Dirigent基因EG261及其直系同源物和旁系同源物以及它们在植物中用于病原体抗性的用途

摘要

本发明提供EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁系同源物，及其片段和变异的鉴定和使用，以供改变，例如，增加植物中的病原体耐受和/或抗性。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求在2013年3月15日提交的美国临时申请号61/789,463以及 2012年5月25日提交的美国临时申请号61/652,029的优先权，上述的每一 项在此处以通过引用整体并入用于各种用途。

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技术领域

本发明涉及植物中用于病原体抗性的核酸序列的鉴定和用途。

发明背景

“Dirigent”指分别作为基因或蛋白质家族(已在很多植物中鉴定其成员)成 员的基因或蛋白质。Dirigent涉及在一系列不同的(且有时为远亲的)植物中对 多种类型的病原体的抗性。

Dirigent蛋白质在众多植物品种中赋予对多种病原体的广泛应答，包括 对松柏类植物(Ralph等，Plant Molecular Biology(2006)60:21–40)；棉(L.Zhu, X.Zhang,L.Tu,F.Zeng,Y.Nie and X.Guo Journal of Plant Pathology.2007.89 (1),41-45)；大麦(Ralph等，Plant Molecular Biology,2006,60:21–40_DOI 10.1007/s11103-005-2226-y)，大麦，(Kristensen等，Plant Physiology,June 1999, Vol.120,pp.501–512)；甜橙树(“Gene expression in Citrus sinensis(L.)Osbeck  following infection with the bacterial pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus  causing Huanglongbing in Florida”Albrecht等，Plant Science,Volume 175,Issue 3,September 2008,Pages 291–306)；小麦(poster presentation:“Cloning and  Transcriptional Profiling of a Dirigent-like Gene from Wheat Responding to  Hessian Fy Infestation”,C.Williams,Poster PO910,Plant and Animal Genome 20)；以及豌豆(“Transgenic canola lines expressing pea defense gene DRR206 have resistance to aggressive blackleg isolates and to Rhizoctonia solaniI.”,Wang  and Fristensky,Molecular Breeding Volume 8,Number 3(2001),263-271,DOI: 10.1023/A:1013706400168)。因此Dirigent在许多植物中已涉及病原体反应， 且已表明这种反应可针对多种不同病原体，包括但不局限于真菌、细菌、昆 虫和线虫。

“Dirigent”的鉴定和用途对于园林管理和作物生产至关重要，特别是对于 农艺学和园艺学中的商业化作物生产。

发明概述

本发明提供了EG261、EG261同源物(homolog)、EG261直系同源物 (ortholog)、EG261旁系同源物(paralog)及其片段和变异的鉴定和用途，以供 改变，例如，赋予或增加植物中的病原体耐受和/或抗性。重要的是，这种改 变的，例如，增加的病原体耐受和/或抗性可利用常规植物育种方法获得，其 中这些方法还选择性地包括利用任何不同生物技术方法来验证在所得的杂交 品种和后代中预期EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁系 同源物及其片段和变异存在。

在实施方案中，本发明提供了分离的编码EG261、EG261同源物、EG261 直系同源物、EG261旁系同源物及其片段和变异的核酸序列。本发明还提供 了包含这些核酸序列的嵌合基因、构建体、重组DNA、载体、植物细胞、植 物组织、植物部分、植物组织培养物和/或全植物。

在一个实施方案中，本发明提供用于改变和/或增加病原体耐受和/或抗性 的多核苷酸，其包含与编码EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261 旁系同源物及其片段和变异的核酸分享至少90％、至少91％、至少92％、至 少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、 至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、 至少99.7％、至少99.8％，或至少99.9％同一性的核酸序列。

本发明进一步提供分离的氨基酸序列(例如，肽、多肽及其类似物)，其包 含由EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其片 段和变异的核酸序列编码的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供分离的氨基酸序列，其形成的蛋白质分 享与由EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其 片段和变异的核酸序列编码的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、 至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少 99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至 少99.6％、至少99.7％、至少99.8％，或至少99.9％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供分离的氨基酸序列，其形成的蛋白质分 享与由EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其 片段和变异的核酸序列编码的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、 至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少 94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、 至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、 至少99.8％，或至少99.9％同一性的氨基酸序列。

本发明还提供嵌合基因，其包含可操作地与适当的调控序列连接的任一 上述多核苷酸的分离的核酸序列。

本发明还提供包含如上所述的嵌合基因的重组构建体。

本发明进一步包含基于本发明核酸序列表达的干扰RNA(RNAi)，其中这 些RNAi包括但不局限于可被用于基因沉默构建体的微小RNA(miRNA)和小 干扰RNA(siRNA)。

本发明还提供转化的宿主细胞，其包含如上所述的嵌合基因。在一个实 施方案中，所述宿主细胞选自：细菌、酵母、丝状真菌、藻类、动物和植物。

本发明在另一方面还提供植物，其基因组中包含如本文所述的一个或多 个基因、如本文所述的一个或多个具有突变的基因，或如本文所述的嵌合基 因。在一些实施方案中，所述植物源自对大豆包囊线虫(SCN)敏感的大豆品种， 且其中所述基因包括编码衍生于G.pescadrensis的EG261直系同源物的核酸 序列。

本发明在另一方面提供由本文描述的植物获得的植物种子，其中所述产 生这些种子的植物在其基因组中包含一个或多个如本文所述的基因、一个或 多个如本文所述的具有突变的基因，或如本文所述的嵌合基因。

在一些实施方案中，所述方法包括在一个或多个关于EG261、EG261同 源物、EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其片段和变异的核酸序列中 引入突变。

一方面，本发明提供植物育种方法来改变，例如，赋予或增加，病原体 耐受和/或抗性。在一个实施方案中，这些方法包括将包含EG261、EG261同 源物、EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其片段和变异的一个或多个 核酸序列的第一植物与相同或不同种的第二植物进行杂交来产生F1植物；将 F1植物与第二植物回交；并重复所述回交步骤来生成近等基因系，其中所述 EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其片段和 变异的一个或多个核酸序列整合至第二植物的基因组中；其中所述源自第二 植物的近等基因系具有改变的，例如，增加的，病原体耐受和/或抗性。选择 性地，这些方法可通过利用用来验证第二植物中包含EG261、EG261同源物、 EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其片段和变异的核酸序列的各种生 物技术方法来加以辅助。在一些实施方案中，所述第一植物包含编码衍生于 G.pescadrensis的EG261直系同源物的核酸序列。在一些实施方案中，所述 第二植物为对大豆胞囊线虫(SCN)敏感的大豆品种。

本发明提供分离的多核苷酸，其包括选自下组的核酸序列：(a)与编码 EG261的核酸序列具有至少95％相同核苷酸的核酸序列；(b)与编码EG261 同源物的核酸序列具有至少95％相同核苷酸的核酸序列；(c)与编码EG261 直系同源物的核酸序列具有至少95％相同核苷酸的核酸序列；(d)与编码 EG261旁系同源物的核酸序列具有至少95％相同核苷酸的核酸序列；(e)(a)、 (b)、(c)或(d)核酸序列的互补序列(complement)；(f)(a)、(b)、(c)或(d)核酸序 列的反向互补序列；(g)(a)、(b)、(c)或(d)核酸序列的反向序列；(h)(a)、(b)、 (c)或(d)核酸序列的mRNA序列；以及，(i)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g) 和(h)核酸序列的片段和变异。

本发明提供载体，其包含本文所述的一个或多个多核苷酸。

本发明还提供遗传构建体，其包含本文所述的一个或多个分离的多核苷 酸。

本发明还提供遗传构建体，其按5′-3′方向包含：(a)启动子序列，(b)本 文所述的一个或多个分离的多核苷酸；以及(c)基因终止序列。

在本发明的一些实施方案中，所述遗传构建体包含编码能够改变病原体 耐受和/或抗性的多肽的开放阅读框。

在本发明的一些实施方案中，所述病原体耐受和/或抗性被赋予或增强。

在本发明的一些实施方案中，所述病原体是大豆包囊线虫。

本发明还进一步提供转基因细胞，其包含本文所述的遗传构建体。

本发明还提供生物体，其包含本文所述的转基因细胞。

在本发明的一些实施方案中，所述生物体是植物。在本发明的一些具体 实施方案中，所述植物是大豆植物。

本发明提供因为遗传本文所述的多核苷酸而具有改变的病原体耐受和/ 或抗性的植物及其子代植物。

本发明提供产生杂交种子的方法，其包括将本文所述的植物和子代植物 与同种的不同植物杂交，并收获所得种子。

本发明还提供用于在靶生物体中修饰基因表达的方法，其包括将本文所 述的遗传构建体稳定合并至所述生物体的基因组中。在一些这样的本发明实 施方案中，所述生物体是植物。在一些具体的实施方案中，所述植物是大豆 (soybean)植物、菜豆(garden bean)或豇豆(cowpea)植物。

本发明提供用于产生具有改变的病原体耐受和/或抗性的植物的方法，其 包括：(a)将遗传构建体转化至植物细胞来提供转基因细胞，其中所述遗传构 建体包含：(i)启动子序列；(ii)如本文所述的本发明的分离的多核苷酸序列； 以及(iii)基因终止序列；以及(b)在有益于具有改变的病原体耐受和/或抗性 的植物再生和成熟植物生长的条件下培养所述转基因细胞。在一些这样的实 施方案中，所述植物细胞是大豆植物细胞、菜豆植物细胞或豇豆植物细胞。

本发明还提供用于修饰靶生物体表型的方法，其包括将遗传构建体稳定 合并至靶生物体的基因组中，所述遗传构建体包括：(a)启动子序列；(b)如 本文所述的本发明的分离的多核苷酸序列；以及(c)基因终止序列。在一些这 样的实施方案中，所述靶生物体是植物。在一些具体的实施方案中，所述植 物是大豆植物、菜豆植物或豇豆植物。

本发明提供判断在植物中有无编码EG261、EG261同源物、EG261直系 同源物、EG261旁系同源物及其片段和变异的多核苷酸存在的方法，其中所 述方法至少包括下列之一：(a)从所述植物中分离核酸分子并扩增与所述多核 苷酸同源的序列；(b)从所述植物中分离核酸分子并实施Southern杂交来检 测所述多核苷酸；(c)从所述植物中分离蛋白质并利用所述多核苷酸编码的蛋 白质的抗体实施蛋白质印迹分析；和/或(d)证实衍生于多核苷酸mRNA转录 物并且为所述多核苷酸独有的mRNA序列的存在。

本发明提供产生改变的病原体耐受和/或抗性的植物的育种方法，其包括： i)将具有权利要求1的分离的多核苷酸序列的第一植物与第二植物进行杂交 来产生F1植物；ii)将所述F1植物与所述第二植物回交；并iii)重复所述回 交步骤来生成近等基因或等基因系，其中所述权利要求1的分离的多核苷酸 序列被整合至第二植物的基因组中，且所述源自第二植物的具有所述分离的 多核苷酸序列的近等基因或等基因系具有与无所述分离的多核苷酸序列的第 二植物相比被赋予的或增强的病原体耐受和/或抗性。在本发明一些这样的实 施方案中，所述植物为大豆。在本发明一些这样的实施方案中，所述病原体 是大豆包囊线虫。在一些实施方案中，所述第一植物包含编码衍生于G. pescadrensis的EG261直系同源物的核酸序列。在一些实施方案中，所述第 二植物为对大豆胞囊线虫(SCN)敏感的大豆品种。

本发明提供产生具有赋予的或增强的病原体耐受和/或抗性的植物的方 法，该方法包括：(a)将包含编码EG261、EG261同源物、EG261直系同源 物、EG261旁系同源物及其片段和变异的多核苷酸序列的第一植物与第二植 物杂交，并收获所得种子；(b)判断所得种子或由所得种子生长的植物细胞或 组织中存在所述多核苷酸；其中所述判断包括至少下列之一：(i)从所得种子 或由所得种子生长的植物细胞或组织中分离核酸分子并扩增与所述多核苷酸 同源的序列；(ii)从所得种子或由所得种子生长的植物细胞或组织中分离核 酸分子并实施Southern杂交来检测所述多核苷酸；(iii)从所得种子或由所得 种子生长的植物细胞或组织中分离蛋白质并利用所述多核苷酸编码的蛋白质 的抗体实施蛋白质免疫印迹分析；和/或(iv)证实所得种子或由所得种子生长 的植物细胞或组织中源自多核苷酸mRNA转录物并且为所述多核苷酸独有的 mRNA序列的存在。在一些这样的实施方案中，所述方法进一步包括确认所 得种子或由所得种子生长的植物细胞或组织中包含所述多核苷酸。在一些这 样的实施方案中，所述方法进一步包括在植物育种方案中采用包含所述多核 苷酸的所得植物。在一些这样的实施方案中，所述方法进一步包括将包含所 述多核苷酸的所得植物与同种的另一植物杂交。在一些实施方案中，所述第 一植物包括编码衍生于G.pescadrensis的EG261直系同源物的核酸序列。在 一些实施方案中，所述第二植物为对大豆胞囊线虫(SCN)敏感的大豆品种。

本发明还提供将根据本发明分离的赋予线虫抗性的EG261直系同源物引 入至同种或不同种的线虫易感植物中以增加所述植物的线虫抗性的方法，以 及通过这种方法产生的植物。

本发明还提供将本发明的EG261直系同源物引入至同种或不同种的抗 线虫植物中以进一步增强植物的线虫抗性的方法，以及通过这种方法产生的 植物。举例来说，根据本发明，编码下列任一蛋白质的基因：SEQ ID NOs:9-15、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、37、38、39、43、44、45、51、52、 53、54、55、57、59、61、63、64或65可被引入至包含任何抗线虫性状如 rhg1、rhg4或任何其他已知的数量性状基因(QTL)(如列于Concibido等，2004 (A decade of QTL mapping for cyst nematode resistance in soybean,Crop Sci.44: 1121-1131)；Shannon等，(2004)Breeding for resistance and tolerance,In:Biology  and management of soybean cyst nematode,2^nd ed,P.Schmitt,J.A.Wrather,and  R.D.Riggs,(editors).Pg155-180以及Klink等，(2013)Engineered Soybean Cyst  Nematode Resistance,In:Soybean-Pest Resistance,Hany A.El-Shemy(editor), pg-139-172中的那些)的抗线虫植物中。

本发明还提供通过非转基因(即，传统的)方法如植物育种将线虫抗性合 并至植物中，以及利用这种方法产生的植物。举例而言，根据本发明，可将 具有天然存在或转基因的赋予线虫抗性的EG261基因拷贝的第一植物与第二 植物杂交来产生F1植物。随后使该F1植物经受多次回交来生成近等基因或 等基因系，其中所述的EG261抗线虫拷贝被整合至所述第二植物的基因组中。

本发明所述EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁系同 源物，和/或其片段和变异在许多远亲植物种中提供广泛的病原体抗性。举例 而言，EG261直系同源物可在众多商业上至关重要的作物物种中有效，包括， 例如，大豆、菜豆、豇豆和棉。

附图简述

图1描述的结果表明EG261的沉默降低了“Fayette”，一种抗SCN大豆 品种，的SCN抗性。

图2描述由SEQ ID NOs 9-15的Dirigent基因编码的Dirigent蛋白质的序 列比对。

图3描述由茄科(Solanaceae family)植物物种的Dirigent基因编码的 Dirigent蛋白质的序列比对。

图4描述由单子叶植物物种的Dirigent基因编码的Dirigent蛋白质的序 列比对。

发明详述

定义

术语“一个”或“一种”指该实体的一个或多个/一种或多种；举例而言，“一 个/一种基因”指一个或多个基因或至少一个基因。同样地，术语“一个”(或“一 种”)，“一个或多个”以及“至少一个”在本文中可交替使用。此外，参考不定冠 词修饰的“元素”，除非上下文清楚要求有一种或仅一种所述元素，“一个”或 “一种”并不排除多于一种所述元素存在的可能性，。

本文所使用的动词“包含”在说明书及权利要求书中的使用和以其非限制 性时态使用的词形变化意为该词随后的项目被包括在内，但没有具体提到的 项目并非排除在外。

本文所用术语“植物”指属于植物界的任何有生命的生物体(即，植物界的 任何属/种)，包括但不局限于大豆属(Glycine spp.)(例如，大豆)、茄科种 (Solanaceae species)(例如，番茄(Solanum lycopersicum)、克梅留斯基番茄 (Solanum chmielewskii)、多毛番茄(Solanum habrochaites)、Solanum  corneliomulleri、辣椒(Capsicum annuum)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯 (Solanum tuberosum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、豇豆(Vigna unguiculata)、阿 拉比卡咖啡(Coffee arabica)、玉米(Zea mays)、高粱属的种(Sorghum spp.)、水 稻(Oryza sativa)、小麦属的种(Triticum spp.)、大麦属的种(Hordeum spp.)、陆 地棉(Gossypium hirsutum)和Heliotropium curassavicum。

本文所用术语“植物部分”指植物的任何部分，其包括但不局限于芽、根、 茎、种子、果实、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞片、枝条、叶柄、节间、 树皮、柔毛、分蘖、根茎、复叶(frond)、叶片、花粉、雄蕊、主根(rootstock)、 接穗等。生长于某些培养基，如土壤，的植物的两个主要部分通常指作为“地 上”或“空气中”的部分，也经常指作为“芽”，以及“地下”的部分，也经常指“根”。

当谈到植物时，本文所用术语“胚珠”指雌配子体，而术语“花粉”意为雄 配子体。

本文所用术语“植物组织”指植物的任何部分。植物器官的实例包括，但 不局限于，叶、茎(stem)、根、块茎、种子、枝、柔毛、结节、叶腋、花、花 粉、雄蕊、雌蕊、花瓣、花序梗、茎(stalk)、柱头、花柱、苞片、果实、主干、 心皮、萼片、花药、胚珠、花梗、针、锥、根茎、匍匐茎、幼苗、果皮、胚 乳、胎盘、浆果、雄蕊和叶鞘。

本文所用术语“表型”指由个体的基因组成(即，基因型)和环境相互作用所 致的个体细胞、细胞培养物、生物体(例如，植物)或生物体组的可观察特征。

本文所用的术语“核酸”指任何长度核苷酸(或为核糖核苷酸或为脱氧核 糖核酸)，或其类似物的聚合形式。该术语指分子的初级结构，且因此包括双 链和单链DNA，以及双链和单链RNA。其还包括被修饰的核酸，如甲基化 的和/或带帽的核酸、包含经修饰的碱基的核酸、骨架修饰等。术语“核酸”及“核 苷酸序列”可交替使用。

本文所用术语“核苷酸变化”或“核苷酸修饰”指被本领域熟知的变化修饰， 例如，核苷酸取代、缺失、和/或插入。举例而言，这些核苷酸变化/修饰包括 含有产生沉默的取代、添加或缺失，但不改变编码蛋白质的性质或活性或所 述蛋白质如何生成的改变的突变。作为另一实例，这些核苷酸变化/修饰包括 含有产生改变编码蛋白质的性质或活性或所述蛋白质如何生成的替代性取代、 添加或缺失的改变的突变。

本文所用术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”在本文中可交替使用来指代任 何长度的氨基酸聚合物。这些术语还包括被通过包括糖基化、乙酰化以及磷 酸化的反应进行的翻译后修饰的蛋白质。

本文所用术语“蛋白质修饰”指被本领域熟知的修饰，例如，氨基酸取代、 氨基酸修饰、缺失，和/或插入。

本文所用术语“衍生于/源自”指起源或来源，且可包括天然存在的、重组、 未纯化的或纯化的分子。衍生于一个起源或来源的核酸或氨基酸可具有如本 文别处定义的所有种类的核苷酸变化或蛋白质修饰。

本文所用术语“病原体”指引起疾病的作用剂，特别是有生命的微生物， 如昆虫、细菌、病毒、线虫或真菌。

本文所用术语“线虫”指具有未分段的、圆柱形身体、每一端通常变窄的 线虫动物门的多种蠕虫中的任一种，且包括如钩虫和蛲虫的寄生形式。其在 某些上下文中指“蛔虫”。已有多于28000种线虫品种被描述，但其非常难于 区分。植物寄生线虫包括导致严重农作物损失的多种类型。最常见的属为叶 芽线虫属(Aphelenchoides)(福利亚线虫(foliar nematode))、茎线虫属 (Ditylenchus)、球形胞囊线虫属(Globodera)(马铃薯包囊线虫)、异皮线虫属 (Heterodera)(大豆包囊线虫)、针线虫属(Longidorus)、根结线虫属(Meloidogyne) (根结线虫)、珍珠线虫属(Nacobbus)、根腐线虫属(Pratylenchus)(病变线虫)、 毛刺线虫属(Trichodorus)和剑线虫属(Xiphinema)(匕首线虫)。多种寄生植物线 虫物种可导致对根的组织学损伤，包括可见瘿的形成(举例而言，由于根结线 虫)，其成为在田间对它们的诊断有用的特征。一些线虫种通过其在根部的进 食活动将病毒传播至植物。其中之一是标准剑线虫(Xiphinema index)，是葡萄 扇叶病毒(葡萄的一种重要疾病)的载体。其他线虫攻击树皮和树林中的树。该 类型最重要的代表是松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)，即松木线虫，出 现于亚洲和美洲且近来被发现于欧洲。

本文所用词组“大豆包囊线虫”以及术语“SCN”各指大豆包囊线虫 (Heterodera glycines)，一种植物寄生线虫且是全球范围的大豆，包括Glycine  max大豆，的毁灭性的害虫。线虫感染大豆的根，且雌性线虫最终变成包囊。 感染导致多种症状，其可包括叶和茎的萎黄病、根坏死、种子收率损失以及 根和芽的生长抑制。SCN从1950年代开始威胁美国农作物，每年可减少500 万美金的大豆种植回报且使收率降低百分之75之多。其也是全球大豆种植区 域，包括南美和亚洲，的显著问题。

