氨基酸二氢青蒿素衍生物及其制备方法与应用

摘要

一类氨基酸二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的盐、水合物（I），包括其立体异构体或互变异构体。式中，R

说明书

技术领域

本发明涉及氨基酸二氢青蒿素衍生物及其制备方法与作为抗癌药的应用。

背景技术

近年来，研究发现双氢青蒿素是青篙素类衍生物在体内的主要活性代谢产物，对癌细胞的杀伤作用很强，为了寻找稳定性更好、抗癌作用更强的青蒿素类药物，化学家们在保留过氧桥键的基础上，主要在双氢青蒿素10位碳上的羟基键引入一些亲水、亲脂基团进行结构修饰，合成了烷基醚、芳香醚、酯类、杂原子取代、二聚体化合物等几百种新的青蒿素衍生物,并发现部分烷基醚、芳香醚类和双活性二聚体化合物比青蒿素具有更强的抗肿瘤活性。例如，最具有代表性的青蒿琥酯的钠盐,被发现具有强的抗白血病与抗乳腺癌、卵巢癌等作用。

肿瘤细胞组织为了蛋白质合成和细胞增生，比正常细胞组织更加需要不断摄取多种必需氨基酸和非必需氨基酸为肿瘤细胞增殖所必需的营养物质。氨基酸具有对  生物体的特殊的渗透性和酶催化专一性，而青蒿素类药物对癌细胞选择性较差，本发明将氨基酸作为载体，将有抗癌作用的二氢青蒿素分子引入机体，增强药物在机体内的溶解和吸收，即抑制了癌细胞，又降低了药物的毒性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氨基酸二氢青蒿素衍生物，其具有良好的抗癌活性，并且毒性较低。

本发明的另一目的在于提供上述氨基酸二氢青蒿素衍生物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述氨基酸二氢青蒿素衍生物的用途。

以下对本发明进行详细描述。

本发明提供以下式（I）的氨基酸二氢青蒿素衍生物或其药学可接受的盐。结构如下所示。

R₁，R₂，R₃为各自独立的H、烃基，所述烃基可以被氨基、取代氨基、羧基、羟基、巯基、酯基、芳基、取代芳基、芳杂环、取代芳杂环的取代基任意取代；n 为0-10的整数。

本发明通式（I）化合物包括其立体异构体和互变异构体。

本发明还提供了式（I）的化合物的制备方法，如下所示：

式中，X为 Cl，Br；R₁，R₂，R₃为各自独立的H、烃基；n 为0-10的整数。

本发明的氨基酸二氢青蒿素衍生物的制备方法，所述反应溶剂为DMF、乙腈、THF、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、四氯化碳，优选DMF、乙腈、THF。

本发明的氨基酸二氢青蒿素衍生物的制备方法，所述碱为有机碱和无机碱，优选无水K₂CO₃，Na₂CO₃。

本发明的氨基酸二氢青蒿素衍生物有显著的抗癌作用和较低毒性。

    通过以下实施例进一步举例说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

具体实施方式

实施例1

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（甘氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（1）的制备

化合物（1）的结构如下所示：

将1.50g (0.012mol)甘氨酸甲酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K₂CO₃粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol)（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-溴亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到甘氨酸甲酯二氢青蒿素。

向3.71g (0.01mol)甘氨酸甲酯二氢青蒿素中加入10mL甲醇和12mL 1mol·L^-1的NaOH溶液，室温反应1小时，蒸出甲醇，残液用2-3mL的1mol·L^-1的HCl溶液调pH=6，析出固体，过滤，干燥，得到化合物（1），收率81%。

实施例2

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（苯丙氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（2）的制备

化合物（2）的结构如下所示：

用2.58g (0.012mol)苯丙氨酸甲酯盐酸盐代替1.50g (0.012mol)甘氨酸甲酯盐酸盐，用2-3mL的1mol·L^-1的HCl溶液调pH=5.5，其它操作按实施例1，得到化合物（2），收率84%。

实施例3

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（半胱氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（3）的制备

