,1H),11.83(brs,1H),10.20(s,1H),8.48(brs,1H),8.19(brs,1H),8.00(d,J＝7.15Hz,2H),7.77(d,J＝6.97Hz,2H),7.59(d,J＝7.15Hz,1H),7.52～7.57(m,3H),7.43～7.51(m,4H),7.33(br.s.,1H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ165.7,158.1,147.6,135.7,134.8,134.5,132.5,131.8,131.1,130.5,129.3,128.8,128.0,127.5,127.2,119.8,113.5,112.7,104.1；HRMS:calcd for C₂₃H₁₈N₄O₂[M+H]⁺383.1503 found 383.1490,C₂₃H₁₈N₄O₂Na[M+Na]⁺405.1322 found405.1310。

实施例10：N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物制备：

在干燥的10mL反应瓶中依次加入乙醇(5mL)，5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼(0.059g,0.0002mol)，2,3-二甲基苯甲醛(0.0268g,0.0002mol)，再升温至回流反应8h。薄层色谱法检测反应结束后，停止反应。反应液冷却，过滤；乙醇洗涤滤饼，滤饼在45℃的真空干燥箱干燥4-8h后得白色固体产物(E)-N'-(2,3-二甲氧基苯亚甲基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼0.069g，收率78.05％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.94(brs,1H),11.82(brs,1H),10.19(s,1H),8.75(brs,1H),8.18(brs,1H),8.00(d,J＝7.34Hz,2H),7.57～7.61(m,1H),7.49～7.57(m,4H),7.45(d,J＝8.80Hz,1H),7.33(brs,1H),7.12～7.18(m,2H),3.85(s,3H),3.83(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ165.7,158.0,153.2,148.4,143.0,135.7,134.5,132.5,131.8,131.1,128.8,128.2,128.0,127.3,124.9,119.8,117.5,114.6,113.5,112.7,100.5,61.7,56.2；HRMS:calcd for C₂₅H₂₂N₄O₄[M+H]⁺443.1714 found 443.1702,calcd for C₂₅H₂₂N₄O₄Na[M+Na]⁺465.1533 found 465.1522。

实施例11：N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物制备：(E)-N'-(亚丙基)-5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼

在干燥的10mL反应瓶中依次加入乙醇(5mL)，5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼(0.0928g,0.0004mol)，丙醛(0.023g,0.0004mol)，再升温至回流反应8h。薄层色谱法检测反应结束后，停止反应。反应液冷却，过滤；乙醇洗涤滤饼，滤饼在45℃的真空干燥箱干燥4～8h后得白色固体产物(E)-N'-(亚丙基)-5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼0.081g，收率74.45％。

波谱数据：¹H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.67(brs,1H),11.43(brs,1H),9.81(brs,1H),7.99(brs,1H),7.75(brs,1H),7.35(d,J＝8.07Hz,1H),7.26(d,J＝8.44Hz,1H),7.15(brs,1H),2.30(brs,2H),2.04(s,3H),1.08(t,3H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ168.3,157.8,152.9,133.9,132.7,131.1,127.2,118.2,112.7,111.7,103.5,25.9,24.4,11.2；HRMS:calcd for C₁₄H₁₆N₄O₂[M+H]⁺273.1346 found 273.1342,calcdfor C₁₄H₁₆N₄O₂Na[M+Na]⁺295.1165 found 295.1161。

实施例12：N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物制备：(E)-N'-(苯基)-5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼

在干燥的10mL反应瓶中依次加入乙醇(5mL)，5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼(0.0928g,0.0004mol)，苯甲醛(0.042g,0.0004mol)，再升温至回流反应8h。薄层色谱法检测反应结束后，停止反应。反应液冷却，过滤；乙醇洗涤滤饼，滤饼在45℃的真空干燥箱干燥4～8h后得白色固体产物(E)-N'-(苯基)-5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼0.11g，收率85.9％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.87(brs,1H),11.75(brs,1H),9.83(s,1H),8.47(brs,1H),8.03(brs,1H),7.76(d,J＝6.60Hz,2H),7.43～7.52(m,3H),7.39(d,J＝8.62Hz,1H),7.29(d,J＝8.62Hz,1H),7.26(brs,1H),2.05(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ168.3,158.0,147.5,134.8,134.1,132.8,131.0,130.5,129.3,127.5,127.3,118.5,112.8,111.8,104.0,24.4；HRMS:calcd for C₁₈H₁₆N₄O₂[M+H]⁺321.1346found 321.1346，C₁₈H₁₆N₄O₂Na[M+Na]⁺343.1165 found 343.1164。

实施例13：N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物制备：(E)-N'-(2,3-二甲氧基苯亚甲基)-5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼

在干燥的10mL反应瓶中依次加入乙醇(5mL)，5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼(0.0928g,0.0004mol)，2,3-二甲基苯甲醛(0.0664g,0.0004mol)，再升温至回流反应8h。薄层色谱法检测反应结束后，停止反应。反应液冷却，过滤；乙醇洗涤滤饼，滤饼在45℃的真空干燥箱干燥4～8h后得白色固体产物(E)-N'-(2,3-二甲氧基苯亚甲基)-5-乙酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼0.12g，收率78.94％。

波谱数据：¹H-NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ11.90(brs,1H),11.74(brs,1H),9.83(brs,1H),8.74(brs,1H),8.02(brs,1H),7.50(d,J＝6.05Hz,1H),7.38(d,J＝8.25Hz,1H),7.23～7.31(m,2H),7.10～7.19(m,2H),3.85(s,3H),3.83(brs,3H),2.05(s,3H)；¹³C-NMR(150MHz,DMSO-d₆)δ168.3,157.9,153.2,148.4,143.0,134.1,132.8,131.0,128.2,127.3,124.8,118.5,117.5,114.6,112.8,111.7,104.0,61.7,56.2,24.4；HRMS calcd for C₂₀H₂₀N₄O₄[M+H]⁺381.1557 found 381.1550,calcd for C₂₀H₂₀N₄O₄Na[M+Na]⁺403.1377 found 403.1369。

NH1细胞是在子宫颈癌细胞系Hela细胞中建立的稳定细胞株，能稳定的表达HIV-LTR-Luciferase。在HIV的基因转录中，LTR的转录调控主要受CDK9(P-TEFb)调节，因此稳定表达HIV-LTR-Luciferase的NH1细胞中Luciferase报告基因的表达水平能间接反映细胞内由P-TEFb调节的LTR转录水平，即CDK9激酶的活性。因此以NH1细胞作为研究CDK9激酶活性的模型，药物处理后检测细胞内Luciferase报告基因的表达，实验结果发现N'-取代亚甲基-5-(取代碳酰氨基)-1H-吲哚-2-碳酰肼衍生物(以(E)-N'-(2,3-二甲氧基苯亚甲基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼为例)能有效地抑制P-TEFb调节的HIV-LTR-luciferase的转录即抑制CDK9的活性，而且这种抑制效果呈现浓度依赖性(如图1：同样的处理时间，随着药物浓度的增加Luciferase的表达水平逐渐降低，即CDK9酶活性被抑制的越强)和时间依赖性(如图2：在同样的药物浓度下，Luciferase的表达水平随着处理时间的增加而明显降低，即CDK9的活性随着处理的时间增加而降低)。此外，P-TEFb在调节基因转录的过程中主要磷酸化RNA Poll CTD的第二位丝氨酸(ser2)，western的结果也显示该化合物能明显抑制p-Ser2的磷酸化水平，即抑制CDK9的活性(如图3)。由此可见，(E)-N'-(2,3-二甲氧基苯亚甲基)-5-苯甲酰胺基-1H-吲哚-2-碳酰肼能显著抑制CDK9(P-TEFb)的激酶活性，有效抑制基因转录的进行，所以可在与CDK9调节的基因转录相关的多种疾病的治疗中得到有效的应用。