本文所用术语“抗”或“抗性”用于描述植物、品系或栽培品种与易感(或更 易感)植物相比对于生物害虫或病原体表现出较少或减轻的症状。这些术语多 方面地用于描述没有表现出症状以及表现出一些症状但仍能够产生具有可接 受产量的可销售产品的植物。一些称为有抗性的品系指其仅处于即使植物看 起来外表发育不良但仍能够产生农作物且与未感染植物相比产量下降的状态。 如国际种子联盟(ISF)，一个代表种子产业的非政府管理的非盈利性组织(见 “Definition of the Terms Describing the Reaction of Plants to Pests or Pathogens  and to Abiotic Stresses for the Vegetable Seed Industry”,May 2005)，所界定，认 可一种植物是否被或受一种害虫或病原体影响依赖于所用分析方法。抗性被 ISF定义为，与在相似的环境条件以及害虫或病原体压力下的易感植物品种相 比，植物类型制特定害虫或病原体生长和发育和/或其导致的损害的能力。抗 性植物类型可仍表现出一些病状或损伤。对抗性的两种水平进行了限定。术 语“高/标准抗性”用于指与易感品种相比在一般害虫或病原体压力下高度限制 特定害虫或病原体生长及发育的植物。“温和/中度抗性”用于指限制特定害虫 或病原体生长及发育的植物类型，但其与具有高度抗性的植物相比仍表现出 较大范围的症状或损伤。具有中度抗性的植物类型在相似田间条件和病原体 压力下将表现出与易感植物品种相比比较不严重的症状。评估抗性的方法为 本领域技术人员熟知。这些评估可通过对植物或植物部分(举例而言，叶、根、 花、果实等)的视觉观察来对症状的严重程度进行判定。举例而言，当每个植 物基于反应或症状的严重性被给与1至5级别内的抗性分数，其中1为适用 于抗性最强的植物的抗性分数(例如，无症状，或具有最少症状)，而5是适用 于具有最严重症状的植物的分数，然则当至少75％的植物打分在1、2或3水 平时将某个品系评委抗性的，同时易感品系为那些具有多于25％的植物打分 在4或5水平的品系。如果可以进行更加详细的视觉评估，那么可利用由1 至10的级别使得分数具有更宽的范围，且因此有望在被评估的植物中提供分 布更广的分数。

另一计分系统是基于接种后坏死发展以及其相对于子叶的位置的根部接 种测试(如源自Bosland等，1991的测试)，其中0代表感染后无症状；1代表 感染后在胚轴处的小坏死；2代表感染后在子叶以下的坏死；3代表感染后子 叶以上的坏死；4代表感染后子叶以上的坏死伴随植物枯萎；同时最终，5代 表植物死亡。

除这些视觉评估以外，疾病评估可通过利用电子显微镜和/或通过分子生 物学的方法判断病原体在植物或植物部分中的生物密度来确定，如蛋白质杂 交(例如，ELISA，测量病原体蛋白质密度)和/或核酸杂交(例如，RT-PCR，测 量病原体RNA密度)。取决于特定病原体/植物组合，举例而言，如果其具有 的病原体RNA/DNA和/或蛋白质密度为易感植物中的RNA/DNA和/或蛋白质 的约50％、或约40％、或约30％、或约20％、或约10％或约5％、或约2％、 或约1％、或约0.1％、或约0.01％、或约0.001％、或约0.0001％，可能将某 个植物确定为对病原体是抗性的。

用于培育植物的疾病抗性的方法与那些用于针对其他特征育种的方法相 似。有必要了解尽可能多的宿主植物的抗性特征的遗传本质以及病原体的生 理小种或株的存在。

本文所用术语“完全抗性”指病原体在感染后彻底不能发展，且可能因病 原体不能进入细胞(无初始感染)而导致或可能因病原体在细胞中不能增殖进 而感染子代细胞而导致(无限下感染，无传播)。完全抗性的存在可以通过在植 物细胞中确定无病原体蛋白质或RNA、以及在所述植物暴露于感染剂量的病 原体后(即‘感染’后)在所述植物中无任何疾病症状来确定。在育种者中，这些 表型通常被称为“免疫”。因此“免疫”在本文中用于指特征为甚至当病原体通 过例如电穿孔被主动转移至细胞中时病原体不存在复制的抗性形式。

如本文所用的术语“部分抗性”指细胞中降低的病原体增殖，以及减弱的 (系统的)病原体运动，和/或感染后减缓的症状发展。部分抗性的存在可通过 确定植物中低浓度的病原体蛋白质或病原体RNA的系统性存在以及当所述 植物暴露于感染剂量的病原体时在所述植物中存在减弱或延迟的疾病症状来 确定。蛋白质浓度可利用量化检测方法判定(例如，酶联免疫吸附试验(ELISA) 方法或定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR))。在育种者中，这些表型通常被 指为“中度抗性”。

本文所用术语“耐受”被用于表明植物的表型，其中当所述植物暴露于感 染剂量的病原体时，即使病原体感染存在于系统或局部、病原体增殖、至少 病原体基因组序列在所述植物中存在和/或其基因组整合可被确定，疾病症状 并不存在。耐受植物因此可抵抗症状的表达但却是病原体的无症状携带体。 有些时候，病原体序列可在不引发疾病症状的情况下在植物中存在甚至增殖。 这种现象也被称为“潜伏感染”。在潜伏感染中，病原体能够以真正潜伏非感 染的隐匿形式存在，其可作为整合的基因组或附加体(因此不能在细胞质中发 现病原体蛋白质，但PCR方案可表明病原体核酸序列的存在)或作为传染性 的连续复制体。重新活化的病原体可以在易感接触中传播并起始传染性疾病。 “潜伏感染”的存在与“耐受”表型在植物中难以区分。

本文所用术语“易感”指植物不具有或本质上没有对于病原体的抗性，导 致病原体进入植物中并增殖以及病原体系统性传播，引起疾病症状。术语“易 感”因此等同于“非抗”。

本文所用术语“后代”指任何来自源于一个或多个亲本植物或其后代的无 性或有性繁殖所获得的子代植物。例如后代植物可通过克隆或亲本植物自交 或通过两个亲本植物的杂交获得，并包括自交后代以及F1或F2或更进一步 的后代。F1是由至少其中之一的亲本为第一次用于某个性状的供体的亲本所 产生的第一代后代，同时第二代(F2)的后代或接下来的逐代(F3、F4等)是由 F1代、F2代等自交所产生的样本。F1因此可以由(且通常是)两种纯系亲本(纯 系亲本就某个性状是纯合的)之间进行杂交获得，同时F2可以是(且通常是) 由所属F1杂交体自交所获得的后代。

本文所用术语“杂交”、“进行杂交”、“异体授粉”或“杂交育种”指通过该过 程，一株植物上一朵花的花粉被施用于(人工或自然地)另一植物上的花的胚珠 (柱头)。

本文所用术语“栽培种”指通过园艺或农艺技术产生的植物品种、株(strain) 或种(race)，并且其在野生种群中通常不存在。

本文所用术语“双子叶植物”、“双子叶”以及“双子叶的”指具有包含两个 一半种子或子叶的胚的有花植物。实例包括烟草；番茄；豆类植物，包括豌 豆、苜蓿、三叶草和大豆；橡树；枫树；蔷薇；薄荷；南瓜；雏菊；核桃； 仙人掌；紫罗兰和毛茛。

本文所用术语“单子叶植物”、“单子叶”或“单子叶的”指任何具有包含唯 一一个子叶的胚且通常具有平行叶脉的叶、三倍数花部且茎和根中无次级生 长的有花植物。实例包括百合；兰花；水稻；玉米，禾本科植物，如高羊茅、 山羊草、早熟禾(Kentucky bluegrass)；谷物，如小麦、燕麦和大麦；鸢尾；洋 葱和棕榈。

本文所用术语“基因”指任何与生物学功能相关的DNA片段。因此，基因 包括，但不局限于，编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因还可以包括 非表达DNA片段，举例而言，其形成供其他蛋白质用的识别序列。基因可由 多种来源获得，包括从感兴趣的来源克隆或由已知或预测的序列信息来合成， 还可以包括具有预期参数的设计序列。

本文所用术语“基因型”指个体细胞、细胞培养物、组织、生物体(例如， 植物)，或生物体组的基因组成。

本文所用术语“等位基因”意为任何基因的一个或多个可选形式，所有这 些等位基因涉及至少一个性状或特征。在二倍体细胞中，给定基因的两个等 位基团在一对同源染色体上占据相应的基因座。由于本发明涉及QTL，即可 能包括一个或多个基因或调控序列的基因组区域，在某些情况下其更精确地 可指“单元型”(即染色体片段的等位基因)而非“等位基因”，然而，在那些情况 下，术语“等位基因”应该被理解为包含术语“单元型”。在表达相似表型时可 认为等位基因完全相同。只要没有重要到影响表型，序列可存在不同。

本文所用术语“基因座”(复数：“基因座”)指任何在基因水平被定义的位点。 基因座可以是基因，或基因的一部分，或具有某种调控功能的DNA序列，且 可被不同序列占据。

本文所用术语“分子标记”或“遗传标记”指在将核酸序列特征区别形象化 的方法中所用的指示物。这些指示物的实例包括限制性片段长度多态性 (RFLP)标记、扩增片段长度多态性(AFLP)标记、单核苷酸多态性(SNP)、插入 突变、微卫星标记(SSR)、序列特征性扩增区域(SCAR)、切割扩增多态性序 列(CAPS)标记或同工酶标记或可以限定基因和染色体位置的本文所述标记的 组合。等位基因附近分子标记的定位是分子生物学技术领域常规技术人员能 够轻松实施的步骤，例如，该技术被详述于Lefebvre and Chevre,1995；Lorez  and Wenzel,2007，Srivastava and Narula,2004，Meksem and Kahl,2005，Phillips  and Vasil,2001中。关于AFLP技术的常规信息可在Vos等(1995,AFLP:a new  technique for DNA fingerprinting,Nucleic Acids Res.1995 November 11；23(21): 4407–4414)中找到。

本文所用术语“半合子”指其中某个基因仅以某种基因型出现一次的细胞、 组织或生物体，如在单倍体细胞或生物体中的基因、在异配性别中的伴性基 因，或在其中其配偶片段已被删除的二倍体细胞或生物体中的染色体片段中 的基因。

本文所用术语“杂合体”指具有在至少一个基因座存在的不同等位基因 (给定基因的形式)的二倍体或多倍体个体细胞或植物。

本文所用术语“杂合的”指在某一特定基因座的不同等位基团(给定基因 的形式)的存在。

本文所用术语“纯合体”指具有在一个或多个基因座的相同等位基因的个 体细胞或植物。

本文所用术语“纯合的”指同源染色体片段中的一个或多个基因座的相同 等位基因的存在。

本文所用术语“同源的”或“同源物”为本领域公知且其指享有共同祖先或 家族成员的相关序列，并基于序列同一性的程度进行确定。本文中术语“同源 性”、“同源的”、“基本上相似”以及“基本上对应”可交替使用。同源物通常控 制、调节或影响相同或相似的生化途径，但特定的同源物可导致不同表型。 因此可被理解的是，正如本领域技术人员会理解的，本发明覆盖比特定例举 的序列更多的内容。这些术语描述了发现于一个种、亚种、品种、栽培种或 株系的基因与在其他种、亚种、品种、栽培种或株系中的相应的或等同的基 因之间的关系。为此本发明对同源序列进行了比较。

术语“同源物”在某些情况下也被应用于由物种形成事件分离的基因之间 的关系(见“直系同源物”)或引用于由基因复制事件分离的基因之间的关系。

术语“直系同源物”指从共同祖先由于物种形成在不同种中进化出的基因。 通常情况下，直系同源物在进化的过程中保持相同功能。在新测序基因组中 直系同源物的鉴别对于可靠的预测基因功能至关重要。

术语“旁系同源物”指在基因组内由于复制而相关的基因。尽管直系同源 物通常在进化的过程中保持相同功能，旁系同源物却能够进化出新的功能， 即使它们与同一原始基因相关。

“同源序列”或“同源物”或“直系同源物”被认为、确信或已知功能上相关。 功能性关系可由众多方式中的一种表明，包括，但不局限于：(a)序列同一性 的程度和/或(b)相同或相似的生物学功能。优选地，表明(a)和(b)两者。序 列同一性的程度可以发生变化，但在一个实施方案中，为至少50％(当采用本 领域所知的标准序列比对软件)、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、 至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少 94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少98.5％、或至少 99％、或至少99.5％、或至少99.8％、或至少99.9％。同源性可利用本领域已 有的软件程序进行确定，如那些Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel等，eds.,1987)Supplement 30,section 7.718,Table 7.71中讨论的。一 些比对软件是MacVector(Oxford Molecular Ltd,Oxford,U.K.)和ALIGN Plus (Scientific and Educational Software,Pennsylvania)。其他非限制性比对程序包 括Sequencher(Gene Codes,Ann Arbor,Michigan)、AlignX和Vector NTI (Invitrogen,Carlsbad,CA)。

本文所用术语“杂种/杂交体”指任何从具有一个或多个不同基因的亲本 之间杂交所得的个体细胞、组织或植物。

本文所用术语“近交体”或“近交系”指相对纯种的株系。

本文所用术语“单等位基因转化植物”指那些通过称为回交的植物育种技 术发育的植物，其中通过回交技术除单等位基因被转移至近交体外基本所有 近交体预期的形态和生理特征得到恢复。

本文中，术语“品系(line)”被广泛使用，其包括但不局限于，来自单亲本 植物通过组织培养技术无性繁殖的植物组或由来自共同亲本谱系因此基因水 平非常相似的近交体的植物组。植物被称为“属于”特定的品系如果其(a)为从 该品系材料再生的初代转化(T0)植物；(b)具有包含该品系T0植物的谱系 (pedigree)；或(c)由于共同祖先因此在基因水平非常相似(例如，通过近交或 自交)。在该背景下，术语“谱系”指代植物的世系，例如，就受影响的有性杂 交而言，使得基因或基因的组合(在杂合(半杂合)或纯合情况下)将期望的形状 赋予植物。

本文所用术语“基因渗入”、“基因渗入的”以及“进行基因渗入”指一个种、 品种或栽培种的基因通过杂交这些种而转移至另一个种、品种或栽培种的基 因组。所述杂交可以是天然的人工的。该过程可任选地通过与轮回亲本回交 来完成，在这种情况下基因渗入指一个种的基因通过中间杂合体与其亲本之 一进行重复回交而渗透至另一基因池中。基因渗入也可形容为杂合基因材料 稳定整合至受体植物的基因组中。

本文所用术语“群体”意为享有共同的遗传起源的在基因水平均匀或不均 匀的植物集合。

本文所用术语“品种”或“栽培种”意为通过结构特征和表现可与来自同一 种的其他品种鉴别开的相似植物群。术语“品种”在本文中与1961年12月2 日产生，并在日内瓦于1972年11月10日、1978年10月23日、1991年3 月19日修订的保护植物新品种国际公约(UPOV条约)中相应定义一致。因此， “品种”意为已知最低等级的单一植物类群中的植物分组，该分组，无论赋予 育种人权利的条件是否充分满足，可以i)通过给定基因型或基因型组合导致 的特征的表达来限定，ii)通过至少一个所述特征的表达与任何其他植物分组 区分，以及iii)就其对于维持不变地繁殖的适用性而被视作一个单元。

本文所用术语“混合选择(mass selection)”指选择的一种形式，其中选择个 体植物且下一代从其种子集合来繁殖。混合选择的更多细节在说明书中进行 描述。

本文所用术语“开放授粉”指自由暴露于一些基因流的植物种群，其与对 基因流存在有效屏障的封闭种群相反。

本文所用术语“开放授粉种群”或“开放授粉品种”指通常至少能够一定程 度交叉受精的植物，选择标准是其表现出变异仍具有一个或多个基因型或表 型特征，通过该特征所述种群或品种可与其他进行区分。对于交叉授粉没有 障碍的杂交体是开放授粉种群或开放授粉品种。

本文所用术语“自交”，“自花授粉”或“自我传粉”指一株植物的一朵花的 花粉被应用(人工或天然)于相同植物的相同或不同的花的胚珠(柱头)。

本文所用术语“杂交”、“进行杂交”、“异花授粉”或“杂交育种”指将一株植 物的一朵花的花粉应用(人工或天然)于另一植物的花的胚珠(柱头)的过程。

本文所用术语“衍生于/源自”指起源或来源，也可包括天然存在的、重组 的、未纯化或纯化的分子。衍生于一种起源或来源的核酸或氨基酸可以具有 如本文别处定义的所有种类的核苷酸变化或蛋白质修饰

本文所用术语核酸或多肽的“至少一部分”指具有代表这些序列特征的最 小尺寸的部分，或全长分子的任何更大的片段，至多包括该分子全长。举例 而言，核酸的一部分可以是12个核苷酸、13个核苷酸、14个核苷酸、15个 核苷酸、16个核苷酸、17个核苷酸、18个核苷酸、19个核苷酸、20个核苷 酸、22个核苷酸、24个核苷酸、26个核苷酸、28个核苷酸、30个核苷酸、 32个核苷酸、34个核苷酸、36个核苷酸、38个核苷酸、40个核苷酸、45个 核苷酸、50个核苷酸、55个核苷酸，依此类推，直至全长核酸。类似地，多 肽的一部分可以是4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸，依此 类推，直至全长多肽。所用部分的长度将依赖于具体的应用。应用为杂交探 针的核酸部分可短至12个核苷酸；在一个实施方案中，其为20个核苷酸。 应用为表位作用的多肽部分可以短至4个氨基酸。执行全长多肽的功能的多 肽部分通常会超过4个氨基酸。

如本文中所用，在两个核酸或多肽序列的语境下“序列同一性”或“同 一性”包括在指定的比较窗口内就最大对应性比对时指代两个相同序列中的 残基。当序列同一性百分比被用于指蛋白质时，公认的是，不相同的残基位 置差别往往在于保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基被其他具有相似化学性 质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，并因此不改变该分子的功能性质。 其中，当序列区别在于保守取代时，序列同一性百分比可被上调以校正取代 的保守性质。区别在于这些保守取代的序列被认为具有“序列相似性”或“相似 性”。用于进行这种调整的方式为本领域技术人员所熟知。通常，其涉及将保 守取代作为部分而不是全部错配进行评分，由此增加序列同一性的百分比。 因此，举例来说，如果将完全相同的氨基酸的得分给定为1，而非保守取代 被给定分数为零，则保守取代给定分数为0至1之间。保守取代的分数计算， 例如，根据Meyers和Miller的算法，Computer Applic.Biol.Sci.,4:11-17(1988)。

本文所用术语调控的“抑制”或“破坏”指调节蛋白的活性降低，且这种降 低的活性可通过多种机制，包括反义，突变敲除或RNAi来实现。反义RNA 会降低表达的蛋白质的水平，导致相比于野生型活性水平降低的蛋白质活性。 编码蛋白质的基因中的突变可能降低表达的蛋白的水平和/或干扰表达的蛋 白质的功能进而导致降低的蛋白的活性。

本文所用术语“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段” 和“分离的核酸片段”在本文中可交替使用。这些术语涵盖核苷酸序列等。多 核苷酸可以是RNA或DNA的单链或双链的聚合物，选择性含有合成的、非 天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可包括一个或多个 片段的cDNA、基因组DNA、合成DNA，或它们的混合物。核苷酸(通常以 其5'-单磷酸形式存在)由单个字母指代命名如下：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸 (分别对于RNA或DNA)，“C”代表胞苷酸或脱氧胞苷酸、“G”的为鸟苷酸或 脱氧鸟苷酸、“U”代表尿苷酸、“T”脱氧胸苷酸、“R”代表嘌呤(A或G)、“Y” 代表嘧啶(C或T)、“K”代表G或T、“H”代表A或C或T、“I”代表肌苷、 “W”代表A或T、“S”代表G或C，而“N”为任何核苷酸。

信使RNA(mRNA)是基因编码的多核苷酸序列，传统表示为字母串来标 记每个核糖核酸的位置：“A”为腺苷酸、“C”为胞苷酸、“G”为鸟苷酸、而“U” 为尿苷酸。mRNA基因的序列通常以5'单磷酸到3'羟基方向写出，并且还可 以通过其互补DNA(cDNA)序列通过将“U”尿苷酸核糖核苷酸用“T”胸苷酸代 替来表示。cDNA和mRNA序列之间这种交替使用的实例示于本申请中来自 Glycine pescadrensis的EG261(SEQ ID No.5)的cDNA序列和其相应的mRNA 序列(SEQ ID NO：66)的之间的比较。

本文所用“编码序列”指编码特定的氨基酸序列的DNA序列。“调控序列” 指位于在编码序列上游(5’非编码序列)、之内或下游(3’非编码序列)的核苷酸 序列，并且其影响转录、RNA加工或稳定性，或相关联的编码序列的翻译。

本文所用“调控序列”可以包括，但不限于，启动子、翻译前导序列、内 含子和多腺苷酸化识别序列。

本文所用“启动子”指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。 启动子序列包括近端和更远端的上游元件，后者的元件通常称作增强子。相 应地，“增强子”是能够刺激启动子活性的DNA序列，且可以是启动子的固有 元素或通过插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可整体 来源于天然基因，或由源于自然界发现的不同启动子的不同元件组成，或者 甚至包含合成的DNA片段。本领域的技术人员所熟知的是，不同的启动子可 指导不同组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同环境条件的 基因的表达。进一步认识的是，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚 未完全确定，一些变异的DNA片段可能具有相同的启动子活性。导致基因在 大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。

在一些实施方案中，本发明使用Gmubi启动子在根组织中表达EG261 基因。在其他实施方案中，利用替代性启动子包括，但不限于：花椰菜花叶 病毒(CaMV)35S启动子和增强的35S(E35S)启动子、木薯叶脉花叶病毒 (CsVMV)启动子、玄参花叶病毒(FMV)启动子和草莓镶脉病毒(SVBV2)启动 子(还可参见Hernandez-Garcia等，2010(High level transgenic expression of  soybean(Glycine max)GmERF and Gmubi gene promoters isolated by a novel  promoter analysis pipeline.BMC Plant Biol.2010 Nov 4；10:237)，以及Tucker 等，2011(Gene Expression and Shared Promoter Motif for Cell  Wall-Modifying Proteins Expressed in Soybean Cyst Nematode-Infected Roots. Plant Phys.Vol 156 pp 319-329)。

本文所用的“3’非编码序列”或“3’UTR(非翻译区)序列”指位于编码序列 下游的DNA序列，并包括多腺苷酸化识别序列以及其他编码能够影响mRNA 加工或基因表达的调控信号的序列。所述多腺苷酸化信号通常的特征在于影 响多腺苷酸片段添加到mRNA前体的3'末端。不同3’非编码序列的使用由 Ingelbrecht,I.L.,等(1989)Plant Cell 1:671-680例证。

本文所用术语“可操作地连接”指将多个核苷酸序列关联到在单一核酸片 段上，由此一个的功能由另一个调控。举例而言，当启动子能够调节编码序 列的表达时，该启动子与编码序列可操作地连接(即，所述编码序列在所述启 动子的转录控制下)。编码序列可以有义或反义的方向与调控序列可操作的连 接。在另一实例中，本发明的互补RNA区域可直接或间接地在靶mRNA的 5’、或在靶mRNA的3’、或在靶mRNA之内可操作地连接，或第一互补区域 在靶mRNA的5’而其互补序列在靶mRNA的3’。