化合物（3）的结构如下所示：

将4.04g (0.012mol)S-苄基半胱氨酸苄酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K₂CO₃粉末悬浮于20mLDMF中，加入3.62g (0.01mol)（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-溴亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，残渣加入10mL甲醇和0.5g 5%的Pd-C,通入氢气，反应2小时，过滤，浓缩，柱层析纯化，得到化合物（3），收率72%。

实施例4

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（苯丙氨酸甲酯）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（4）的制备

化合物（4）的结构如下所示：

将2.58g (0.012mol)苯丙氨酸甲酯盐酸盐和2.65g (0.025mol)无水Na₂CO₃粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol)（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-溴亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到化合物（4），收率89%。

实施例5

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（丙氨酰苯丙氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇（5）的制备

化合物（5）的结构如下所示：

将3.43g (0.012mol)丙氨酰苯丙氨酸甲酯盐酸盐和3.45g (0.025mol)无水K₂CO₃粉末悬浮于20mLTHF中，加入3.62g (0.01mol)（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-溴亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇，剧烈搅拌，反应24小时，减压蒸出溶剂，加入20mL水和20mL二氯甲烷搅拌10分钟，分层，水层用二氯甲烷提取15mLX2，合并有机相，有机层脱水、浓缩，柱层析纯化，得到丙氨酰苯丙氨酸甲酯二氢青蒿素。

向5.32g (0.01mol)丙氨酰苯丙氨酸甲酯二氢青蒿素中加入12mL甲醇和12mL 1mol·L^-1的NaOH溶液，室温反应1小时，蒸出甲醇，残液用2-3mL的1mol·L^-1的HCl溶液调pH=5.5，析出固体，过滤，干燥，得到化合物（5），收率64%。

实施例6

（3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12S, 12aR）-八氢-3-（谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）亚甲基-6，9-二甲基-3，12-桥氧-12H-吡喃并[4, 3-j]-1,2-苯并二噻平-10（3H）醇的制备

化合物（6）的结构如下所示：

用6.92g (0.012mol)谷氨酰（S-苄基）半胱氨酰甘氨酸二苄酯盐酸盐代替4.04g (0.012mol)S-苄基半胱氨酸苄酯盐酸盐，其它操作按实施例3，得到化合物（6），收率57%。

实施例7

选用人白血病 HL-60 细胞，应用细胞计数法对氨基酸二氢青蒿素衍生物的细胞生长抑制作用进行了研究。

一、材料与方法

1．材料

HL-60 细胞(美国组织培养中心ATCC, Rocksville, Maryland, USA)；牛血清（FCS,  Gibco）；100IU/mL 青霉素（华北制药集团）；100μg/mL 链霉素（华北制药集团）；1mmol/L  L–谷氨酸（石家庄冀荣氨基酸公司）；双氢青蒿素纯品（由广州新南方青蒿药业有限公司提供）。

2．抑制活性实验方法：

2.1  细胞培养

HL-60 细胞培养于含有 10%经加热灭活的胎牛血清、100IU/mL 青霉素、100μg/mL 链霉素及 1mmol/L  L–谷氨酸的RPMIl640 培养基中，37℃、5%CO₂饱和湿度孵箱中孵育。 

2.2  试剂的配制 

4%台盼蓝母液：称取 4g 台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至 100mL，用滤纸过滤，4℃保存，使用时用 PBS 稀释至 0.4％。

2.3  细胞存活率的测定收集对数生长期细胞以 5×10⁴/mL 的浓度接种于 24 孔板中，按要求分别加入不同浓度的不同氨基酸二氢青蒿素衍生物，37℃继续培养72hr。

2.4 制备单个细胞悬液及染色：取 0.4％的台盼蓝溶液 50μL，单个细胞悬液 50μL 混匀后计数。

2.5计数：在 3 分钟，用血球计数板分别计活细胞数和死细胞数。

2.6结果：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。

细胞存活率计算公式：

Viability％＝活细胞总数 /（活细胞数总数＋死细胞总数）х 100%

三 结果

   氨基酸二氢青蒿素衍生物对人白血病细胞HL-60 细胞抑制活性结果见表1。结果显示，制备的氨基酸二氢青蒿素衍生物对人白血病细胞HL-60 细胞有显著的抑制作用。