本文所用术语“载体”、“质粒”或“构建体”广义上指任何编码外源核酸的 质粒或病毒。该术语也应理解为包括非质粒和非病毒的化合物，其促进核酸 向病毒体或细胞中的转移，如，举例而言，聚赖氨酸化合物等。该载体可以 是作为用于递送核酸或其突变体至细胞的递送运载体适合的病毒载体，或所 述载体可为适用于相同目的的非病毒性载体。用于递送DNA至细胞和组织的 病毒和非病毒载体的实例为本领域公知且被描述于，举例而言，Ma等(1997, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12744-12746)。病毒载体的实例包括，但不局 限于，重组植物病毒。植物病毒的非限制性实例包括，TMV介导的(瞬时)至 烟草中的转染(Tuipe,T-H et al(1993),J.Virology Meth,42:227-239)，ssDNA 基因组病毒(例如，联体病毒科家族(Geminiviridae))，反转录病毒(例如，花椰 菜病毒科(Caulimoviridae)、假病毒科(Pseudoviridae)和转座病毒科 (Metaviridae))，dsNRA病毒(例如，呼肠弧病毒科(Reoviridae)和分体病毒科 (Partitiviridae))，(-)ssRNA病毒(例如，弹状病毒科(Rhabdoviridae)和布尼亚病 毒科(Bunyaviridae))，(+)ssRNA病毒(例如，雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、 修道院病毒科(Closteroviridae)、豇豆镶嵌病毒科(Comoviridae)、黄症病毒科 (Luteoviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、随伴病毒科(Sequiviridae)和番 茄丛矮病毒科(Tombusviridae))以及类病毒(例如，马铃薯纺锤形块茎类病毒科 (Pospiviroldae)和鳄梨白斑类病毒科(Avsunviroidae))。植物病毒的详细分类信 息可以在Fauquet等(2008,"Geminivirus strain demarcation and nomenclature". Archives of Virology 153:783–821，全文作为参考文献并入本文)以及Khan等 (Plant viruses as molecular pathogens；Publisher Routledge,2002,ISBN 1560228954,9781560228950)中找到。非病毒载体的实例包括，但不局限于， 脂质体、DNA的聚胺衍生物等。

本发明提供了一种分离的核酸序列，其包含选自EG261、EG261同源物、 EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其片段和变异的序列。在一个实施 方案中，本发明提供了编码由所述EG261核酸序列产生的Dirigent蛋白的分 离的多核苷酸，其包括与EG261共享至少90％、至少91％、至少92％、至少 93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、 至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、 至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％同一性的核酸序列。

用于比较的序列比对方法为本领域公知。多种程序和比对算法被描述于： Smith and Waterman(Adv.Appl.Math.,2:482,1981)；Needleman and Wunsch(J. Mol.Biol.,48:443,1970)；Pearson and Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.,85:2444, 1988)；Higgins and Sharp(Gene,73:237-44,1988)；Higgins和Sharp(CABIOS, 5:151-53,1989)；Corpet等(Nuc.Acids Res.,16:10881-90,1988)；Huang等(Comp. Appls Biosci.,8:155-65,1992)；以及Pearson等(Meth.Mol.Biol.,24:307-31, 1994)。Altschul等(Nature Genet.,6:119-29,1994)提出了详细的关于序列比对 方法和同源性计算的思考。

本发明还提供了嵌合基因，其包括如上所述的与适合的调控序列可操作 连接的任一多核苷酸的分离的核酸序列。

本发明还提供重组构建体，其包含如上所述的嵌合基因。在一个实施方 案中，所述重组构建体是基因沉默构建体，如用于RNAi基因沉默。

本发明的表达载体优选包括至少一种可选择标记。这样的标记包括用于 真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性和用于在大肠杆菌 (E.coli)和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因。

本发明还提供转化的宿主细胞，其包含如上所述的嵌合基因。在一个实 施方案中，所述宿主细胞选自下组：细菌、酵母、丝状真菌、藻类、动物和 植物。

这些序列允许针对EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261 旁系同源物及其片段和变异设计基因特异性引物和探针。

本文所用术语“引物”指当被置于诱导引物扩增产物合成的条件下时，即 在核苷酸和用于多聚化的作用剂如DNA聚合酶存在下并在合适的温度和pH 值下，能够退火到扩增靶物使DNA聚合酶能够附着，进而充当DNA合成的 初始位点的寡核苷酸。在扩增中，为最大化扩增效率，所述(扩增)引物优选地 为单链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。所述引物必须足够长以使得在 多聚化作用剂存在下能够引发延伸产物的合成。引物的精确长度会取决于许 多因素，包括引物的温度和组成(A/T以及G/C含量)。一对常用于DNA扩增 如PCR扩增领域的双向引物由一个正向和一个反向引物组成。

探针包括识别靶核酸序列的可鉴定的、分离的核酸。探针包括附着于可 定位位点的核酸、可检测的标记物或其他与靶序列杂交的报告分子。典型的 标记物包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半 抗原和酶。已讨论用于标记的方法以及适合于各种用途的标记物的选择的指 导，例如，Sambrook等(ed.),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed., vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989 and  Ausubel等Short Protocols in Molecular Biology,4th ed.,John Wiley&Sons,Inc., 1999。

制备和使用核酸探针和引物的方法被描述于，例如，Sambrook等(ed.), Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor  Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989；Ausubel等Short Protocols in  Molecular Biology,4th ed.,John Wiley&Sons,Inc.,1999；和Innis等，PCR  Protocols,A Guide to Methods and Applications,Academic Press,Inc.,San Diego, CA,1990。扩增引物对可来源于已知序列，举例而言，通过利用旨在达到该 目的计算机程序如PRIMER(Version 0.5,1991,Whitehead Institute for  Biomedical Research,Cambridge,MA)。本领域的普通技术人员会理解特定探 针或引物的特异性随其长度增加。因此，为了获得更大的特异性，探针和引 物可以选择包含靶核苷酸序列中的至少20、25、30、35、40、45、50或更多 个连续核苷酸。

本文所用术语“大豆”指大豆(Glycine)属植物，包括但不限于以下种类： G.clandestine、G.facata，G.latifolia、G.latrobeana、G.canescens、G.tabacina、 G.tomentella、G.soja、G.max、G.Arenaria、G.argyrea、G.canescens、G. clandestine、G.curvata、G.cyrtoloba、G.microphylla、G.pescadrensis、G. pindanica、G.rubiginosa、G.soja以及G.Stenophita(见例如美国专利8389798， 和Verma等，(1996)Soybean:genetics,molecular biology and biotechnology, Verma,D.P.S.；Shoemaker,R.C.(编辑))。

本文所用术语“菜豆”或“豆”是指菜豆属植物，包括但不局限于以下种类： P.acutifolius、P.aegypticus、P.amblyosepalus、P.angustissimus、P.coccineus、 P.filiformis、P.lunatus、P.Maculates以及P.Vulgaris(见例如Turley等，1999 (Phylogenetic Analysis of the Cultivated and Wild Species of Phaseolus (Fabaceae),Systematic Botany Vol.24,No.3(Jul.–Sep.,199)pp 438-460))。

本文所用术语“豇豆”指豇豆属植物，包括但不局限于以下种类：V. aconitifolia、V.angularis、V.caracalla、V.lanceolota、V.o-wahuensis、V. umbellata、V.subterranea以及V.Unguiculata(见例如Sylla Ba等，2004(Genetic  diversity in cowpea[Vigna unguiculata(L.)Walp.]as revealed by RAPD markers  Genetic Resources and Crop Evolution 51:539–550,2004,以及Pasquet等，(2001) Cowpea.In:Tropical Plant Breeding.Charrier A.,Jacquot M.,Hamon S.and  Nicolas D.(editors),Science publishers,Enfield,pp.177–198.))。

EG261蛋白质

本发明还提供了多肽和氨基酸序列，其包含由EG261、EG261同源物、 EG261直系同源物、EG261旁系同源物及其片段和变异的核苷酸序列编码的分 离的蛋白质的至少一部分。

本发明还提供由EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁 系同源物和/或其片段和变异的核酸序列编码的分离的氨基酸序列。在一些实 施方案中，本发明提供分离的多肽，其包括与由EG261、EG261同源物、EG261 直系同源物、EG261旁系同源物和/或其片段和变异的核酸序列编码的氨基酸 序列共享至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、 约97％、约98％、约99％、约99.1％、约99.2％、约99.3％、约99.4％、约 99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或约99.9％同一性的氨基酸序列。在 一个实施方案中，本发明提供分离的多肽，其包含的氨基酸序列编码与由 EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261旁系同源物和/或其片段 和变异的核酸序列编码的氨基酸序列共享至少约85％、约86％、约87％、约 88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、 约97％、约98％、约99％、约99.1％、约99.2％、约99.3％、约99.4％、约 99.5％、约99.6％、约99.7％、约99.8％或约99.9％同一性的氨基酸序列。

本发明还包括由EG261、EG261同源物、EG261直系同源物和/或EG261 旁系同源物的核酸序列编码的氨基酸序列的蛋白质的变体和片段。所述变体 在组分蛋白质的氨基酸序列中可包含变化。关于多肽的术语“变体”指相对于 参考序列改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列。变体可具有“保守的”改变， 或“非保守”改变，例如，类似的微小变异也可以包括氨基酸缺失或插入，或 两者。

多肽的功能性片段和变异包括那些保持亲本多肽一个或多个功能的片段 和变体。公认编码多肽的基因或cDNA能够在不实质改变所述的多肽的一个 或多个功能的情况下进行相当大的突变。首先，公知遗传密码是简并的，因 此不同的密码子可编码相同的氨基酸。第二，即使引入氨基酸取代，所述突 变可以是保守的且对蛋白质的(多个)基本功能无实质性影响。见，例如，Stryer  Biochemistry 3rd Ed.,1988。第三，部分多肽链可在不损害或消除其全部功能 的情况下被删除。第四，可在多肽链中进行插入或添加，例如，添加表位标 签，而不损害或消除其功能(Ausubel等J.Immunol.159(5):2502-12,1997)。在 不实质性损害多肽的一种或多种功能的情况下可进行的其他修饰可以包括， 例如，体内或体外的化学和生化修饰或非常规氨基酸的并入。这样的修饰包 括，但不局限于，例如，乙酰化、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、标记(例 如，采用放射性核苷酸)以及多种酶的修饰，其可被本领域技术人员轻易理解。 多种用于标记多肽的方法以及用于该目的的标签为本领域公知，其包括放射 性同位素如³²P、结合至带标记的特定结合配偶体或被带标记的特定结合配偶 体结合的配体(例如，抗体)、荧光团、化学发光剂，酶和抗配体。功能性片段 和变体可为不同长度。举例而言，某些片段具有至少10、25、50、75、100、 200或甚至更多的氨基酸残基。这些突变可以是天然的或目的性改变的。在 一些实施方案中，进行含有产生沉默取代但不改变蛋白质性质或活性或所述 蛋白质如何产生的变化的突变，其为本发明的实施方案。

保守的氨基酸取代是那些当生成时干扰原始蛋白质的性质最少的取代， 即蛋白质的结构且特别是功能被保留且未被这样的取代显著改变。保守取代 一般维持(a)取代的区域中多肽骨架的结构，例如，作为片层或螺旋的构象， (b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链容积。关于保守取代的进一步信 息可见，例如，Ben Bassat等(J.Bacteriol.,169:751-757,1987),O’Regan等(Gene, 77:237-251,1989),Sahin-Toth等(Protein Sci.,3:240-247,1994),Hochuli等 (Bio/Technology,6:1321-1325,1988)以及广泛使用的遗传学和分子生物学教科 书中。Blosum矩阵通常被用于确定多肽序列的相关性。Blosum矩阵利用可 信比对的大型数据库(BLOCKS数据库)生成，其中计数通过小于某同一性百 分比阈值而关联起来的配对序列比对(Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:10915-10919,1992)。BLOSUM90矩阵的高度保守靶频率采用90％同一性 的阈值。BLOSUM65矩阵采用65％同一性的阈值。BLOSUM矩阵中，对于 选定的百分比同一性，零及其以上的分数被认为是“保守取代”。下表显示了 示例性保守氨基酸取代。

在一些实例中，变体可以具有不超过3、5、10、15、20、25、30、40、 50或100个保守氨基酸改变(如非常高度保守或高度保守的氨基酸取代)。在 其它实例中，变体序列中的一个或若干个疏水残基(如Leu、Ile、Val、Met、 Phe或Trp)可被替换为不同的疏水性残基(如Leu、Ile、Val、Met、Phe或Trp) 来产生功能上与公开的由EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、EG261 旁系同源物和/或其片段和变异的核酸序列编码的氨基酸序列功能上相似的 变体。

在一些实施方案中，由于改变编码区以配合将要引入所述分子的特定生 物体的密码子使用偏好的变体可不同于所公开的序列。在其他实施方案中， 可以通过利用遗传密码简并性来改变编码区，使得在所述核苷酸序列大幅度 改变的同时，其仍编码具有与由EG261、EG261同源物、EG261直系同源物、 EG261旁系同源物和/或其片段和变异的核酸序列编码的公开的氨基酸序列 基本上相似的氨基酸序列的蛋白质。

在一些实施方案中，提供了由本发明的EG261直系同源物衍生的功能性 片段。所述功能性片段在植物中表达时仍可以赋予病原体抗性。在一些实施 方案中，所述功能性片段至少包含野生型EG261直系同源物的Dirigent域或 其功能性变体。在一些实施方案中，所述功能性片段包含一个或多个由两个 或更多个EG261直系同源物共享、由相同植物属的两个或更多个EG261直系 同源物共享、由两个或更多个双子叶EG261直系同源物共享，和/或由两个或 更多个单子叶EG261直系同源物共享的保守区域。非限制性的保守区实例示 于图2至4。Dirigent域或保守的区域可通过任何合适的计算机程序确定，如 NCBI蛋白质BLAST程序和NCBI比对程序或等同的程序。在一些实施方案 中，功能性片段与本发明EG261直系同源物相比短1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43、44、45、46、47、48、49、50或更多个氨基酸。在一些实施方案中，通 过缺失本发明EG261直系同源物的一个或多个氨基酸来生成功能性片段。在 一些实施方案中，功能性片段与本发明的EG261直系同源物共享至少80％、 85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。

在一些实施方案中，提供了衍生于本发明EG261直系同源物的功能嵌合 或合成多肽。所述功能嵌合或合成的多肽在植物中表达时仍然可以赋予对病 原体的抗性。在一些实施方案中，所述功能嵌合或合成的多肽至少含有EG261 直系同源物的Dirigent域或其功能性变体。在一些实施方案中，所述功能嵌 合或合成的多肽包含一个或多个由两个或更多个EG261直系同源物共享、由 相同植物属中的两个或更多个EG261直系同源物共享、由两个或更多个双子 叶EG261直系同源物共享，和/或由两个或更多个单子叶EG261直系同源物 共享的保守区域。非限制性的保守区实施例示于图2至4。Dirigent域或保守 的区域可通过任何合适的计算机程序确定，如NCBI蛋白质BLAST程序和 NCBI比对程序或对等的程序。在一些实施方案中，功能嵌合或合成的多肽与 本发明的EG261直系同源物共享至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％或更多同一性。

保守区域的序列也可以用来敲低(knock-down)一个或多个EG261直系同 源物的水平。在一些实施方案中，保守区域的序列可用于生成基因沉默分子 来靶向一个或多个EG261直系同源物。在一些实施方案中，所述基因沉默分 子选自双链多核苷酸、单链多核苷酸或混合双链体寡核苷酸。在一些实施方 案中，基因沉默分子包含约10bp、15bp、19bp、20bp、21bp、25bp、30bp、 40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、150bp、200bp、250bp、300bp、 350bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp或更多个多 核苷酸的DNA/RNA片段，其中所述DNA/RNA片段与本发明的EG261直系 同源物序列的保守区域或其互补序列共享至少90％、95％、99％或更多的同 一性。

植物转化

可将编码EG261、EG261同源物、EG261直系同源物和/或EG261旁系 同源物的本发明的多核苷酸，和/或其片段和变异转化至大豆或其他植物属中。

产生转基因植物的方法为本领域的普通技术人员所熟知。转基因植物现 在可以通过各种不同的转化方法生成，包括，但不局限于，电穿孔；显微注 射；微粒轰击，也称为粒子加速或生物射弹轰击；病毒介导的转化；以及农 杆菌介导的转化。参见，例如，美国专利号5405765；5472869；5538877； 5538880；5550318；5641664；5736369和5736369；国际专利申请公开号 WO2002/038779和WO/2009/117555。Lu等，(Plant Cell Reports,2008, 27:273-278)；Watson等，Recombinant DNA,Scientific American Books(1992)； Hinchee等，Bio/Tech.6:915-922(1988)；McCabe等，Bio/Tech.6:923-926(1988)； Toriyama等，Bio/Tech.6:1072-1074(1988)；Fromm等，Bio/Tech.8:833-839 (1990)；Mullins等，Bio/Tech.8:833-839(1990)；Hiei等，Plant Molecular Biology 35:205-218(1997)；Ishida等，Nature Biotechnology 14:745-750(1996)；Zhang 等，Molecular Biotechnology 8:223-231(1997)；Ku等，Nature Biotechnology 17:76-80(1999)；和Raineri等，Bio/Tech.8:33-38(1990))，其全部明确以全文 作为参考并入本文。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种天然存在的能够将其的 DNA(遗传信息)插入植物并引起一种被称为冠瘿的植物损伤的细菌。大多数 植物物种现可采用该方法进行转化，包括葫芦科植物。

微粒轰击也称为粒子加速，生物射弹轰击，以及基因枪(基因枪)。 基因枪用来将覆盖有基因(例如，用于期望的性状)的小球冲射入植物种子或植 物组织，从而使植物细胞随后表达该新基因。基因枪使用实际爆炸(0.22口径 坯料)来推动材料。也可以使用压缩空气或蒸汽作为推进剂。该基 因枪于1983年至1984年由美国康乃尔大学John Sanford,Edward Wolf和 Nelson Allen发明。它和它的注册商标现在被杜邦公司(E.I.du Pont de  Nemours and Company)拥有。大多数植物种已用该方法进行转化。

将新的遗传物质引入植物基因组中最常见的方法包括使用细菌病原体根 癌农杆菌的活细胞来实际注入一段DNA(称为转移或T-DNA)至单个植物细胞 (通常伴随组织损伤)，其中其靶向植物细胞核进行染色体整合。已有众多专利 是关于农杆菌介导的转化以及特别设计与农杆菌一起使用的特定DNA递送 质粒——举例而言，US4536475、EP0265556、EP0270822、WO8504899、 WO8603516、US5591616、EP0604662、EP0672752、WO8603776、WO9209696、 WO9419930、WO9967357、US4399216、WO8303259、US5731179、EP068730、 WO9516031、US5693512、US6051757和EP904362A1。农杆菌介导的植物转 化涉及第一步将克隆在质粒上的DNA片段置入活农杆菌细胞，随后将其转化 至单个植物细胞中。农杆菌介导的植物转化因此是一种间接的植物转化方法。 涉及使用无T-DNA载体的农杆菌介导的植物转化的方法也为本领域技术人 员公知，且在本发明中可具有适用性。参见，举例而言，美国专利号7250554， 其在转化载体中利用P-DNA而非T-DNA。

使用农杆菌转化方法形成的转基因植物通常在一条染色体上含有单个基 因，尽管多个拷贝是可能的。这样的转基因植物就所添加的基因而言可被称 为半合子。因为每个转化植物代表一个独特的T-DNA整合事件，这样的转基 因植物更准确的名称是独立分离子(美国专利号6156953)。转基因基因座一般 由所述转基因的存在和/或不存表征。在其中一个等位基因对应于不存在所述 转基因的杂合基因型也被称为半合子(美国专利号6008437)。

采用DNA直接转化植物的方法也有报道。历史上第一个被报道的这类 方法是电穿孔，其利用施加到含有植物细胞的溶液的电流(M.E.Fromm等， Nature,319,791(1986)；H.Jones等，Plant Mol.Biol.,13,501(1989)and H. Yang等，Plant Cell Reports,7,421(1988)。另一种直接的方法被称为“生物射 弹轰击”，其使用覆盖有DNA的超细粒子，通常为钨或金，随后以足够的力 喷洒至植物组织表面进而导致所述粒子穿透植物细胞，包括厚的细胞壁、细 胞膜和核膜，但并未杀死至少其中的一些细胞(US5204253、US5015580)。第 三种直接方法利用纤维形式的金属或陶瓷构成尖锐、多孔或中空的针状突起， 其实际刺穿细胞以及细胞核膜。碳化硅和硼酸铝晶须均已用于植物转化 (Mizuno等，2004；Petolino等，2000；US5302523 US Application 20040197909) 以及用于细菌和动物转化(Kaepler等，1992；Raloff,1990；Wang,1995)。已 有其他方法被报道，且毫无疑问将开发出更多的方法。然而，所有这些间接 或直接来引入外源DNA至植物细胞中的方法效率是总是非常低，因此有必要 采用一些方法用于只选择那些已被转化的细胞，且进一步仅允许那些已经被 转化了的细胞生长和再生成植物。

关于高效植物转化，必须采用选择方法使得整个植物从单个转化细胞再 生且转化植物的每个细胞都携带感兴趣的DNA。这些方法可利用阳性选择， 其中外源基因被提供给植物细胞，这允许其利用若非如此则不能利用的存在 于培养基中的底物，如甘露糖或木糖(举例而言，参考美国5767378； US5994629)。然而，更典型地，由于更加有效而利用阴性选择，其采用杀死 或抑制未转化的植物细胞的生长并减少嵌合体的可能性的选择作用剂如除草 剂或抗生素。可在引入的用于植物转化的外来DNA中提供针对阴性选择作用 剂有效的抗性基因。举例而言，最流行使用的选择作用剂之一是抗生素卡那 霉素，连同抗性基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)，其赋予卡那霉素和相关抗生 素抗性(见，举例而言，Messing&Vierra,Gene 19:259-268(1982)；Bevan等， Nature 304:184-187(1983))。然而，许多不同的抗生素和抗生素抗性基因可用 于转化目的(参见US 5034322、US 6174724和US 6255560)。此外，多种除草 剂和除草剂抗性基因已被用于转化目的，包括bar基因，其赋予针对除草剂 膦丝菌素的抗性(White等，Nucl Acids Res 18:1062(1990),Spencer等，Theor  Appl Genet 79:625-631(1990),US 4795855,US 5378824 and US 6107549)。此 外，赋予针对抗癌剂甲氨蝶呤的抗性的dhfr基因已被用于选择(Bourouis等， EMBO J.2(7):1099-1104(1983)。

适于大豆物种转化的二元载体和转化方法的非限制性实例被描述于Yi等 2006(Transformation of multiple soybean cultivars by infecting cotyledonary-node  with Agrobacterium tumefaciens,African Journal of Biotechnology Vol.5(20),pp. 1989-1993,16 October 2006)，Paz等，2004(Assessment of conditions affecting  Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node  explant,Euphytica 136:167–179,2004)、美国专利号5376543、5416011、5968830 和5569834，或通过本领域技术人员所熟知的类似实验步骤。大豆植物可通过 使用上述参考文献中描述的任何方法来转化。

用于调节给定蛋白质表达的表达控制元件可以是通常被发现与编码序列 (同源表达元件)相关联的表达控制元件或者是异源表达控制元件。本领域已经 知晓多种同源和异源表达控制元件并且其可轻易用于生成本发明使用的表达 单元。转录起始区域，举例而言，可包括多种冠瘿碱启动区中的任何一种， 如章鱼碱、甘露碱、胭脂碱等，其发现于根癌农杆菌Ti质粒中。或者，也可 使用植物病毒启动子来控制基因在植物中的表达，如花椰菜花叶病毒19S和 35S启动子(分别为CaMV启动19S和CaMV 35S启动子)(例如，美国专利号 5352605；5530196和5858742)。也可采用衍生于CaMV的增强子序列(例如， 美国专利号5164316；5196525；5322938；5530196；5352605；5359142和 5858742)。最后，也可使用植物启动子如苔子启动子(prolifera promoter)、果 实特异性启动子、Ap3启动子、热休克启动子、种子特异性启动子等。

配子特异性启动子、组成型启动子(如CaMV或Nos启动子)、器官特异 性启动子(例如来自番茄的E8启动子)或诱导型启动子采用本领域已知的标准 技术通常与蛋白质或反义编码区连接。表达单元可以通过采用补充元件如转 录终止子和/或增强子元件来进一步优化。

因此，对于在植物中表达，除了蛋白质序列外，所述表达单元通常含有 植物启动子区域、转录起始位点和转录终止序列。通常包括位于表达单元5' 和3'端的独特的限制性酶位点以允许向预先存在的载体中的简单插入。

异源启动子/结构基因或反义组合的构建中，优选将启动子置于与其天然 设置中与转录起始位点的距离大致相同的与异源转录起始位点的距离处。然 而，如本领域所知，可在不丧失启动子功能的情况下对该距离适用一些变化。

除了启动子序列外，表达盒还可以包含结构基因下游的转录终止区以提 供有效终止。该终止区可获得自与启动子序列相同的基因或获得于不同基因。 如果由结构基因编码的mRNA将被有效加工，指导RNA多腺苷酸化的DNA 序列也经常被添加到载体构建体中。多腺苷酸化序列包括，但不局限于农杆 菌章鱼碱合酶信号(Gielen等，EMBO J 3:835-846(1984))或胆脂碱合酶信号 (Depicker等，Mol.and Appl.Genet.1:561-573(1982))。所得表达单元被连接 至或以其他方式构建纳入至适用于高等植物转化的载体中。相同载体中可以 包括一个或多个表达单元。所述载体通常包含可选择的标记基因表达单元， 由此转化植物细胞可在培养物中得到鉴定。通常，所述标记基因会编码针对 抗生素的抗性，如G418、潮霉素、博莱霉素、卡那霉素或庆大霉素，或针对 除草剂的抗性，如草甘膦(Round-up)或草铵膦(BASTA)或阿特拉津。细菌或病 毒来源的复制序列通常也被包括在内以允许该载体在细菌或噬菌体宿主中克 隆；优选地，纳入原核生物复制起点的宽宿主范围。用于细菌的可选择标记 也可以包括在内以允许带有所需构建体的细菌细胞的选择。合适的原核生物 可选择标记包括抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素或四环素。如本领域已 知，编码附加功能的其它DNA序列也可以存在于载体中。例如，在农杆菌转 化的情况下，T-DNA序列也可被包括在内用于向植物染色体的下一步转移。

通过常规方法引入所需基因或全套基因需要两个品系之间的有性杂交， 和随后在杂交后代与亲本之一之间重复回交直到获得具有预期特性的植物。 然而，该方法只限于可有性杂交的植物，且除预期基因以外的基因也被转移。

重组DNA技术通过使植物遗传学家能够鉴定和克隆关于理想性状的特 定基因，如改进的脂肪酸组成，并将这些基因引入至已经可用的植物品种来 允许植物研究人员规避这些限制。一旦外来基因被导入植物，该植物便可进 一步被用于常规植物育种方案(如，谱系育种，单种子血统育种方案，交互反 复选择)以产生同样包含感兴趣基因的后代。

基因可以按位点定向的方式利用同源重组被引入。同源重组允许内源基 因中的位点特异性修饰并因此可以修正遗传的或获得的突变，和/或可将新的 变化工程化到基因组中。植物中的同源重组和定点整合被讨论于，例如，美 国专利号5451513；5501967和5527695。

育种方法

开放授粉种群。农作物如黑麦、多种玉米和甜菜、草本草类、豆类如苜 蓿和三叶草、和热带树类作物如可可、椰子、油棕榈和橡胶的开放授粉种群 的改进本质上依赖于向固定有利等位基因的方向改变基因频率，同时维持高 度(但远不至于最大化)杂合性的程度。一致性在这类种群中并不可能且开放授 粉种群中的纯粹类型(trueness-to-type)是将种群作为整体的统计学特征，而非 个体植物的特性。因此，开放授粉种群的异质性与近交系、克隆和杂交体的 同质性(或实质上的同质性)相反。

群体改良方法自然地落入两组，即基于纯粹表型选择的方法，通常称为 混合选择，以及基于采用后代测试的选择的方法。种群间的改良采用开放育 种种群的概念；允许基因从一个种群流至另一个。一个种群内的植物(栽培种， 株系，生态型，或任何种质源)自然地(例如，通过风)或通过人工或通过蜜蜂(通 常Apis mellifera L.或苜蓿切叶蜂(Megachile rotundata F.))与来自其他种群的植 物杂交。可通过隔离两种来源具有预期性状的植物来应用选择进而改善一个 (或有时两个)种群。

基本上有两种主要方法进行开放授粉种群改良。首先，已有情况是其中 种群由于选取的选择流程而被全体改变。其结果是改进的种群，该种群在隔 离状态中通过其自身随机杂交而可以无限繁殖。其次，合成的品种获得与种 群改良相同的最终结果但其自身不能繁殖；其必须从亲本系或克隆重建。这 些用于改善开放授粉种群的植物育种过程是本领域的技术人员所知，且常规 用于提高异花授粉植物育种流程的全面综述被提供于许多文本和文章中，包 括：Allard,Principles of Plant Breeding,John Wiley & Sons,Inc.(1960)； Simmonds,Principles of Crop Improvement,Longman Group Limited(1979)； Hallauer and Miranda,Quantitative Genetics in Maize Breeding,Iowa State  University Press(1981)；和Jensen,Plant Breeding Methodology,John Wiley & Sons,Inc.(1988)。对于具体针对大豆的种群改良方法见，例如，J.R.Wilcox, editor(1987)SOYBEANS:Improvement,Production,and Uses,第2版, American Society of Agronomy,Inc.,Crop Science Society of America,Inc.和 Soil Science Society of America,Inc.，出版社，888页。

混合选择。在混合选择中，选择理想的个体植物，收获，并在无后代测 试的情况下以复合种子产生下一代。由于选择仅基于母本，且对授粉并无控 制，混合选择接近于带有选择的随机杂交形式。如上所述，混合选择的目的 是为了增加优良基因型在种群中比例。

合成体。通过对全部可能的杂交组合中选择具有良好结合能力 (combining ability)的多种基因型进行彼此杂交来产生合成品种，伴随后续的 通过开放授粉来维持所述品种。亲本是否为(或多或少近交的)种子繁殖系(如 在一些甜菜和豆类(蚕豆))或克隆(如在牧草、三叶草和紫花苜蓿中)在原则上并 无区别。基于一般的结合能力来对亲本进行选择，有时通过测试杂交或顶交， 更普遍的是通过多向杂交。可以有意使亲本种子系为近交系(例如，通过自交 或近亲杂交)。但是，即使亲本并非有意的近交系，品系维持过程中的系内选 择将确保一定近交出现。当然，克隆的亲本将保持不变且高度杂合。

合成体是否可以由从亲本种子生产地点直接至农户或必须先经过一轮或 两轮增殖取决于种子生产以及对种子的需求规模。在实践中，草和三叶草通 常增殖一次或两次且由此被大幅度从原始合成体中除去。

虽然有时使用混合选择，对于多向杂交通常优选进行后代测试，因为其 在操作上简便且与目标明显相关，即合成体中一般结合能力的利用。

亲本系或克隆进入合成体的数量差别很大。在实践中，亲本系的数量范 围为10至几百，以100-200为平均值。从100或更多克隆所形成的广基合成体 在种子繁殖中预期比基础较窄的合成体更稳定。

杂种。杂种是不同基因型的亲本之间杂交获得的个体植物。商业化杂种 现已广泛用于多种作物，包括玉米(玉蜀黍)、高粱、糖用甜菜、向日葵和花椰 菜。杂种可以多种不同的方式形成，包括通过两亲本直接杂交(单交杂种)、由 单交杂种与另一个亲本杂交(三路或三交杂种)，或通过杂交两种不同的杂种 (四通或双交杂种)。

严格来讲，大多数外部育种(out breeding)(即开放授粉)的种群为杂种，但 该术语通常留给其中亲本的基因组足够鲜明使得它们被认为是不同的物种或 亚种的个体的情况。杂种可以是可育或不育，取决于两亲本基因组性质和/或 数量的差异。杂种优势或杂种活力通常是与增加的杂合性相关，所述增加的 杂合性导致与用于形成该杂种的亲本系相比杂种具有的增加的生长活力、存 活和生育力。最大杂种优势通常由两种遗传上不同的高度近交系杂交获得。

杂种的生产是发达产业，其涉及单独生产两个亲本系和由杂交这些品系 获得的杂种。对于杂种生产过程的详细讨论，参见，例如，Wright,Commercial  Hybrid Seed Production 8:161-176,In Hybridization of Crop Plants。

群体分离分析(BSA)。BSA，又名大量分离分析(bulked segregation  analysis)，或群体分离分析，是一种由Michelmore等(Michelmore等，1991, Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant  analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using  segregating populations.Proceedings of the National Academy of Sciences,USA, 99:9828-9832)以及Quarrie等(Quarrie等，Bulk segregant analysis with molecular  markers and its use for improving drought resistance in maize,1999,Journal of  Experimental Botany,50(337):1299-1306)描述的方法。

对于感兴趣的性状的BSA，选择具有某些不同表型的亲本系并进行杂交 以产生F2、加倍的单倍体或重组近交种群并进行QTL分析。之后分析种群表 型以鉴定具有性状的高或低表达的单个植物或品系。制备两种DNA群体(bulk)， 一种来自具有一种表型(例如，抵抗病原体)的个体，而另一种选自具有相反表 型(例如，对病原体易感)的个体，并采用分子标记对等位基因频率进行分析。 如果标记物为显性(例如，RAPD)，每个群体只需要少量个体(例如，各10株植 物)。当标记为共显性时(例如，RFLP)则需要更多个体。可鉴定与表型连锁的 标记并用于育种或QTL定位。

基因聚合(gene pyramiding)。将在不同亲本中鉴定的一系列靶基因结合至 单一基因型的方法通常称为基因聚合。基因聚合方法的非限制性实例示于图3。 基因聚合育种的第一部分被称为谱系且其目的在于累积所有靶基因的一个拷 贝至一个单独的基因型中(称为根基因型)。第二部分称为固定步骤且其目的在 于固定靶基因至纯合状态，也就是说，从根基因型中得到理想基因型(理想型)。 基因聚合可与标记物辅助选择(MAS，见Hospital等，1992,1997a和1997b，和 Moreau等，1998)或基于标记物的反复选择(MBRS，见Hospital等，2000)结合。

RNA干扰(RNAi)

RNA干扰(RNAi)为动物和植物中的序列特异性、转录后基因沉默或转录 基因沉默过程，其通过与被沉默基因中的序列同源的双链RNA(dsRNA)发起。 在本发明中有用的优选RNA效应分子必须在序列上充分不同于任何宿主多 核苷酸序列，旨在实施本发明的任何方法之后不会影响所述宿主多核苷酸序 列的功能。可以利用计算机算法来定义RNA分子多核苷酸序列与宿主的必须 正常序列之间基本的同源性缺乏。

术语“dsRNA”或“dsRNA分子”或“双链RNA效应分子”指至少部分为双 链的核糖核酸分子，其包含至少约19或更多个呈双链构象的核苷酸的区域。 所述双链RNA效应分子可以是由两个单独的RNA链形成的双链体双链RNA 或其可以是具有能够形成至少部分为双链发夹构象的自互补区的单RNA链 (即发夹dsRNA或茎环dsRNA)。在不同实施方案中，所述dsRNA完全由核 糖核苷酸组成或由核糖核苷酸与脱氧核苷酸的混合物组成，如RNA/DNA混 合体。所述dsRNA可以是具有自互补区的单个分子，如此分子的一个片段中 的核苷酸和分子的另一片段的核苷酸碱基配对。一方面，自互补区通过至少 约3-4个核苷酸的区域，或约5、6、7、9至15个核苷酸或更多个核苷酸的 区域连接，其缺乏与分子中的另一部分的互补性且因此保持单链(即“环区”)。 这种分子将形成部分双链茎环结构，任选地，具有短的单链5'和/或3'端。一 方面，发夹dsRNA的自互补区或双链体dsRNA的双链区将包括效应序列和 效应补体(例如，在发夹dsRNA中通过单链环区连接)。所述效应序列或效应 链是双链区或双链体中合并入RISC或与RISC相关联的链。一方面，双链 RNA效应分子会包括至少19个连续核苷酸的效应序列，优选19至29，19 至27，或19至21个核苷酸，其与编码EG261、EG261同源物、EG261直系 同源物和/或EG261旁系同源物的核酸序列，和/或其片段和变异的RNA反向 互补，或是相反链复制中间体。在一个实施方案中，所述双链RNA效应分子 通过为大豆或其他植物、植物组织或植物细胞提供包含一个或多个双链RNA 效应分子的表达构建体来提供。在一个实施方案中，表达构建体包含衍生于 编码EG261、EG261同源物、EG261直系同源物和/或EG261旁系同源物和/ 或其片段和变异的核酸序列中任一的双链RNA。在其它实施方案中，表达构 建体包含衍生于编码EG261、EG261同源物、EG261直系同源物和/或EG261 旁系同源物和/或其片段和变异的核酸序列中多于一种序列的双链RNA。在进 一步的实施方案中，所述表达构建体包含衍生于编码EG261、EG261同源物、 EG261直系同源物和/或EG261旁系同源物和/或其片段和变异的核酸序列中 多于一种序列，以及一种或多种其他参与病原体抗性的基因的双链RNA。本 领域的技术人员将能够基于本发明中编码EG261、EG261同源物、EG261直 系同源物和/或EG261旁系同源物和/或其片段和变异的核酸序列的核苷酸序 列设计适合的双链RNA效应分子。

在一些实施方案中，本发明的dsRNA效应分子是“发夹dsRNA”，“dsRNA 发夹”，“短发夹RNA”或“shRNA”，即，小于约400至500个核苷酸(nt)，或 小于100到200nt的RNA分子，其中至少有一段至少15至100个核苷酸(例 如，17至50nt，19至29nt)与位于同一RNA分子(单RNA链)上的互补序列 进行碱基配对，并且其中所述序列与互补序列通过至少约4至7个核苷酸的 未配对区(或约9至约15nt，约15至约100nt，约100至约1000nt)隔开，其 形成通过碱基互补的两区生成的茎状结构之上的单链环。shRNA分子包括至 少一个茎环结构，其含有约17至约500bp；约17至约50bp；约40至约100bp； 约18至约40bp；或约19至约29bp的双链茎区；其与要抑制的靶序列同源 和互补；以及至少约4至7个核苷酸、或约9至约15个核苷酸、约15至约 100nt、约250-500bp、约100至约1000nt的未配对环区，其形成通过碱基互 补的两区生成的茎状结构之上的单链环。然而，应当认识到的是，包括一个“环 区”或“环状序列”并非绝对必要，这是因为即使没有由不相关的“填充”序列隔 开，包含某个序列和紧随其后的该序列的反向补体的RNA分子会倾向于形成 茎环构象。

本发明包括可被转录成一个或多个双链RNA效应分子的DNA序列的表 达构建体可转化至植物中，其中经转化的植物与未转化植物相比产生不同的 脂肪酸组成。通过dsRNA效应分子抑制的靶序列包括，但不局限于，脂肪酸 合成基因的编码区、5’UTR区、3’UTR区。在一些实施方案中，靶序列来自 一个或多个编码EG261同源物、EG261直系同源物和/或EG261旁系同源物 和/或其片段和变异的核酸序列。

RNAi的效果在植物中可以是系统性和可遗传的。在植物中，RNAi被认 为通过siRNA经由胞间连丝在细胞之间转移而传播。遗传性来自通过RNAi 靶向的启动子甲基化；新的甲基化模式在细胞的每一个新的世代被复制。植 物和动物之间的宽泛整体区别在于内源性产生的miRNA的靶向；在植物中， miRNA通常完全或几乎完全互补于其靶基因且诱导由RISC进行的直接 mRNA切割，而动物的miRNA往往在序列上更加趋异并诱导翻译抑制。关 于RNAi在植物中的详细方法描述于David Allis等(Epigenetics,CSHL Press, 2007,ISBN 0879697245,9780879697242)，Sohail等(Gene silencing by RNA  interference:technology and application,CRC Press,2005,ISBN 0849321417, 9780849321412)，Engelke等(RAN Interference,Academic Press,2005,ISBN 0121827976,9780121827977)和Doran等(RNA Interference:Methods for Plants  and Animals,CABI,2009,ISBN 1845934105,9781845934101)中，其以其全文 作为参考并入本文用于各种目的。

本发明提供了生产含有改变和/或增加水平的病原体耐受和/或抗性的大 豆或其它植物的方法。这样的方法包括利用包含如上所述嵌合基因的大豆或 其他植物。

本发明还提供了培育生产改变和/或增加水平的病原体耐受和/或抗性的 大豆和其他植物的方法。在一个实施方案中，这种方法包括：

i)在如上所述的具有编码EG261、EG261同源物、EG261直系同源物和 /或EG261旁系同源物和/或其片段和变异的核酸序列的大豆或其它植物物种 与第二大豆或其它植物物种之间进行杂交来生成F1植物；

ii)将所述F1植物分别与所述第二大豆或植物物种回交；

iii)重复回交步骤直到所述核酸序列分别被整合到所述第二大豆或其它 植物物种的基因组中。任选地，这些方法可以通过分子标记物来辅助。

本发明提供了培育接近大豆(Glycine max)的种的方法，其中所述种产生 改变和/或升高水平的病原体耐受和/或抗性。在一个实施方案中，这样的方法 包括：

i)在如上所述的包含编码EG261、EG261同源物、EG261直系同源物和 /或EG261旁系同源物和/或其片段和变异的的核酸序列的非大豆种与大豆之 间进行杂交来生成F1植物；

ii)将所述F1植物与大豆回交；

iii)重复回交步骤直到所述核酸序列被整合到大豆的基因组中。特殊技 术(例如，体细胞杂交)可能是必要的以便将基因从非大豆的种成功转移至大豆。 任选地，这些方法可以通过分子标记物来辅助。

通过下列实施例进一步说明本发明，不应将这些实施例理解为限制性的。 贯穿本申请全文引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容，以及 附图，以其全文作为参考文献并入本文用于各种目的。

实施例

实施例1.驯化大豆(大豆(Glycine max))中EG261的鉴定和表征

本发明包括本文中称为“EG261”的、编码赋予病原体抗性包括线虫类抗 性的Dirigent蛋白的大豆基因的发现。在大豆中EG261存在两个拷贝，但仅有 一个基因拷贝被阳性选择，本文称为“拷贝A”。第二个拷贝，本文称为“拷贝 B”为高度保守且没有证据表明其在线虫抗性中(或在任何其他具有农业利益 的性状中)起任何作用。除非本文另外阐明，所有对EG261的涉及均指该基因 的拷贝A。

EG261在根中相当高表达，正如对于赋予SCN抗性的基因所预期的，因 为这是SCN进入植物的主要途径。

看起来EG261位于大豆染色体1的预测位置(即，QTL)用于SCN抗性。该 QTL由两组不同研究支持(Vergel C.Concibido,Brian W.Diers,and Prakash R. Arelli,Crop Science,VOL.44,JULY–AUGUST 2004,1121-1131,和Pin Yue, David A.Sleper and Prakash R.Arelli,Crop Science,VOL.41,SEPTEMBER– OCTOBER 2001,1589-1595)。但是，该QTL是宽泛的，且可能包括数百基因， 因此之前并未分离精确的感兴趣的基因。阳性选择的EG261看起来落入该 QTL之内，这与我们推测的EG控制并赋予SCN抗性相一致。(然而，应该注意 到的是由于绘图种群大小和结构的差异、DNA标记平台、以及DNA标记可用 性的局限，对QTL的位置的定位仍仅仅是试验性的。)

EG261大豆序列如下。起始密码子以下划线小写字母字体显示。终止密 码子以黑体小写字母字体显示。UTR序列以小写字母显示。

衍生于栽培的大豆(Glycine max)的EG261 cDNA序列(SEQ ID NO:1)如 下：

5’-

agcaagagatgctcaaacccaaattcacctacttcgatgcttcccccaccttataaattcttgcattaatttaccactttcat cacccaatccacttcctctaattgacacccacctaaaccatgGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTC CTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTT CGTGGGAACACTAGACCCAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAAAC CCTAAGCCACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAA CCCCACATCGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAATACAACGCAACC ACAACCTTCGGCTCCGTTGGAATCTTTGACACCCCTTTAACCGTGGGAC CTGAGGTGTACTCCAAGGTTGTCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGCCT CCACGTCACAAACGCAGTTTGACCTGTTACTGATTTACAACTTCGCGTT GACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGGA GCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGCCCATTGTTGGTGGTAGTG GGGTCTTCAAATTTGCCACTGGGTATGTTGAGTCTAGGACGCTAAGTTTT GATCCCCAAACAAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTACTA Ttgattattgaatgtgtttttttcatgttgatgcgttatcgctttggtctgtctcacctagtttcta

EG261编码序列(栽培的大豆；Glycine max，SEQ ID NO:2)：

atgGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTC ACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTTCGTGGGAACACTAGACCCAAAG TCCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCTAAGCCACTTCAGGTTCTACT GGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAGAATCATTCC CTCACTCCCCAAATACAACGCAACCACAACCTTCGGCTCCGTTGGAATC TTTGACACCCCTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCCAAGGTTGTCG GAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGCCTCCACGTCACAAACGCAGTTTGACC TGTTACTGATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAG CACCATCACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGA GCTGCCCATTGTTGGTGGTAGTGGGGTCTTCAAATTTGCCACTGGGTAT GTTGAGTCTAGGACGCTAAGTTTTGATCCCCAAACAAGGAATAACACGG TTCAGTTCGACGTGTATATTTACTAT

EG261 cDNA序列与美国专利号7569389中的序列65260和33011(两者 彼此相同)(SEQ ID NO:3)超过99％的相同：

1 atcacccaat ccacttcctc taattgacac ccacctaaac catggcttcc cacttcctca

61 aatccctcct tctcctctcc acctatgccc tcaccatctc agcagaatac acaggcttcg

121 tgggaacact agacccaaag tccataggca tacaccacaa gaaaacccta agccacttca

181 ggttctactg gcacgaagtc ttcagcggag aaaaccccac atcggttaga atcattccct

241 cactccccaa atacaacgca accacaacct tcggctccgt tggaatcttt gacacccctt

301 taaccgtggg acctgaggtg tactccaagg ttgtcggaaa agccgagggc ttgtttgcct

361 ccacgtcaca aacgcagttt gacctgttac tgatttacaa cttcgcgttg acccaaggga

421 agtacaacgg cagcaccatc acgttcacgg ggaggagccc cctctcggag aaggtgaggg

481 agctgcccat tgttggtggt agtggggtct tcaaatttgc cactgggtat gttgagtcta

541 ggacgctaag ttttgatccc caaacaagga ataacacggt tcagttcgac gtgtatattt

601 actattg attattgaaa gtgttttttt catgttgatg cgttatcgct ttggtctgtc

661 tcacctagtt tctacataag tttcctcttt tgagggcatg tggtgtcatg gaataaagtc

721 atctttgggc aaaaaaaaaa aaaaaaaa

实施例2.野生大豆种中EG261直系同源物的鉴定

利用衍生于分子进化生物学的分析技术，将来自栽培(即，驯化)大豆即 Glycine max的基因序列与来自与G.max为亲缘植物且被推测抵抗大豆胞囊 线虫(SCN)攻击的野生型大豆种的直系同源物进行比较。该分析以高通量的方 式，采用进化基因组学的专业软件和专利方法进行。见，例如，美国专利号 6228586；美国专利号6274319以及美国专利号6280953。

栽培大豆的大多品种对一种或多种SCN易感(目前更常称为HG组)，且 即使那些为SCN抗性培育的大豆栽培种，目前由于包囊线虫进化出躲避当前 抗性机制的能力，经常会失去所述抗性。现有的抗性机制都仅依赖于一个或 两个基因，因此对于抗性进化是相对简单的靶。

野生型大豆亲缘植物经常被选择用于分析；这些种是科学文献中表明对 一种或多种SCN种类耐受的那些。随后对这些推定的抗SCN种在标准试验 中针对SCN易感性/抗性进行测试。采用多个种类(HG组)以测试每个野生型 大豆登录(accession)。在多重重复中，用SCN挑战每个野生型大豆种的多个 植物；每次挑战包含多个SCN种类/HG组。

在证明多个野生种确实抵抗SCN后，将这些种培育至成熟以收集RNA。 从每5个抗SCN种的个体植物中制备总RNA。RNA从每个个体植物的多种 组织中汇集进而最大化对该种的转录子组进行取样的全面程度。利用RNA生 成用于测序所述种的转录子组的cDNA的文库。通过Roche 454高通量下一 代测序完成测序，尽管可使用任何适当的DNA测序方法。

基于逐个基因对所得EST0进行比较。分析同源序列来鉴定在两个种间 具有核酸序列差异的那些EST。随后进行分子进化分析以逐对地定性和定量 评估衍生自栽培大豆(G.max)以及每个野生种(举例而言，Glycine tabacina)的 直系同源基因之间的差异的进化显著性。每个野生种还以成对的方式与每个 另外的野生大豆种进行比较。随后对每个成对比较采用自动化生物信息学分 析且只保留那些包含产生进化上显著性差异的核苷酸变化(或多个变化)的序 列用于进一步分析。这使得能够鉴定经进化而赋予某种进化优势的基因以及 鉴定特定的进化出的改变。

多个不同分子进化分析或Ka/Ks型方法中的任一种可被用于定性和定量 评估来自相关的种的同源基因序列之间鉴定出的核苷酸变化的进化显著性。 Kreitman and Akashi(1995)Annu.Rev.Ecol.Syst.26:403422；Li,Molecular  Evolution,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.,1997。举例而言，蛋白质的阳 性选择(即分子水平适应性进化)可在蛋白质编码基因中通过每个非同义位点 的非同义核苷酸取代(Ka)与每个同义位点的同义取代(Ks)的比率的成对比较 来检测(Li等，1985；Li,1993)。虽然将这两种变量作为比例比较特别方便且 最为有效，但可使用Ka和Ks的任何比较。利用标准的统计学方法通过展示 Ka和Ks之间的统计学显著差异来鉴定序列。

虽然可使用其他能够检测种间阳性选择基因的分析程序，优选地，采用 Li等的Ka/Ks分析来实施本发明。Li等(1985)Mol.Biol.Evol.2:150174；Li (1993)；同样参见J.Mol.Evol.36:9699；Messier and Stewart(1997)Nature 385:151154；Nei(1987)Molecular Evolutionary Genetics(New York,Columbia  University Press)。Ka/Ks方法，其包括根据比例比较基因的同源蛋白质编码 区域之间每个非有义位点的非有义取代的比例与每个有义位点的有义取代的 比例，将该比较用以确定可能由在进化中与中立选择相反的适应性选择所驱 动的序列取代。有义(“沉默”)取代是一种由于遗传密码的简并性造成的取代， 其对编码的氨基酸序列不造成改变；非同义取代导致氨基酸的替换。每个变 化类型的程度可以分别由Ka和Ks估算，即每个同义位点的同义取代数和每 个非同义位点的非同义取代数。Ka/Ks的计算可人工或通过利用软件实施。 合适的程序的实例是MEGA(Molecular Genetics Institute,Pennsylvania State  University)。

为达到估算Ka和Ks的目的，完整或部分蛋白质编码序列被用于计算同 义和非同义取代以及非同义和同义位点的总数。分析的多核苷酸序列的长度 可以为任何合适的长度。优选地，比较整个编码序列，进而确定任何以及全 部的显著变化。公共可用的计算机程序，如Li93(Li(1993)J.Mol.Evol.36:96 99)或INA，可用于为所有成对比较计算Ka和Ks值。该分析可进一步调适用 于以“滑动窗”方式检测序列，由此使得小数目的重要改变不被全序列掩蔽。 “滑动窗”指检测连续的、重叠的基因亚区(所述亚区可以是任何长度)。

非同义和同义取代率的比较通常由Ka/Ks比来表示。Ka/Ks已表明可反 映所研究的序列中已经起作用的适应性进化的程度。编码序列的全长或部分 片段可被用于Ka/Ks分析。Ka/Ks比越高，序列更有可能经历适应性进化且 非同义取代在进化上显著。见，举例而言，Messier and Stewart(1997)。

Ka/Ks比显著高于一(unity)强烈表明阳性选择与仅作为偶然的结果所能 够预期的相比具有固定的更大数目的氨基酸取代，且与通常观察到的比例少 于或等于一的模式相反。Nei(1987)；Hughes and Nei(1988)Nature 335:167170； Messier and Stewart(1994)Current Biol.4:911913；Kreitman and Akashi(1995) Ann.Rev.Ecol.Syst.26:403422；Messier and Stewart(1997)。少于一的比例通 常意味着阴性或纯化选择(purifying selection)：对于有功能的、有效的蛋白质 的一级结构保持不变化存在强大压力。

所有用于计算Ka/Ks比例的方法都基于对来自亲缘种的同源基因的蛋白 质编码区的每个非同义位点的非同义取代数目与每个同义位点的同义取代数 目的逐对比较。每种方法对于估算“多重命中”(即，在相同位点多于一个核苷 酸取代)执行不同的矫正。每种方法还针对进化过程中DNA序列如何变化采 用不同的模型。因此，优选地，来自不同算法的结果的组合被用于增加检测 阳性选择基因的敏感性水平和结果的置信度水平。

应该理解的是本文描述方法可以使功能上与大豆蛋白质编码序列相关的 的大豆多核苷酸序列得以鉴定。这些序列可以包括，但不局限于，非编码序 列或不编码蛋白质的编码序列。这些相关序列可以，举例来说，在大豆基因 组中物理上临近大豆蛋白质编码序列，如内含子或5’-和3’-旁侧序列(包括控 制元件如启动子和增强子)。这些相关序列可以通过在公共基因组数据库如 GenBank搜索获得，或者通过对适当的基因组文库利用蛋白质编码序列作为 探针进行筛选和测序获得。采用相关编码序列用于获得非编码序列的方法和 技术为本领域熟知。

在鉴定候选基因后，每个直系同源基因对中基因的核苷酸序列通过标准 DNA测序技术被仔细验证且随后对每个仔细测序的候选基因对重复KA/Ks 分析。

对于本实施例更具体的是，软件运行经过来自栽培大豆G.max的每个基 因的推定直系同源物之间所有可能的成对比较，其与来自野生种的可能直系 同源物比较，寻找高Ka/Ks比。软件相对于从野生亲缘植物(举例而言，G. pescadrensis)测序得到的转录子组中的每一个序列BLAST比对(以自动的方 式)每一个来自栽培大豆的mRNA序列。随后软件对每一个基因(即，每一套 “直系同源物”)对实施Ka/Ks分析，对具有高Ka/Ks分数的基因对进行标记。 软件随后将每一个G max序列相对于另一野生亲缘植物(举例而言，G. tabacina)的每一序列进行比较，再次是通过进行一系列BLAST比对，且随后 彻底筛选高Ka/Ks分数。如此连续地对所有野生种的转录子组序列进行该过 程。其提供用于后续分析的一组候选者(见下文)。

软件接下来将G.pescadrensis转录子组中的每一基因序列相对于G. tabacina的每一序列进行了比较，再次进行BLAST比对等。因此最终将使用 的每个大豆种的cDNA文库中所示的得到表达的全部基因相对于每一个其他 大豆种的全部基因(野生型和栽培种两者)进行了比较，目的是找到表明阳性选 择证据的每一个基因。尽管使用软件来完成该分析，其可以由本领域的技术 人员利用计算器完成，即，其可以“手动完成”——软件仅仅使速度提升。

然后对出现的被标记的基因对在实验室中单独并仔细地进行重新测序来 检查原始的高通量读数的精确度；如此去除假阳性。

接下来，对每一个余下的具有高Ka/Ks分数的候选基因对进行检验来确 定是否该比较为真正直系同源的，或只是由旁系同源比较导致的人为假阳性。

接下来提供基于这种分析确定地阳性选择的直系同源基因的核苷酸序列。 关于原始收集每个登录物的地理位置的信息，以及关于每一个登录物的任何 其他可用数据也在下文中给出。

Glycine microphylla(SEQ ID NO:4):

ttaattcatcactttcatcacccaatccact:cctctaattaacacccaccaacaccatgGCTTCCCACTTCCT CAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGAAT ACACAGGCTTCGTGGGGACACTAGACCCAAAGTCCATAGGCATACACC ACAAGAAAACCCTAAGCCACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTCTTCA GCGGAGAAAACCCCACAACGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAATA CAACACAACCACAACCTTCGGTTCCGTTGGAATCTTTGACAACACTTTA ACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCCAAGGTTGCCGGAAAAGCCGAGGGC TTGTTTGCCTCCACGTCACAAACGCAGTTTAACCTGTTACTGATTTACAG CTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATCACGTTCAC GGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGCCCATTGTTGG TGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTGCCACTGGGTATGTTGAGTCTAGGACG CTAAGTTTTGATCCCCAAACGAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACGTGT ATATTTACTATtgattattgaatgtgttttttacatgttgatgtgttagagctttggtgtgtgtcacttagtttcta

该序列来自1983年7月30日澳大利亚昆士兰收集的登录号PI505196。 位置：向Tumoulin距Evelyn路口5.4公里。纬度：17度32分S(-17.53333333)， 经度：145度26分E(145.43333333)海拔：900米。

经证明对SCN种类3有抗性(Bauer,S.,T.Hymowitz,and G.R.Noel.2007. Soybean cyst nematode resistance derived from Glycine tomentella in amphiploid (G.max x G.tomentella)hybrid lines.Nematropica 37:277-285)。

Glycine pescadrensis(SEQ ID NO:5):

ataaattcttgcattaattcatcactttcatcacccaatccatttcctctaattaacacccaccaaaaccatgGCTTCC CACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTC AGCAGAATACACAGGCTTCGTGGGCACACTAGACCCAAAGTCCATAGG CATACACCACAAGAAAACCCTAAACCACTTCAGGTTCTACTGGCACGA AGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAGAATCATTCCCTCACTC CCCAAATACAACACAACCACAACCTTCGGTTCCGTTGGAATCTCTGACA ACGCTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCCAAGGTTGTCGGAAAAG CCGAGGGCTTGTTTGTCTCCACGTCACAAACGCAGTTTGACCTGTTACT GATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCAT CACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGC CCATTGTAGGTGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTTCCACTGGGTATGTTGA GTCTAGGACGCTAAGTTTTGATCCCCAAACGAGGAATAACACGGTTCAG TTCGACGTGTATATTTACTATtgattattgaatgtgttttttccatgttgatgtgttatagctttggtatg tgtcacttagtttcta

该序列来自登录号PI537287，于1988年4月7日收集自台湾。位置： 军事区，跨海(澎湖大桥)，拍沙岛，澎湖列岛。纬度：23度40分0秒N (23.66666667)，经度：119度34分48秒E(119.58)。海拔：5米。

Glycine tabacina(新南威尔士，澳大利亚，SEQ ID NO:6):

catcacccaatccact:cctctaattaacacccaccaacaccatgGCTTCCCACTTCCTCAAATCCC TCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGC TTCGTGGGGACACTAGACCCAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAA ACCCTAAGCCACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAA AACCCCACAACGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAATACAACACAA CCACAACCTTCGGTTCCGTTGGAATCTTTGACAACACTTTAACCGTGGG ACCTGAGGTGTACTCTAAGGTTGCCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGC CTCCACGTCACAAACGCAGTTTAACCTGTTACTGATTTACAGCTTCGCG TTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGG AGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGCCCATTGTTGGTGGCAGT GGGGTCTTCAAATTTGCCACTGGGTATGTTGAGTCTAGGACGCTAAGTT TTGATCCCCAAACGAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTAC TATtgattattgaatgtgttttttacatgttgatgtgttagagctttggtgtgtgtcacttagtttcta

该序列来自G.Tabacina登录号PI446968，收集于：新南威尔士，澳大利 亚，且在早于1980年的某个时间。地点：Wyalong向西，距康多博林35公 里。纬度：33度20分S(-33.33333333)，经度：147度8分E(147.13333333) 海拔：260米。

经证明对SCN种类3有抗性(Bauer,S.,T.Hymowitz,and G.R.Noel.2007. Soybean cyst nematode resistance derived from Glycine tomentella in amphiploid (G.max x G.tomentella)hybrid lines.Nematropica 37:277-285)。

Glycine tabacina(台湾，SEQ ID NO:7):

cctacttcgatgcttcccccaccttataaattcttgcattaattcatcactttcatcacccaatccatttcctctaattaacacc caccaaaaccatgGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTAT GCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTTCGTGGGCACACTAGACC CAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCTAAACCACTTCAGGTT CTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAGAAT CATTCCCTCACTCCCCAAATACAACACAACCACAACCTTCGGTTCCGTT GGAATCTCTGACAACGCTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCCAAG GTTGTCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGTCTCCACGTCACAAACGCAG TTTGACCTGTTACTGATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTACA ACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGG TGAGGGAGCTGCCCATTGTAGGTGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTTCCAC TGGGTATGTTGAGTCTAGGACGCTAAGTTTTGATCCCCAAACGAGGAAT AACACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTACTATtgattattgaatgtgttttttccatgtt gatgtgttatagctttggtatgtgtcacttagtttcta

该序列来自G.tabacina登录号PI559281，1988年4月8日收集自澎湖， 台湾。地点：奇美岛上的机场(NE)。纬度：23度33分48秒N(23.5633577)， 经度：119度37分41秒E(119.628067)。

经证明其对SCN种类3有抗性(Bauer,S.,T.Hymowitz,and G.R.Noel. 2007.Soybean cyst nematode resistance derived from Glycine tomentella in  amphiploid(G.max x G.tomentella)hybrid lines.Nematropica 37:277-285.)。

Glycine tomentella(该种用于一些文献中的别名是G.latifolia。)(澳大利亚， SEQ ID NO:8):

cacctacttcgatgcttccccccaccttataaattcttgcattaattcatcactttcatcacccaatccatttcctctaattaac acccaccaaaaccatgGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCT ATGCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTTCGTGGGCACACTAGA CCCAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCTAAACCACTTCAG GTTCTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAG AATCATTCCCTCACTCCCCAAATACAACACAACCACAACCTTCGGTTCC GTTGGAATCTCTGACAACGCTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCCA AGGTTGTCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGTCTCCACGTCACAAACGC AGTTTGACCTGTTACTGATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTA CAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAA GGTGAGGGAGCTGCCCATTGTAGGTGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTTCC ACTGGGTATGTTGAGTCTAGGATGCTAAGTTTTGATCCCCAAACGAGGA ATAACACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTACTATtgattattgaatgtgttttttccat gttgatgtgttatagctttggtatgtgtcacttagtttctatataagtttccama

该序列来自G.tomentella登录号PI 499946，收集于新南威尔士，澳大利 亚。地区：德朗格拉。纬度：29度39分0秒S(-29.65)，经度：150度50分 E(150.83333333)海拔：600米。

经证明其对SCN种类3有抗性(Bauer,S.,T.Hymowitz,and G.R.Noel. 2007.Soybean cyst nematode resistance derived from Glycine tomentella in  amphiploid(G.max x G.tomentella)hybrid lines.Nematropica 37:277-285)。

所有以上来自大豆(G.max)野生亲缘植物的EG261序列全部为“拷贝 A”(如以上关于G.max给出的)。来自每一个野生种的拷贝A已经与G.max 的拷贝A比较进行了强阳性选择。此外，当彼此进行比较时(即，不仅与栽培 大豆进行比较)，来自每个野生种的被检测的EG261拷贝A已经相对于每一 种其他野生种进行了强阳性选择。这表明每一种野生种很可能已遭遇过多种 不同SCN种类以及不同种甚至不同类型的病原体(如细菌、真菌、昆虫和线 虫)，使得每一种大豆野生种因此很可能进化出/实现了对多个SCN种类的抗 性。

我们所证明的在野生大豆种中相对于每一种其他野生种的阳性选择的清 晰情节，强烈表明来自这些野生种中每一种的EG261的直系同源物对于在栽 培大豆中生成SCN抗性都是有价值的。

实施例3.野生型大豆种中EG261直系同源物的表征

对根据实施例2鉴定的包含直系同源物的来自野生亲缘植物种的植物就 其赋予抗性的真正能力进行了测试。在本实施例中，对大豆属(genus Glycine) 的野生大豆种就其抗大豆包囊线虫(SCN)挑战的天然能力进行了测试。种质登 录物自National Plant Germplasm System(NPGS)获得。

萌发种子，并在圆锥形的容器(cone-tainers)中对幼苗的SCN抗性进行测 试。(Niblack,T.,Tylka,G.L.,Arelli,P.,Bond,J.,Diers,B.,Donald,P.,Faghihi,J., Ferris,V.R.,Gallo,K.,Heinz,R.D.,Lopez-Nicora,H.,Von Qualen,R.,Welacky, T.,and Wilcox,J.2009.A standard greenhouse method for assessing soybean  cyst nematode resistance in soybean:SCE08(standardized cyst evaluation 2008). Online.Plant Health Progress doi:10.1094/PHP-2009-0513-01-RV.)

对于那些被确认具有天生抗SCN能力的种，将来自多种组织(包括根、 茎和叶)的RNA快速冷冻并从冷冻的组织制备基因组DNA和RNA两者。然 后聚集来自每个植物的多个组织的RNA用于后续的cDNA文库构建(每个种 一个文库)。对于每个cDNA文库实施高通量454 Titanium测序。然而，应该 注意的是，可接受任何适当的高通量测序形式且利用该特定方法对于这些实 验的成功并非关键。

利用Evolutionary Genomics,Inc.专有的分析软件对每个种所得的转录子 组序列数据集进行分析以鉴定任何阳性选择的转录物。

利用在转基因大豆植物中检测保护经转化大豆植物免受SCN生物体以 及疫霉属(Phytophthora)真菌攻击的有效性的方案对候选基因进行验证。我们 在此报道了来自实验的结果，在该实验中将RNAi用于敲除抗SCN系(Fayette) 中的EG261。敲除后，正常的抗Fayette系成为SCN敏感的。用于本实验的 对照是在SCN敏感的Williams 82中RNAi沉默EG261：在该品系中沉默 EG261后未观察到敏感性差异。这些实验被解释成意味着对SCN的抗性是由 EG261基因赋予的；如果将EG261等位基因在抗SCN系中敲除，结果是SCN 抗性随即丧失。(有趣的是，在SCN敏感的William 82系中EG261的等位基 因已经是非功能性的或至少在赋予SCN抗性方面并非十分有效，因此EG261 等位基因的沉默没有改变William 82的SCN敏感表型。)重要的是，抗性系 (Fayette)是一种通过与展现SCN抗性的大豆本地品种杂交育种而生成的系。 (据信所述本地品种变成抗SCN是由于野生抗SCN大豆种的基因渗入。)

实施例4.EG261的沉默在抗SCN大豆中消除了抗SCN表型

生成携带发夹来沉默靶基因EG261的pG2RNAi2构建体，且所述构建体 被用于在大豆品种‘Fayette’中生成转基因的根。对‘Fayette’转基因根实施了两 次重复的SCN统计(demographics)实验。对于本文使用的所有测试方案的详 细说明，见Melito等(2010)A nematode demographics assay in transgenic roots  reveals no significant impacts of the Rhg1 locus LRR-Kinase on soybean cyst  nematode resistance,BMC Plant Biology 10:104,14页。

将孵化的约250只J2线虫置于接近每个转基因大豆根的尖端处，并通过 分配随机数对根的身份进行屏蔽。两周后，固定根并用酸性品红染色并对每 个根内的或附着的线虫数量和生长阶段进行评估(平均每根总共76只线虫)。

在两次重复实验的第一次中，在‘Fayette’转基因根内EG261的表达水平 平均为Fayette野生型的约12％。14个转基因根中的11个具有>50％的沉默且 包括在实验之内；3个根由于沉默效果较差被排除在外。在第二次重复实验 中，保存组织但未对沉默进行检查。因此，所有的数据都被包括在内(所以沉 默的表型影响可能由于在所获得的数据中包括了一些未沉默的根而稍微受到 掩蔽)。

数据表明朝向易感性的显著位移(图1)。条状图形表明每个根上发育越过 J2阶段的线虫种群的比率(平均值±标准误)。F：Fayette(抗SCN)；W：Williams 82(SCN易感)；EV：用空载体转化；hp：用EG261发夹基因沉默构建体转 化；Ox：用在强大豆(G.max)泛素启动子控制下表达Glyma01g31770的构建 体转化。F EV与F hp比较平均值相似度的ANOVA P值为0.005，而W EV 与W Ox相比为0.97。

本实验的对照为在SCN敏感的大豆栽培种Williams 82中RNAi沉默 EG261：在该品系中沉默EG261后未观察到敏感性差异。这些实验被解释成 意味着对SCN的抗性是由EG261基因赋予的；如果将EG261等位基因在抗 SCN系中敲除，结果是SCN抗性随即丧失。然而，在敏感型William 82系中 EG261等位基因已经是非功能性或至少在赋予SCN抗性时并非十分有效，因 此EG261等位基因的沉默没有改变William 82的SCN敏感表型。重要的是， 抗性系(Fayette)是一种与展现SCN抗性的大豆本地品种杂交育种而生成的系。 (据信所述本地品种变成抗SCN是由于野生抗SCN大豆种的基因渗入。)这是 EG261在大豆中影响/控制SCN抗性的功能的有力证据。

实施例5.利用EG261转化番茄

可利用包含EG261的构建体采用标准的番茄植物转化技术来转化‘Big  Boy’番茄植物。见，例如，Antonio Di Matteo,Maria Manuela Rigano,Adriana  Sacco,Luigi Frusciante and Amalia Barone(2011).Genetic Transformation in  Tomato:Novel Tools to Improve Fruit Quality and Pharmaceutical Production, Genetic Transformation,Prof.María Alvarez(Ed.),ISBN:978-953-307-364-4, InTech。

利用包含EG261的构建体转化番茄植物可由本专利中包括的栽培/野生 大豆直系同源物或本申请中描述的任何其他EG261直系同源物完成，包括， 番茄直系同源物(SEQ ID NO 16)。

可以测试转化的番茄植物与未转化的对照‘Big Boy’番茄植物相比的疾病 抗性。

可就作为这种转化的结果而赋予或增强的病原体耐受和/或抗性进行测 试的疾病包括由水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、腐皮镰刀菌(Fusarium  solani)和齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)引起的根部腐烂。用于测试对这些根部 疾病的耐受/抗性的流程见，例如，Abd-El-Kareem,F.,Nehal S.El-Mougy,Nadia  G.El-Gamal and Y.O.Fotouh(2006)Use of Chitin and Chitosan Against Tomato  Root Rot Disease under Greenhouse Conditions Research,Journal of Agriculture  and Biological Sciences,2(4):147-152。

可通过利用一个或多个如下步骤测试表现出对于一种或多种这些根部疾 病赋予的和/或增强的抗性的转化番茄植物来确认EG261的存在：(a)从所述 植物分离核酸分子并扩增与EG261多核苷酸同源的序列；(b)从所述植物分离 核酸分子并实施Southern杂交来检测EG261多核苷酸；(c)从所述植物中分离 蛋白质并利用EG261多核苷酸编码的蛋白质的抗体实施蛋白质免疫印迹分析； 和/或(d)证明源自EG261多核苷酸mRNA转录物且为EG261多核苷酸所独有 的mRNA序列的存在。

实施例6.番茄与表达EG261的番茄杂交

如实施例6中所获得的具有赋予的EG261编码序列的拷贝的‘Big Boy’番 茄植物可与‘Early Girl’品种植物杂交，且可对所得的子代就对三种根部疾病的 耐受/抗性进行测试。

EG261多核苷酸的存在可根据实施例5中阐述的步骤在所得的‘Early Girl’ 子代中进行确认。

在进一步的流程中，转化的‘Early Girl’番茄植物可与‘Early Girl’回交一次 或多次来生成具有EG261编码序列的近等基因或等基因‘Early Girl’番茄。

实施例7.采用EG261转化玉米

可采用包含EG261的构建体利用标准的玉米转化技术转化‘B37’和/或 ‘Mo17’近交玉米植物。见，例如，Sidorov and Duncan,2008(Agrobacterium -Mediated Maize Transformation:Immature Embryos Versus Callus,Methods in  Molecular Biology,526:47-58)；Frame等，2002(Agrobacterium tumefaciens -Mediated Transformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vector  System,Plant Physiology,May 2002,Vol.129,pp.13–22)；和Ahmadabadi等， 2007(A leaf-based regeneration and transformation system for maize(Zea mays  L.),TransgenicRes.16,437-448)。

利用包含EG261的构建体转化玉米植物可用本专利中包括的栽培/野生0 大豆直系同源物或用这些EG261基因的玉米直系同源物完成。

可以测试转化的玉米植物与未转化的对照‘B37’或‘Mo17’玉米植物相比 的线虫/害虫抗性。用于测试对线虫的耐受/抗性的步骤见，例如，Sasser,等(1984) Standardization of Host Suitability Studies and Reporting of Resistance to  Root-Knot Nematodes,Crop Nematode Research&Control Project(CNRCP),a  cooperative publication of The Department of Plant Pathology,North Carolina  State University and the United States Agency for International Development, North Carolina State University Graphics,Raleigh,NC,10页；和Cook,R.and K. Evans(1987)Resistance and Tolerance,In:Principles and practice of nematode  control in plants,R.H.Brown and B.R.Kerry(editors),179-231页。

可通过利用一个或多个如下步骤测试对于一种或多种线虫种类表现出赋 予的和/或增强的抗性的转化玉米植物来确认EG261的存在：(a)从所述植物 分离核酸分子并扩增与EG261多核苷酸同源的序列；(b)从所述植物分离核酸 分子并实施Southern杂交来检测EG261多核苷酸；(c)从所述植物中分离蛋白 质并利用EG261多核苷酸编码的蛋白质的抗体实施蛋白质免疫印迹分析；和/ 或(d)证明源自EG261多核苷酸mRNA转录物且为EG261多核苷酸所独有的 mRNA序列的存在。

对于一种或多种线虫种类具有确认的耐受和/或抗性的转化玉米植物可 以通过对该植物进行自花受粉、收获所得种子并从这些收获的种子培养抗性 植物来进行保持。

实施例8.用表达EG261的玉米植物培育的玉米

如实施例7中所获得的具有赋予的EG261编码序列拷贝的‘B37’或‘Mo17’ 玉米近交植物可与转化的或未转化的近交‘B37’‘Mo17’植物分别杂交，且可测 试所得的杂交F1子代对线虫的耐受/抗性。

EG261多核苷酸的存在可根据实施例7中阐述的步骤在所得的杂交子代 中进行确认。

在进一步的流程中，转化的杂交玉米植物可与其轮回亲本(即，适用的 ‘B37’或‘Mo17’)回交一次或多次来生成具有EG261编码序列的近等基因或等 基因玉米近交系。

实施例9.EG261的过表达

利用大豆品种‘Williams 82’的两次重复对EG261的过表达进行测试。本 文使用的测试方案的详细说明见Melito等(2010)A nematode demographics  assay in transgenic roots reveals no significant impacts of the Rhg1 locus  LRR-Kinase on soybean cyst nematode resistance,BMC Plant Biology 10:104,14 页。

“过表达根”中的表达水平被发现为4.3倍高，然而天然EG261基因非常高 表达，仅比泛素少5倍，因此这些表达水平与预期表现相一致。

数据表明与正常‘Williams 82’之间无显著性差异(即，无EG261过表达)， 但这些非确定性的结果可能是由于表达水平没有得到如预期一般严格的控制。

实施例10.EG261直系同源物在其他植物种中的鉴定

利用衍生自分子进化生物学的分析技术，采用来自栽培(即，驯化)大豆 (Glycine max)的基因序列来鉴定来自其他植物种的直系同源基因。下表提供了 与阳性选择的大豆EG261拷贝A基因直系同源的基因的核苷酸序列的SEQ  ID Nos。预测的氨基酸序列，以及关于原始收集每个登录物的地理位置的信 息，以及任何关于每一个登录物的可用信息也于下文给出。

实施例11.分离自其它植物种的EG261直系同源物的表征

可对来自野生、相关种的基因直系同源物就其赋予抗性的能力进行检测。 (在本实施例中，也可对相应的野生植物种就其抗一种或多种寄生线虫的攻击 的天然能力进行测试。萌发种子且对幼苗通过任何适合的标准测试方法测试 对一种或多种寄生线虫的抗性。)

对于每个检测的种，可利用Evolutionary Genomics,Inc.专有的分析软件 对种特异性EG261直系同源物进行分析来获得阳性选择的证据。表现出经阳 性选择的直系同源物随后可如实施例3和4中针对大豆(G.max)所描述的测试 赋予抗性的能力。

实施例12.EG261的沉默在抗线虫植物中消除了抗线虫表型

生成携带靶向实施例10中分离的每一个EG261直系同源物的RNAi沉默 DNA片段(例如，发夹、双链、反义、反向重复等)的构建体。这些构建体被 用于为每一植物种生成转基因植物。

在每一转基因植物的近尖端处放置孵化的J2线虫。在足以使线虫感染的 时间后，固定根并利用酸性品红染色，并对每个根内的或附着的所有线虫的 数目和生长阶段进行评估。

数据显示与其相应的野生型抗线虫对照植物种相比，在一种或多种转基 因植物种中朝向易感性的显著迁移。

实施例13.引入EG261直系同源物至异源植物种中

在一些实施方案中，可将根据本发明从一种植物种中分离的赋予线虫抗 性的EG261直系同源物引入至相同种的线虫易感植物中，从而在该植物中生 成线虫抗性。

然而，在一些其他的实施方案中，可将分离自一种植物种的本发明的 EG261直系同源物引入至同属不同种的线虫易感植物，或不同属的植物种中， 以将线虫抗性引入至所述植物中。

举例而言，可将分离自大豆的编码SEQ ID NOs:9-15的蛋白质中任一种 的基因引入至其他植物种中，如茄科的种(Solanaceae species)(例如，番茄 (Solanum lycopersicum)、克梅留斯基番茄(Solanum chmielewskii)、多毛番茄 (Solanum habrochaites)、Solanum corneliomulleri、辣椒(Capsicum annuum)、茄 子(Solanum melongena)、马铃薯(Solanum tuberosum))、菜豆(Phaseolus vulgaris)、 豇豆(Vigna unguiculata)、阿拉比卡咖啡(Coffee arabica)、玉米(Zea mays)、高 粱属的种(Sorghum spp.)、水稻(Oryza sativa)、小麦属的种(Triticum spp.)、大 麦属的种(Hordeum spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)和Heliotropium  curassavicum中。相似的，可将编码SEQ ID NOs:25、26、27、28、29、30、 31、32、33、37、38、39、43、44、45、51、52、53、54、55、57、59、61、 63、64和65的蛋白质中任一种的基因引入至其他植物种中。

依照实施例11中描述的方法，生成并测试包含异源EG261基因或其直 系同源物的植物种。当在与从中分离异源EG261基因或其直系同源物的植物 种不同的植物种中异源表达时，结果确认该一个或多个EG261基因或其直系 同源物能够引入线虫抗性。

实施例14.引入线虫抗性至线虫易感植物中

本实施例表明，当来自野生抗SCN大豆种(Glycine pescadrensis)的EG261 直系同源物被转化至SCN敏感的‘Williams 82’大豆栽培种中时，观察到了之 前为SCN敏感的大豆栽培种中的获得性SCN抗性表型。也就是说，通过利 用转化(敲入)，培养的SCN敏感大豆栽培种变成抗SCN的。事实上，达到的 抗性水平大致等同于唯一已知的商业上可获得的抗SCN大豆栽培种。该结果 表明，通过利用分离自抗线虫植物的EG261直系同源物转化植物，能够在该 植物中实现SCN抑制，在某些情况下可接近0。

更具体地，对来自2个种(G.pescadrensis和G.microphylla)的EG261直 系同源物进行了测试。

从cDNA中PCR扩增了具有5’和3’UTR的G.pescadrensis EG261 ORF 并连接至pCR8中。克隆NOS终止子至pSM101-Gmubi中来生成具有强启动 子和终止子的过表达构建体。可采用如本文别处讨论的用于根部表达的和被 本领域技术人员熟知的可选启动子进行替代。从pCR8中剪切G.pescadrensis  EG261 ORF(5’PstI、3’BamHI)并连接至pSM101-Gmubi-NOS中。通过测序 验证了pSM101–Gmubi–G.pescadrensis EG261–NOS载体。

相似的，从cDNA中PCR扩增了具有UTR的G.microphylla EG261 ORF 并连接至pCR8中。克隆NOS终止子至pSM101-Gmubi中来生成具有强启动 子和终止子的过表达构建体。从pCR8中剪切G.microphylla EG261 ORF(5’ PstI、3’BamHI)并连接至pSM101-Gmubi-NOS中。通过测序验证了pSM101– Gmubi–G.microphylla EG261–NOS载体。

将这些构建体转化至发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)中。使SCN 易感基因型(‘Williams 82’)和抗SCN基因型(‘Fayette’)的子叶萌发且随后利用 包含这些EG261过表达构建体的农杆菌进行转化。这些子叶中出现了发丝状 根，并收获了GFP阳性根(那些表达感兴趣的基因以及空对照载体的根)并传 代培养(每具有各个构建体的基因型大致10个根)。压碎SCN包囊并孵化卵来 生产感染性幼虫(J2)。大约220只不育J2被置于这些转基因发丝状根上。

第二阶段幼虫，或称J2，是大豆包囊线虫唯一能够穿透根的生命阶段。 第一阶段幼虫发生于卵中，而第三和第四阶段发生在根中。J2进入根部，穿 过植物细胞移动至其进食的维管组织。J2在根中诱导细胞分裂来形成专门的 进食位点。随着线虫进食，其发生肿胀。雌性肿胀过多，使得其尾部末端从 根部冲破并变成肉眼可见。相反，成年雄性重新变成蠕虫状，并且其离开根 部以便寻找大的雌性并使其受精。雌性连续进食，同时在黄色胶状基质中产 出200至400个卵，形成仍处于其内的卵囊。随后雌性死亡且其表皮变硬形 成包囊。卵可在土壤条件合适时孵化，幼虫在包囊内发育，然后生物周期进 行自我重复。一年中通常可产生三代。在秋季或不适宜的条件下，包含休眠 幼虫的包囊可在土壤中保持完整数年。幼虫蜕皮成J3且随着生殖系统发育开 始变大。变成雌性的线虫不能再离开根部。它们在其经历J3和J4阶段期间 持续变大。在这段时间中，线虫头部周围的细胞增大形成滋养细胞或巨细胞。 对于根结线虫，经常会在根上形成瘿。在变成成虫的过程中，根结线虫会开 始在身体尾部末端产出包含在胶质基质中的卵(多至数百枚)。卵块可在根内或 在肿胀的雌性身体仍停留在根内时部分或全部暴露于根的表面。因此，我们 对J2和J3数目进行计数来评估线虫侵染的程度。

如上所述，利用品种‘Williams’作为SCN易感栽培种，并利用品种‘Fayette’ 作为抗SCN对照。下表中提供了三次独立实验的实验结果。本文使用的测试 方法描述于Melito等(BMC Plant Biology,2010,10:104,incorporated herein by  reference in its entirety)中。在下表中，“EV”指‘空载体’，即，已利用缺乏实验 基因但在其他方面由完整载体组成的载体构建体转化的对照植物。“OX”指‘过 表达’，即，其中包含实验EG261直系同源物的那些实验植物，且实验的敲入 基因以高水平活跃表达。“W”指SCN敏感性Williams 82大豆栽培种，同时“F” 指正常为抗SCN的大豆栽培种。“Microph”指源自G.microphylla的EG261 直系同源物，同时“Pesc”指源自G.pescadrensis的EG261直系同源物。

对结果的检验所明确的是，利用来自G.pescadrensis的EG261直系同源 物转化引起正常为SCN敏感性的Williams 82栽培种获得与抗SCN栽培种 Fayette大致相同水平的SCN抗性。虽然G.microphylla直系同源物在最初的 评估中没有表现出明显的SCN抑制，但是鉴于能够影响转化实验的变量数， 这并没有排除G.microphylla EG261直系同源物的有效性。(我们目前正在对 G.microphylla直系同源物重复该第一遍实验。)相反的，来自G.pescadrensis 的EG261直系同源物，在被引入至SCN敏感大豆植物中时，明显能够赋予 SCN抗性。我们目前正在研究来自其他SCN耐受野生大豆亲缘植物的EG261 直系同源物的有效性。

实施例15.采用EG261转化菜豆和豇豆

其他农业上相关的种如菜豆(Phaseolus vulgaris)和豇豆(Vigna unguiculata) 也能够利用包含EG261的构建体分别采用菜豆和豇豆的转化技术进行转化。 见，例如，Brasileiro等，1996(Suceptibility of common and tepary beans to  Agrobacterium spp.Strains and improvement of Agrobacterium-mediated  transformation using microprojectile bombardment,J.Am.Soc.Hortic.Sci.121, 810–815)；Estrada-Navarrete等，2007(Fast,efficient and reproducible genetic  transformation of Phaseolus spp.by Agrobeacterium rhizogenes,Nat.Protoc 2007；2(7):1819-24)；Ivo等，2008(Biolistic-mediated genetic transformation of  cowpea(Vigna unguiculata)and stable Mendelian inheritance of transgenes,Plant  Cell Rep 27:1475-83)；Popelka等，2006(Genetic transformation of cowpea(Vigna  unguiculata L.)and stable transmission of the transgenes to progeny,Plant Cell  Rep 2006；25:304-12)。

采用包含EG261的构建体转化菜豆或豇豆可使用包括在本专利中的栽培 /野生大豆直系同源物或使用它们各自的这些EG261基因的菜豆(Phaseolus  vulgaris)或豇豆(Vigna unguiculata)直系同源物来实现。

转化的菜豆植物可与未转化的对照‘Condor’、‘Matterhorn’、‘Sedona’、 ‘Olathe’或“Montcalm’菜豆植物相比较测试线虫/害虫抗性。转化的豇豆植物也 可以与未转化的对照‘IT 82E-16’、‘TVu 1390’或‘B301’豇豆植物相比较测试线 虫/害虫抗性。关于用于测试对线虫的耐受/抗性的流程，见，例如，Sasser等 (1984)Standardization of Host Suitability Studies and Reporting of Resistance to  Root-Knot Nematodes,Crop Nematode Research&Control Project(CNRCP),a  cooperative publication of The Department of Plant Pathology,North Carolina  State University and the United States Agency for International Development, North Carolina State University Graphics,Raleigh,NC,10 pages；和Cook,R.and  K.Evans(1987)Resistance and Tolerance,In:Principles and practice of nematode  control in plants,R.H.Brown and B.R.Kerry(editors),179-231页。

可通过利用一个或多个如下步骤测试对于一种或多种线虫种类表现出赋 予的和/或增强的抗性的转化菜豆或豇豆植物来确认EG261的存在：(a)从所 述植物分离核酸分子并扩增与EG261多核苷酸同源的序列；(b)从所述植物分 离核酸分子并实施Southern杂交来检测EG261多核苷酸；(c)从所述植物中分 离蛋白质并利用EG261多核苷酸编码的蛋白质的抗体实施蛋白质免疫印迹分 析；和/或(d)证明源自EG261多核苷酸mRNA转录物且为EG261多核苷酸所独 有的mRNA序列的存在。

对一种或多种线虫种类具有确认的耐受和/或抗性转化的菜豆或豇豆植 物可通过对该植物进行自花受粉、收获所得种子并从这些收获的种子培养抗 性植物来进行保持。

实施例16.通过将EG261基因引入至抗线虫植物品种改进线虫抗性

在一些实施方案中，根据本发明分离的赋予线虫抗性的EG261直系同源 物可被引入至相同或不同种的线虫易感植物中从而增强所述植物的线虫抗性。

然而，在一些其他实施方案中，本发明的EG261直系同源物可被引入至 相同或不同种的抗线虫植物中从而进一步增强所述植物的线虫抗性。

举例来说，可将编码SEQ ID NOs:9-15、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、37、38、39、43、44、45、51、52、53、54、55、57、59、61、63、 64或65的蛋白质中任一的基因引入至抗线虫植物中，所述植物包含任何抗线 虫性状如rhg1、rhg4或任何其他已知QTL，如Concibido等，2004(A decade of  QTL mapping for cyst nematode resistance in soybean,Crop Sci.44:1121-1131)； Shannon等，(2004)Breeding for resistance and tolerance,In:Biology and  management of soybean cyst nematode,2^nd ed,P.Schmitt,J.A.Wrather,and R.D. Riggs,(editors).页155-180；和Klink等，(2013)Engineered Soybean Cyst  Nematode Resistance,In:Soybean-Pest Resistance,Hany A.El-Shemy(editor), 页139-172中所列那些。

依照实施例11描述的方法，生成并测试包含异源EG261基因或其直系 同源物的抗线虫植物。结果会确认一个或多个EG261基因或其直系同源物当 表达于之前具有线虫抗性的植物中时能够改进线虫抗性。

实施例17.通过非转基因方法在线虫易感植物中赋予线虫抗性。

如上述实施例所述，线虫抗性可通过EG261基因或直系同源物的遗传转 化至线虫易感植物的基因组来向所述植物引入线虫抗性。

在其他的实施方案中，线虫抗性可通过非转基因(即，传统的)方法并入 植物中，如植物育种。举例来说，在具有赋予线虫抗性的天然存在或转基因 EG261基因拷贝的第一植物和第二植物之间进行杂交来生成F1植物。该F1 植物随后可经受多重回交来生成近等基因或等基因系，其中EG261抗线虫拷 贝被整合至第二植物的基因组中。

举例而言，具有天然存在的EG261基因拷贝的G.microphylla或G. Pescadrensis植物可与第二植物杂交来生成F1植物。该F1植物随后可经受多 重回交来生成近等基因或等基因系，其中EG261的抗线虫拷贝被整合至第二 植物的基因组中。相似的，包含G.microphylla或G.Pescadrensis EG261基因 拷贝的转基因植物可与第二植物进行杂交来生成F1植物。该F1植物随后可 经受多重回交来生成近等基因或等基因系，其中EG261抗线虫拷贝被整合至 第二植物的基因组中。

除非另外界定，本文的所有技术和科学术语与本发明所属领域的一般技 术人员的通常理解具有相同意义。虽然与本文所述那些相同或相似的任何方 法和材料可被用于实践和测试本发明，优选方法和材料应如本文所述。引用 的所有公开物、专利、专利公开以及核酸和氨基酸序列均以整体作为参考并 入本文用于各种目的。

提供的本文中讨论的公开物仅涉及其早于本申请的申请日的公开内容。 不应该将本文中的任何内容理解为是对由于在先发明而使本发明没有资格先 于这些出版物的承认。

虽然本发明连同其特定的实施方案已被描述，应该理解的是可对其进行 进一步改进，本申请意在覆盖根据本发明的任何变化、用途或调整，总的来 说，本发明的原理和包括的本公开的偏离以及本发明所属领域的技术人员已 知和常用的实践还有上文描述的实施的基本特征被阐述于附加的权利要求中。

序列表

SEQ ID NO:1

Glycine max的EG261 cDNA序列

agcaagagatgctcaaacccaaattcacctacttcgatgcttcccccaccttataaattcttgcattaatttaccactttcatcacccaatccacttcctctaattgac acccacctaaaccATGGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAG CAGAATACACAGGCTTCGTGGGAACACTAGACCCAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCT AAGCCACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAGAATCATTC CCTCACTCCCCAAATACAACGCAACCACAACCTTCGGCTCCGTTGGAATCTTTGACACCCCTTTAACC GTGGGACCTGAGGTGTACTCCAAGGTTGTCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGCCTCCACGTCACAAA CGCAGTTTGACCTGTTACTGATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATC ACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGCCCATTGTTGGTGGTAGTGGGG TCTTCAAATTTGCCACTGGGTATGTTGAGTCTAGGACGCTAAGTTTTGATCCCCAAACAAGGAATAAC ACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTACTATTGAtgattattgaatgtgtttttttcatgttgatgcgttatcgctttggtctgtctcacctagtttct a

SEQ ID NO:2

来自栽培大豆Glycine max的EG261编码序列

ATGGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGA ATACACAGGCTTCGTGGGAACACTAGACCCAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCTAAGC CACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAGAATCATTCCCTC ACTCCCCAAATACAACGCAACCACAACCTTCGGCTCCGTTGGAATCTTTGACACCCCTTTAACCGTGG GACCTGAGGTGTACTCCAAGGTTGTCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGCCTCCACGTCACAAACGCA GTTTGACCTGTTACTGATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATCACGT TCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGCCCATTGTTGGTGGTAGTGGGGTCTT CAAATTTGCCACTGGGTATGTTGAGTCTAGGACGCTAAGTTTTGATCCCCAAACAAGGAATAACACGG TTCAGTTCGACGTGTATATTTACTATTGA

SEQ ID NO:3

在美国专利号7569389中的SEQ ID 65260中存在的Glycine max EG261序列

atcacccaatccacttcctctaattgacacccacctaaaccATGGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTAT GCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTTCGTGGGAACACTAGACCCAAAGTCCATAGGCATAC ACCACAAGAAAACCCTAAGCCACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCAC ATCGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAATACAACGCAACCACAACCTTCGGCTCCGTTGGAATCT TTGACACCCCTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCCAAGGTTGTCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTT GCCTCCACGTCACAAACGCAGTTTGACCTGTTACTGATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTA CAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGCCCATT GTTGGTGGTAGTGGGGTCTTCAAATTTGCCACTGGGTATGTTGAGTCTAGGACGCTAAGTTTTGATCC CCAAACAAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTACTATTGAtgattattgaaagtgtttttttcatgttgatgcgt tatcgctttggtctgtctcacctagtttctacataagtttcctcttttgagggcatgtggtgtcatggaataaagtcatctttgggcaaaaaaaaaaaaaaaaaa

SEQ ID NO:4

来自Glycine microphylla的EG261 cDNA

ttaattcatcactttcatcacccaatccactcctctaattaacacccaccaacaccATGGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCT CCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTTCGTGGGGACACTAGACCCAAAGT CCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCTAAGCCACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGG AGAAAACCCCACAACGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAATACAACACAACCACAACCTTCGGTT CCGTTGGAATCTTTGACAACACTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCCAAGGTTGCCGGAAAAGCC GAGGGCTTGTTTGCCTCCACGTCACAAACGCAGTTTAACCTGTTACTGATTTACAGCTTCGCGTTGACC CAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGG GAGCTGCCCATTGTTGGTGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTGCCACTGGGTATGTTGAGTCTAGGACGCT AAGTTTTGATCCCCAAACGAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTACTATTGAtgattattgaatg tgttttttacatgttgatgtgttagagctttggtgtgtgtcacttagtttcta

SEQ ID NO:5

来自Glycine pescadrensis的EG261 cDNA

ataaattcttgcattaattcatcactttcatcacccaatccatttcctctaattaacacccaccaaaaccATGGCTTCCCACTTCCTCAAATCC CTCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTTCGTGGGCACACTAGA CCCAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCTAAACCACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTC TTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAATACAACACAACCACAA CCTTCGGTTCCGTTGGAATCTCTGACAACGCTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCCAAGGTTGTC GGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGTCTCCACGTCACAAACGCAGTTTGACCTGTTACTGATTTACAACTT CGCGTTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAG AAGGTGAGGGAGCTGCCCATTGTAGGTGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTTCCACTGGGTATGTTGAGTC TAGGACGCTAAGTTTTGATCCCCAAACGAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTACTATT GAtgattattgaatgtgttttttccatgttgatgtgttatagctttggtatgtgtcacttagtttcta

SEQ ID NO:6

来自Glycine tabacina的EG261 cDNA(新威尔士，澳大利亚)

catcacccaatccactcctctaattaacacccaccaacaccATGGCTTCCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCA CCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTTCGTGGGGACACTAGACCCAAAGTCCATAGG CATACACCACAAGAAAACCCTAAGCCACTTCAGGTTCTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAAC CCCACAACGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAATACAACACAACCACAACCTTCGGTTCCGTTGG AATCTTTGACAACACTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTACTCTAAGGTTGCCGGAAAAGCCGAGGGC TTGTTTGCCTCCACGTCACAAACGCAGTTTAACCTGTTACTGATTTACAGCTTCGCGTTGACCCAAGGG AAGTACAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGGAGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGC CCATTGTTGGTGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTGCCACTGGGTATGTTGAGTCTAGGACGCTAAGTTTT GATCCCCAAACGAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACGTGTATATTTACTATTGAtgattattgaatgtgttttttacatgt tgatgtgttagagctttggtgtgtgtcacttagtttcta

SEQ ID NO:7

来自Glycine tabacina的EG261 cDNA(台湾)

cctacttcgatgcttcccccaccttataaattcttgcattaattcatcactttcatcacccaatccatttcctctaattaacacccaccaaaaccATGGCTTCC CACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCTTC GTGGGCACACTAGACCCAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCTAAACCACTTCAGGTTCT ACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAATAC AACACAACCACAACCTTCGGTTCCGTTGGAATCTCTGACAACGCTTTAACCGTGGGACCTGAGGTGTA CTCCAAGGTTGTCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGTCTCCACGTCACAAACGCAGTTTGACCTGTTAC TGATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGGAG CCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGCCCATTGTAGGTGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTTCCACTG GGTATGTTGAGTCTAGGACGCTAAGTTTTGATCCCCAAACGAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACGTG TATATTTACTATTGAtgattattgaatgtgttttttccatgttgatgtgttatagctttggtatgtgtcacttagtttcta

SEQ ID NO:8

来自Glycine tomentella的EG261 cDNA(澳大利亚)

cacctacttcgatgcttccccccaccttataaattcttgcattaattcatcactttcatcacccaatccatttcctctaattaacacccaccaaaaccATGGCTT CCCACTTCCTCAAATCCCTCCTTCTCCTCTCCACCTATGCCCTCACCATCTCAGCAGAATACACAGGCT TCGTGGGCACACTAGACCCAAAGTCCATAGGCATACACCACAAGAAAACCCTAAACCACTTCAGGTT CTACTGGCACGAAGTCTTCAGCGGAGAAAACCCCACATCGGTTAGAATCATTCCCTCACTCCCCAAAT ACAACACAACCACAACCTTCGGTTCCGTTGGAATCTCTGACAACGCTTTAACCGTGGGACCTGAGGTG TACTCCAAGGTTGTCGGAAAAGCCGAGGGCTTGTTTGTCTCCACGTCACAAACGCAGTTTGACCTGTT ACTGATTTACAACTTCGCGTTGACCCAAGGGAAGTACAACGGCAGCACCATCACGTTCACGGGGAGG AGCCCCCTCTCGGAGAAGGTGAGGGAGCTGCCCATTGTAGGTGGCAGTGGGGTCTTCAAATTTTCCAC TGGGTATGTTGAGTCTAGGATGCTAAGTTTTGATCCCCAAACGAGGAATAACACGGTTCAGTTCGACG TGTATATTTACTATTGAtgattattgaatgtgttttttccatgttgatgtgttatagctttggtatgtgtcacttagtttctatataagtttccama

SEQ ID NO:9

由Glycine max SEQ ID NO:1编码的EG261多肽

MASHFLKSLLLLSTYALTISAEYTGFVGTLDPKSIGIHHKKTLSHFRFYWHEVFSGENPTSVRIIPSLPKYNA TTTFGSVGIFDTPLTVGPEVYSKVVGKAEGLFASTSQTQFDLLLIYNFALTQGKYNGSTITFTGRSPLSEKVR ELPIVGGSGVFKFATGYVESRTLSFDPQTRNNTVQFDVYIYY

SEQ ID NO:10

由Glycine max SEQ ID NO:3编码的EG261多肽

MASHFLKSLLLLSTYALTISAEYTGFVGTLDPKSIGIHHKKTLSHFRFYWHEVFSGENPTSVRIIPSLPKYNA TTTFGSVGIFDTPLTVGPEVYSKVVGKAEGLFASTSQTQFDLLLIYNFALTQGKYNGSTITFTGRSPLSEKVR ELPIVGGSGVFKFATGYVESRTLSFDPQTRNNTVQFDVYIYY

SEQ ID NO:11

由Glycine microphylla SEQ ID NO:4编码的EG261多肽

MASHFLKSLLLLSTYALTISAEYTGFVGTLDPKSIGIHHKKTLSHFRFYWHEVFSGENPTTVRIIPSLPKYNT TTTFGSVGIFDNTLTVGPEVYSKVAGKAEGLFASTSQTQFNLLLIYSFALTQGKYNGSTITFTGRSPLSEKVR ELPIVGGSGVFKFATGYVESRTLSFDPQTRNNTVQFDVYIYY

SEQ ID NO:12

由Glycine pescadrensis SEQ ID NO:5编码的EG261多肽

MASHFLKSLLLLSTYALTISAEYTGFVGTLDPKSIGIHHKKTLNHFRFYWHEVFSGENPTSVRIIPSLPKYNT TTTFGSVGISDNALTVGPEVYSKVVGKAEGLFVSTSQTQFDLLLIYNFALTQGKYNGSTITFTGRSPLSEKV RELPIVGGSGVFKFSTGYVESRTLSFDPQTRNNTVQFDVYIYY

SEQ ID NO:13

由Glycine tabacina SEQ ID NO:6编码的EG261多肽(新南威尔士，澳大利亚)

MASHFLKSLLLLSTYALTISAEYTGFVGTLDPKSIGIHHKKTLSHFRFYWHEVFSGENPTTVRIIPSLPKYNT TTTFGSVGIFDNTLTVGPEVYSKVAGKAEGLFASTSQTQFNLLLIYSFALTQGKYNGSTITFTGRSPLSEKVR ELPIVGGSGVFKFATGYVESRTLSFDPQTRNNTVQFDVYIYY

SEQ ID NO:14

由Glycine tabacina SEQ ID NO:7编码的EG261多肽(台湾)

MASHFLKSLLLLSTYALTISAEYTGFVGTLDPKSIGIHHKKTLNHFRFYWHEVFSGENPTSVRIIPSLPKYNT TTTFGSVGISDNALTVGPEVYSKVVGKAEGLFVSTSQTQFDLLLIYNFALTQGKYNGSTITFTGRSPLSEKV RELPIVGGSGVFKFSTGYVESRTLSFDPQTRNNTVQFDVYIYY

SEQ ID NO:15

由Glycine tomentella SEQ ID NO:8编码的EG261多肽(澳大利亚)

MASHFLKSLLLLSTYALTISAEYTGFVGTLDPKSIGIHHKKTLNHFRFYWHEVFSGENPTSVRIIPSLPKYNT TTTFGSVGISDNALTVGPEVYSKVVGKAEGLFVSTSQTQFDLLLIYNFALTQGKYNGSTITFTGRSPLSEKV RELPIVGGSGVFKFSTGYVESRMLSFDPQTRNNTVQFDVYIYY

SEQ ID NO:16

来自栽培番茄的EG261直系同源物的部分cDNA(Solanum lycopersicum或Solanum esculentum)

cattccATGGCCAAACTAATACTCCAAATCTTCACCATTTCCCTCTTCCTTTCTCTGGTGGCCTTTCGCGCC ACCGGAGAAGAAGATAATTATATTTTTGGAAAATCCATAAACAAAAAACCCACAAGGTTAAGAAAGG AAAAAATCAGTCATTTTCGATTTTTTTGGCATGATATTTTAAGTGGTTCAAAACCAACATCAATGATG ATTATTCCACCACCTAAAAACACAACAACAGGTTTTGGACAAATGAATATGATAGATAATGCCTTAAC CTTAGGACCAAAACTAAGTTCCAAGATTGTTGGTAGGGCACAAGGGTTTTATGGTGCTGCTTCACTTA ATGATGTTGGATTAATGATGGTTATGAATTTTGCTTTTATTGAAGGGAAATATAATGGAAGTACTTTTA CTATACTTGGTCGGAATCCGGTGTTCGAGAAGGTGAGAGAGATGGCGGTGATCGGAGGGAGTGGGCT TTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTCAAGCTAGTACTCATTCATGGGATTTCAAAACTGGAGATGCTA CTGTTCAGTATGATGCTTATGTCTTTGCATTATTGAGGTTTACTAATTTTATATATTTTCATCGTGTCAA TTTATG

SEQ ID NO:17

来自秘鲁番茄的EG261直系同源物的cDNA(也称为秘鲁茄，Solanum peruvianum)

tcaaagaatttacttccattccATGGCCAAACTAATACTCCAAATCTTCACCATTTCCCTCTTCCTTTCTCTGG TGGCCTTTCGCGCCACCGGAGAAGAAGATAATTATGTTTTTGGAAAATCCATAAACAAAAAACCCAC AAGGTTAAGAAAGGAAAAATTCAGTCATTTTCGATTTTATTGGCATGATATTTTAAGTGGTTCAAAAC CAACATCAATGATGATTATTCCACCACCTAAAAACACAACAACAGGTTTTGGACAAATGAATATGAT AGATAATGCCTTAACCTTAGGACCAAAACTAAGTTCCAAGATTGTTGGTAGGGCACAAGGGTTTTATG GTGCTGCTTCACTTAATGATGTTGGATTAATGATGGTTATGAATTTTGCTTTTATTGAAGGGAAATATA ATGGAAGTACTTTTACTATACTTGGTCGGAATCCGGTGTTCGAGAAGGTGAGAGAGATGGCGGTGAT CGGAGGGACTGGGCTTTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTGAAGCTAGTACTCATTCATGGGATTTCA AAACTGGAGATGCTACTGTTCAGTATGATGCTTATGTCTTGCATTATTGAggtttactaattttatatattttcatcgtgtcaat ttatgcgacctagtt

SEQ ID NO:18

克梅留斯基番茄的EG261直系同源物的部分cDNA

attccATGGCCAAACTAATACTCCAAATCTTCACCATTTCCCTCTTCCTTTCTCTGGTGGCCTTTCG CGCCACYGGAGAAGAAGATAATTATATTTTTGGAAAATCCATAAACAAAAAACCCACAAGGTTAAGA AAGGAAAAAATCAGTCATTTTCGATTTTATTGGCATGATATTTTAAGTGGTTCAAAACCAACATCAAT GATGATTATTCCACCACCTAAAAACACAACAACAGGTTTTGGACAAATGAATATGATAGATAATGCC TTAACCTTAGGACCAAAACTAAGTTCCAAGATTGTTGGTAGGGCACAAGGGTTTTATGGTGCTGCTTC ACTTAATGATGTTGGATTAATGATGGTTATGAATTTTGCTTTTATTGAAGGGAAATATAATGGAAGTA CTTTTACTATACTTGGTCGGAATCCGGTGTTTGAGAAGGTGAGAGAGATGGCGGTGATAGGAGGGAG TGGGCTTTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTCAAGCTAGTACTCATTCATGGGATTTCAAAACTGGAG ATGCTACTGTTC

SEQ ID NO:19

多毛番茄的EG261直系同源物的cDNA

tacttccattccATGGCCAAACTAATACTCCAAATCTTCACCATTTCCCTCTTCCTTTCTCTGGTGGCCTTTCGS GCCACCGGAGAAGAAGATAATYATATTTTTGAAAAATCCATAAACAAAAAACCCACAAGGTTAAGAA AGSAAAAATTCAGTCATTTTCGATTTTATTGGCATGATATTCTAAGTGGTTCAAAACCAACATCAATG ATGATTATTCCACCACCTAAAAACACAACAACAGGTTTTGGACAAATGAATATGATAGATAATGCCTT AACCTTAGGACCAAAACTAAGTTCCAAGATTGTTGGTAGGGCACAAGGGTTTTATGGTGCTGCTTCAC TTAATGATGTTGGATTAATGATGGTTATGAATTTTGCTTTTATTGAAGGGAAATAYAATGGAAGTACT TTTACTATACTTGGTCGGAATCCGGTGWTCGAGAAGGTGAGAGAGATGGCGGTGATCGGAGGGAGTG GGCTTTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTCAAGCTAGTACTCATTCATGGGATTTCAAAACTGGAGAT GCTACTGTTCAGTATGATGCTTATGTCTTGCATTATTGAggtttactaattttatatat

SEQ ID NO:20

Solanum corneliomulleri的EG261直系同源物的cDNA

cttcaccaactgactcaaagaatttacttccattccATGGCCAAACTAATACTCCTAATCTTCACCATTTCCGTCTTCCTTTCT CTGGTGGCCTTTCGTGCCACCGGAGAAGAAGATAATTATATTTTTGGAAAATCCATAAACAAAAAAC CCACAAGGTTAAGAAAGGAAAAATTCAGTCATTTTCGATTTTATTGGCATGATATTTTAAGTGGTTCA AAACCAACATCAATGATGATTATTCCACCACCTAAAAACACAACAACAGGTTTTGGACAAATGAATA TGATAGATAATGCCTTAACCTTAGGACCAAAACTAAGTTCCAAGATTGTTGGAAGGGCACAAGGGTT TTATGGTGCTGCTTCACTTAATGATGTTGGATTAATGATGGTTATGAATTTTGCTTTTATTGAAGGGAA ATATAATGGAAGTACTTTTACTATACTTGGTCGGAATCCGGTGTTCGAGAAGGTGAGAGAGATGGCG GTGATCGGAGGGAGTGGGCTTTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTCAAGCTAGTACTCATTCATGGGA TTTCAAAACTGGAGATGCTACTGTTCAGTATGATGCTTATGTCTTGCATTATTGAggtttactaattttatatattttcatc SEQ ID NO:21

辣椒(Capsicum annuum)的EG261直系同源物的cDNA

gcacgaggctcaaagaatctacttccATGGCCAAACTAATACTCCAAATCTTCTCCATTTCCGTTCTCTATTCACTGGT AGCCTTTCCAGCCACGGGAGAAGAAGATCATATTTTTGGAAAATCCATAAATGAAAAGTCCATGAGG CTAAAAAGGGAAAAACTCAGCCATTTCAGATTTTATTGGCACGACGTCCTCAGTGGCTCCAAACCAAC ATCTATGATAATTATCCCACCTCCCAAAAATACTACCACAGGCTTTGGCCAAATGAATATGATAGATA ATGCCCTAACCTTAGGACCAGAGCTGAGTTCCAGGATAGTTGGAAGGGCACAAGGGTTTTACGCTGC TGCTTCACTAAATGATGTTGGCTTAATGATGGTCATGAACTTTGCTTTTATTGAAGGAAAATATAATG GGAGCACCTTCACTATACTTGGACGAAATCCGGTATTTGAGAAGGTGAGAGAGATGGCCGTGATCGG CGGCAGTGGGCTTTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTCAGGCTAGTACTCATTCATTGGATTTCAAAA CTGGCGATGCTACTGTTCAGTATGATGCCTATGTTTTGCATTATTGAagtttactaatattatatatcact

SEQ ID NO:22

辣椒(Capsicum annuum)的EG261直系同源物的cDNA

gcacgaggtacttccATGGCCAAACTAATACTCCAAATCTTCTCCATTTCCGTTCTCTATTCACTGGTAG CCTTTCCAGCCACGGGAGAAGAAGATCATATTTTTGGAAAATCCATAAATGAAAAGTCCATGAGGCT AAAAAGGGAAAAACTCAGCCATTTCAGATTTTATTGGCACGACGTCCTCAGTGGCTCCAAACCAACA TCTATGATAATTATCCCACCTCCCAAAAATACTACCACAGGCTTTGGCCAAATGAATATGATAGATAA TGCCCTAACCTTAGGACCAGAGCTGAGTTCCAGGATAGTTGGAAGGGCACAAGGGTTTTACGCTGCT GCTTCACTAAATGATGTTGGCTTAATGATGGTCATGAACTTTGCTTTTATTGAAGGAAAATATAATGG GAGCACCTTCACTATACTTGGACGAAATCCGGTATTTGAGAAGGTGAGAGAGATGGCCGTGATCGGC GGCAGTGGGCTTTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTCAGGCTAGTACTCATTCATTGGATTTCAAAAC TGGCGATGCTACTGTTCAGTATGATGCCTATGTTTTGCATTATTGAagtttactaatattatatatcactctaatcggctagctgg cttttaattaataattatgtcg

SEQ ID NO:23

茄子(Solanum melongena)的EG261直系同源物的cDNA

ATGGCCAAACTATCACTCCAAATCTTCACCATCTCCATTCTCCTTTTTCTGGTTGCCTTTCCGGCAACC GGAGAAGAAGATAATTATACTTTTGGAAAATCCATAAATAAAAAGTCTATGAGGTTAAGAAAGGAGA AACTCAGCCATTTCAGATTTTATTGGCATGATGTCCTAAGTGGCTCAAAACCAACATCAATGATGATT ATTCCACCACCTAAAAACACCACAACAGGTTTTGGACAAATGAATATGATAGATAATGCCTTAACCTT AGGAGCAGAGTTGAGTTCCAAGATTGTTGGAAGGGCACAAGGGTTTTACGCTGCTGCTTCACTTAATG ATGTTGGATTAATGATGGTAATGAATTTTGCTTTTATTGAAGGGAAATATAATGGAAGCACTTTCACT ATACTTGGACGGAATCCGGTGTTTGAGAAGGTGAGGGAGATGGCGGTGATCGGAGGAAGTGGACTTT TCCGATTTGCTAGAGGATATGTTCAGGCCAGTACTCATTCATGGGATTACAAAACTGGAGATGCTACT GTGAAGTATGATGCTTA

SEQ ID NO:24

马铃薯(Solanum tuberosum)的EG261直系同源物的cDNA

gaaaattctccaccaagtgactcaaagaatttacttccattccATGGCCAAAATAATACTCCAAATCTTCACCATTTCCAT CTTCCTTTCTCTGGTGGCCTTTCCGGCCACCGGAGAAGAAGATACTTATATTTTTGGAAAATCTATAAA CAAAAAACCCACAAGGTTAAAAAAGGAAAAATTCAGTCATTTTCGATTTTATTGGCATGATATTCTAA GTGGTTCAAAACCAACATCAATGATGATTATTCCACCATCTAAAAACACAACAACAGGTTTTGGGCA AATGAATATGATAGATAATGCCTTAACCTTAGGACCAGAATTAAGTTCCAAGATTGTTGGAAGGGCG CAAGGGTTTTATGGTGCTGCTTCACTTAATGATGTTGGTTTAATGATGGTTATGAATTTTGCTTTTATT GAAGGGAAATATAATGGAAGTACTTTTACTATACTTGGTCGGAATCCGGTGTTCGAGAAGGTGAGAG AGATGGCGGTGATCGGAGGGAGTGGGCTTTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTGAAGCTAGTACTCAT TCATGGGATTTTAAAACTGGAGATGCTACGGTTCAGTATGATGCTTATGTCTTGCATTATTAAggttttacta attttgtatgttttcgttgtgtcaattttataagatttagtttaactggatactaaatttatgaaatatcccattttgttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

SEQ ID NO:25

栽培番茄的中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:16编码的EG261多肽(Solanum lycopersicum或 Solanum esculentum)

MAKLILQIFTISLFLSLVAFRATGEEDNYIFGKSINKKPTRLRKEKISHFRFFWHDILSGSKPTSMMIIPPPKNT TTGFGQMNMIDNALTLGPKLSSKIVGRAQGFYGAASLNDVGLMMVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVFE KVREMAVIGGSGLFRFARGYVQASTHSWDFKTGDATVQYDAYVFALLRFTNFIYFHRVNLX

SEQ ID NO:26

秘鲁番茄中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:17编码的EG261多肽(也称为秘鲁茄，Solanum  peruvianum)

MAKLILQIFTISLFLSLVAFRATGEEDNYVFGKSINKKPTRLRKEKFSHFRFYWHDILSGSKPTSMMIIPPPK NTTTGFGQMNMIDNALTLGPKLSSKIVGRAQGFYGAASLNDVGLMMVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPV FEKVREMAVIGGTGLFRFARGYVEASTHSWDFKTGDATVQYDAYVLHY

SEQ ID NO:27

克梅留斯基番茄中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:18编码的EG261多肽

MAKLILQIFTISLFLSLVAFRATGEEDNYIFGKSINKKPTRLRKEKISHFRFYWHDILSGSKPTSMMIIPPPKN TTTGFGQMNMIDNALTLGPKLSSKIVGRAQGFYGAASLNDVGLMMVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVF EKVREMAVIGGSGLFRFARGYVQASTHSWDFKTGDATVX

SEQ ID NO:28

多毛番茄中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:19编码的EG261多肽

MAKLILQIFTISLFLSLVAFRATGEEDNXIFEKSINKKPTRLRKXKFSHFRFYWHDILSGSKPTSMMIIPPPKN TTTGFGQMNMIDNALTLGPKLSSKIVGRAQGFYGAASLNDVGLMMVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVX EKVREMAVIGGSGLFRFARGYVQASTHSWDFKTGDATVQYDAYVLHY

SEQ ID NO:29

Solanum corneliomulleri中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:20编码的EG261多肽

MAKLILLIFTISVFLSLVAFRATGEEDNYIFGKSINKKPTRLRKEKFSHFRFYWHDILSGSKPTSMMIIPPPKN TTTGFGQMNMIDNALTLGPKLSSKIVGRAQGFYGAASLNDVGLMMVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVF EKVREMAVIGGSGLFRFARGYVQASTHSWDFKTGDATVQYDAYVLHY

SEQ ID NO:30

辣椒(Capsicum annuum)中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:21编码的EG261多肽

MAKLILQIFSISVLYSLVAFPATGEEDHIFGKSINEKSMRLKREKLSHFRFY

WHDVLSGSKPTSMIIIPPPKNTTTGFGQMNMIDNALTLGPELSSRIVGRAQGFYAAASLN

DVGLMMVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVFEKVREMAVIGGSGLFRFARGYVQASTHSL

DFKTGDATVQYDAYVLHY

SEQ ID NO:31

辣椒(Capsicum annuum)中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:22编码的EG261多肽

MAKLILQIFSISVLYSLVAFPATGEEDHIFGKSINEKSMRLKREKLSHFRFYWHD

VLSGSKPTSMIIIPPPKNTTTGFGQMNMIDNALTLGPELSSRIVGRAQGFYAAASLNDVG

LMMVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVFEKVREMAVIGGSGLFRFARGYVQASTHSLDFK

TGDATVQYDAYVLHY

SEQ ID NO:32

茄子(Solanum melongena)中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:23编码的EG261多肽

MAKLSLQIFTISILLFLVAFPATGEEDNYTFGKSINKKSMRLRKEKLSHFRFYWHDVLSG

SKPTSMMIIPPPKNTTTGFGQMNMIDNALTLGAELSSKIVGRAQGFYAAASLNDVGLMMV

MNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVFEKVREMAVIGGSGLFRFARGYVQASTHSWDYKTGDA

TVKYDAX

SEQ ID NO:33

马铃薯(Solanum tuberosum)中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:21编码的EG261多肽:

MAKIILQIFTISIFLSLVAFPATGEEDTYIFGKSINKKPTRLKKEK

FSHFRFYWHDILSGSKPTSMMIIPPSKNTTTGFGQMNMIDNALTLGPELSSKIVGRAQGF

YGAASLNDVGLMMVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVFEKVREMAVIGGSGLFRFARGYV

EASTHSWDFKTGDATVQYDAYVLHY

SEQ ID NO:34

菜豆(Phaseolus vulgaris)，品种“蓝湖”(该菜豆品种是从蓝湖架豆开发的灌木型油豆角)，Henderson Bush  Lima豆(该豆品种年代为1885年)，Dixie斑点黄油豌豆利马豆(Dixie Speckled Butterpea Lima Bean)， Hidatsa Red Indian和Kabouli Black Garbanzo Asian豆(收集自喀布尔，阿富汗)中的EG261直系同源 物的部分cDNA，

tcctctaaccaccaaaaccATGGCTACCAAATTCCTCTTATCGTTCCTTCTCATCTCCTGCTATGTCCTCTC CATCTCAGGAGAGAAAGAAACAGGTTTCGTGGGCTCAGTAGACCCTAAGTCCTTAAGCTACAAGAAG AAGCACACTCTTAGCCACTTCAGGTTCTATTGGCACGAAATCTTCAGTGGAAGCAACCCCTCCTCGGT TAGAATCATTCCACCACAACCAAAGTACAGCACAACCACCACCTTCGGTTCGGTGGGAGTATTCGAC AACGTGTTGACCCTAGGACCCGAGTTGTACTCAAAGGTTGTGGGAAGTGCTGAAGGGTTGTACTCCTC CACATCACAAAAGGAGTTTGCCCTTTTGGTGATTACGAACTTTGTGTTGACCGAAGGGAAGTACAATG GTAGCACCATCACGTTCGTGGGGAGAAGTCCCATTGCTCAGAAGGTGAGGGAGATGCCTGTGGTTGG TGGCAGTGGTGTTTTCAGATTTGCCAGGGGCTTTGTTGAGTCCAGGACTCTGTCTTTTGATCCCCAAAC GAGGAACAACACAATTGAGTACAACGTCTACGTTTACCACTAAttgttgtgttttataggatgttaaggagtttgatcattgttgttg ttcttcaaaaaggctgta

SEQ ID NO:35

菜豆(Phaseolus vulgaris)、品种Scarlet Emperor(该品种产自至少1750，最初源自中美洲)中EG261直 系同源物的cDNA

acttcctctaaccaccaaaaccATGGCTACCAAATTCCTCTTATCGTTCCTTCTCATCTCCTGCTATGTCCTCT CCATCTCAGGAGAGAAAGAAACAGGTTTCGTGGGCTCAGTAGACCCTAAGTCCTTAAGCTACAAGAA GAAGCACACTCTTAGCCACTTCAGGTTCTATTGGCACGAAATCTTCAGTGGAAGCAACCCCTCCTCGG TTAGAATCATTCCACCACAACCAAAGTACAGCACAACCACCACCTTCGGTTCGGTGGGAGTATTCGAC AACGTGTTGACCCTAGGACCCGAGTTGTACTCAAAGGTTGTGGGAAGTGCTGAAGGGTTGTACTCCTC CACATCACAAAAGGAGTTTGCCCTTTTGGTGATTACGAACTTTGTGTTGACCGAAGGGAAGTACAATG GTAGCACCATCACGTTCGTGGGGAGAAGTCCCATTGCTCAGAAGGTGAGGGAGATGCCTGTCGTTGG TGGCAGTGGTGTTTTCAGATTTGCCAGGGGCTTTGTTGAGTCCAGGACTCTGGCTTTTGATCCCCAAAC GAGGAACAACACAATTGAGTACAACGTCTACGTTTACCACTAAttgttgtgcttttaaggatgttaaggagtttgatcattgttgtt gttc

SEQ ID NO:36

Jacob’s Cattle豆中EG261直系同源物的部分cDNA

GAAACAGGTTTCGTGGGCTCAGTAGACCCTAAGTCCTTAAGCTACAAGAAGAAGCACACYCTT AGCCACTTCAGGTTCTATTGGCACGAAATCTTCAGTGGAAGCAACCCCTCCTCGGTTAGAATCATTCC ACCACAACCAAAGTACAGCACAACCACCACCTTCGGTTCGGTGGGAGTATTCGACAACGTGTTGACC CTAGGACCCGAGTTGTACTCAAAGGTTGTGGGAAGTGCTGAAGGGTTGTACTCCTCCACATCACAAA AGGAGTTTGCCCTTTTGGTGATTACGAACTTTGTGTTGACCGAAGGGAAGTACAATGGTAGCACCATC ACGTTCGTGGGGAGAAGTCCCATTGCTCAGAAGGTGAGGGAGATGCCTGTGGTTGGYGGCAGTGGTG TTTTCAGATTTGCCAGGGGCTTTGTTGAGTCCAGGACTCTGTCTTTTGATCCCCAAACGAGGAACAAC ACAATTGAGTACAACGTCTACGTTTACCACTAAttgttgtgttttataggatgttaaggagtttgatcattgttgttgttcttcaaaaaggctgta

SEQ ID NO:37

SEQ ID NO:34编码的EG261多肽，菜豆品种“蓝湖”、Henderson Bush Lima豆，Dixie Speckled Butterpea  Lima豆，Hidatsa Red Indian和Kabouli Black Garbanzo Asian豆中的EG261直系同源物

MATKFLLSFLLISCYVLSISGEKETGFVGSVDPKSLSYKKKHTLSHFRFYWHEI

FSGSNPSSVRIIPPQPKYSTTTTFGSVGVFDNVLTLGPELYSKVVGSAEGLYSSTSQKEF

ALLVITNFVLTEGKYNGSTITFVGRSPIAQKVREMPVVGGSGVFRFARGFVESRTLSFDP

QTRNNTIEYNVYVYH

SEQ ID NO:38

菜豆(Phaseolus vulgaris)、品种Scarlet Emperor中的直系同源物，SEQ ID NO:35编码的EG261多肽

MATKFLLSFLLISCYVLSISGEKETGFVGSVDPKSLSYKKKHTLSHFRFYWHE

IFSGSNPSSVRIIPPQPKYSTTTTFGSVGVFDNVLTLGPELYSKVVGSAEGLYSSTSQKE

FALLVITNFVLTEGKYNGSTITFVGRSPIAQKVREMPVVGGSGVFRFARGFVESRTLAFD

PQTRNNTIEYNVYVYH

SEQ ID NO:39

Jacob’s Cattle豆中的EG261直系同源物，SEQ ID NO:36编码的EG261多肽:

ETGFVGSVDPKSLSYKKKHTLSHFRFYWHEIFSGSNPSSVRIIPPQPKYSTTTTFGSVGV

FDNVLTLGPELYSKVVGSAEGLYSSTSQKEFALLVITNFVLTEGKYNGSTITFVGRSPIA

QKVREMPVVGGSGVFRFARGFVESRTLSFDPQTRNNTIEYNVYVYH

SEQ ID NO:40

咖啡植物(Coffea arabica)中的EG261直系同源物的部分cDNA，等位基因A

ATGGCTAGAATTTCAGCATTTCCTCTCCTCACCATCTTCATCTTCATTTCCTGCATCACCGTTCA GGTCACTTATGGTGATGAAGAATACGAGTTTGTCAAAGCAATTGATCCAAAAGTAGCACTAAAGATG AAGAAAGAAAAGCTAAGCCTTTTCAGGTTCTACTGGCACGACATCCTCAGTGGCAAAGCACCTACTTC AGTCATGGTGGTGCCACCTCCGAAAACCAATTCATTCACTGCTTTTGGCCTGGTGAACATGATCGATA ATCCTTTAACTGTCGGCCCGGAGCTCAGCTCAAAATTGGTCGGGAGGGCTCAAGGGTTTTATGCATCA GCTTCACAAGAGGAAATTGGCTTCTTGATGACCATGAACTTTGCTTTCACTGAAGGTAAGTATAATGG AAGCACCCTCACCGTGTTAGGGAGGAATCCGGTGCTCAAAAAGGTGAGGGAGATGCCGGTGGTCGGC GGAAGTGGGCTTTTCCGATTTGCTAATGGTTATGCTCAGGCATCAACCCACAACTTTGACCCCAAGAC TGGTGATGCTGTTGTTGAGTACAACATCTATGTTATGCATTATTGAtgatcgtgggattgttttcccttagagatcggactttttc ctttgcttttgttttctttttgtctcttggtatttctgctagaaattttgtggggcataatatatcca

SEQ ID NO:41

咖啡植物(Coffea arabica)中的EG261直系同源物的部分cDNA，等位基因B

ATGGCTAGAATTTCAGCATTTCCTCTCCTCACCATCTTCATCTTCATTTCCTGCATCACCGTTCA GGTCACTTATGGTGATGAAGAATACGAGTTTGTCAAAGCAATTGATCCAAAAGTAGCACTAAAGATG AAGAAAGAAAAGCTAAGCCTTTTCAGGTTCTACTGGCACGACATCCTCAGTGGCAAAGCACCTACTTC AGTCATGGTGGTGCCACCTCCGAAAACCAATTCATTCACTGCTTTTGGCCTGGTGAACATGATCGATA ATCCGTTAACTGTTGGCCCGGACCTCAGCTCAAAATTGGTCGGGAGGGCTCAAGGGTTTTATGCATCA GCTTCACAGGAGGAAATTGGCTTCTTGATGACCATGAACTTTGCTTTCACTGAAGGTAAGTATAATGG AAGCACCCTCACCGTGTTAGGGAGGAATCCGGTGCTCAAAAAGGTGAGGGAGATGCCGGTAGTCGGC GGAAGTGGGCTTTTCCGATTTGCTAATGGTTATGCTCAGGCATCAACCCACAACTTTGACCCCAAGAC TGGTGATGCTGTTGTTGAGTACAACATCTATGTTATGCATTATTGATGAtcgtgggattgttttcccttagagatcggactttt tcctttgcttttgttttctttttgtctcttggtatttctgctagaaattttgtggggcataatatatcca

SEQ ID NO:42

栽培辣椒(“观赏性”辣椒)中的EG261直系同源物的部分cDNA

aatctacttccATGGCCAAACTAATACTCCAAATCTTCTCCATTTCCGTTCTCTATTCACTGGTAGCCT TTCCAGCCACGGGAGAAGAAGATCATATTTTTGGAAAATCCATAAATGAAAAGTCCATGAGGCTAAA AAGGGAAAAACTCAGCCATTTCAGATTTTATTGGCACGACGTCCTCAGTGGCTCCAAACCAACATCTA TGATAATTATCCCACCTCCCAAAAATACTACCACAGGCTTTGGCCAAATGAATATGATAGATAATGCC CTAACCTTAGGACCAGAGCTGAGTTCCAGGATAGTTGGAAGGGCACAAGGGTTTTACGCTGCTGCTTC ACTAAATGATGTTGGCTTAATGATGGTCATGAACTTTGCTTTTATTGAAGGAAAATATAATGGGAGCA CCTTCACTATACTTGGACGAAATCCGGTATTTGAGAAGGTGAGAGAGATGGCCGTGATCGGCGGCAG TGGGCTTTTCCGATTTGCTAGAGGATATGTTCAGGCTAGTACTCATTCATTGGATTTCAAAACTGGCG ATGCTACTGTTCAGTATGATGCCTATGTTTTGCATTATTGAagtttactaatattatatatcactctaatcggctagctggcttttaatta ataattatgtcg

SEQ ID NO:43

SEQ ID NO:40编码的EG261多肽，咖啡植物(Coffea arabica)中的EG261直系同源物，等位基因A，

MARISAFPLLTIFIFISCITVQVTYGDEEYEFVKAIDPKVALKMKKEKLSLFRFYWHDIL

SGKAPTSVMVVPPPKTNSFTAFGLVNMIDNPLTVGPELSSKLVGRAQGFYASASQEEIGF

LMTMNFAFTEGKYNGSTLTVLGRNPVLKKVREMPVVGGSGLFRFANGYAQASTHNFDPKT

GDAVVEYNIYVMHY

SEQ ID NO:44

SEQ ID NO:41编码的EG261多肽，咖啡植物(Coffea arabica)中的EG261直系同源物，等位基因B

MARISAFPLLTIFIFISCITVQVTYGDEEYEFVKAIDPKVALKMKKEKLSLFRFYWHDIL

SGKAPTSVMVVPPPKTNSFTAFGLVNMIDNPLTVGPDLSSKLVGRAQGFYASASQEEIGF

LMTMNFAFTEGKYNGSTLTVLGRNPVLKKVREMPVVGGSGLFRFANGYAQASTHNFDPKT

GDAVVEYNIYVMHY

SEQ ID NO:45

SEQ ID NO:42编码的EG261多肽，栽培辣椒(“观赏性”辣椒)中的EG261直系同源物

MAKLILQIFSISVLYSLVAFPATGEEDHIFGKSINEKSMRLKREKLSHFRFYWHDVL

SGSKPTSMIIIPPPKNTTTGFGQMNMIDNALTLGPELSSRIVGRAQGFYAAASLNDVGLM

MVMNFAFIEGKYNGSTFTILGRNPVFEKVREMAVIGGSGLFRFARGYVQASTHSLDFKTG

DATVQYDAYVLHY

SEQ ID NO:46

玉米中EG261直系同源物的部分cDNA，GenBank NM_001156097

accacacgtacgcccacaccagataatacactacagcacagcaccgacaacacctctcaagtaacccagcaggcaccATGGCCGCCGCCGT GCCCCTCCTCCTCCTCCTGCTACTGCCAACGACCCTGATGGCCGCGTCGGCGGCGTCCGGCGGCGAGA AGAGCACGCACATCAAGCTGTACTGGCACGACGTGGTGAGCGGGCCGAGCCCGACGGCGGTGCCGGT GGCGCAGGCGGCGGTGACCAACACCTCCAAGACCGCCTTCGGCATGGTGGTGGTGATCGACGACCCG CTGACCGAGGGCCCCGACCTCAAGTCCTCCAAGCCGCTCGGCCGCGCGCAGGGCACCTACGTCGGCG CGGGCAAGGACGAGCTCTCCCTGATGATGAACATGAATTTCGTGTTCCAGGCCGGCGAGTACAACGG CAGCACCGTCGCCATCATGGGCCGGAACGCCGTGTTCGACGCCGTCCGCGAGATGGCCGTCGTGGGC GGCACCGGCGCGTTCAGGATGGCGCGCGGGTACGCGCAGGCCCGCACGCACACCTTCGACCTCAACA CCGGCGACGCCACCGTCGAGTACAACCTCTACATCAAGCACTAGctagctagcccatcggctttgtgtttctgattgttggtgct catatatgaacacgatcgaactccataattgtcttgtgagctcaatttgtgccactggcttttgcagttttggtgaaaaagaagagggtaattaaaggacgatagcttcggtc gttgtaagctgacttcgatttaacttgcacaatgattgaggacttaaagaataaagatagtaatagactttgtttatctgatcaaaaaaaaaaaaaaaa

SEQ ID NO:47

高粱中EG261直系同源物的部分cDNA，GenBank CD430191

aaaaaaaaccaccaccacccatcgccATGGCCACCACCACGCTCTTCCTCCTCCTCTGCGCCGCCGCGGCACT CGCATCAGCGGCAGCCGCCGCCGACGACACCGGGTTCACGACCTTCAAGCTCTACTTCCACGACATCG TGGCGGGGACGTCGTCCCCAACCGCGGTGCGGATCGCGCAGGCGGCGTCGTCCAACACCTCCTCCAC CTCCTTCGGCGCCGTGGTGGCCATCGACGACCCTCTCACCACGGGGCCCACGCGGTCGTCCGGCACCG AGATCGGCCGCGCCCAGGGCACCTACACGTTCGCGGACCAGACCACGTTCGGCCTCCTCATGGTGAT GAACTTCGTGTTCACCGCCGGCGACCACAACGGCAGCACGCTCTCCATCCTCGGCCGGAACGAGGTG CTCACCGACGTCCGCGAGATGAGCATCGTCGGCGGCAGCGGAAAGTTCCGCATGGCCAAGGGCTATG TCCAGGCGCACACCATTGATTCCGGCGCCACCACCGGGGAGACCGTCGTCCAGTACACCGTCAACGT CAAGACGCCCTAGctagcttagttggtttcttgctccggccggccgggggcctgctggtgctgccatggcttgttgtattgtgtgcgtctccggcagctttgtac acacctgcttttgccgttcttcggtgttagtacatgacatgacatgtggtagattgagatttcagatcgactcgatcttcatcactattgagcgggatttatttggatttgc

SEQ ID NO:48

大米中EG261直系同源物的部分cDNA，GenBank CT835590

GAGACGACGGCGACGACGACGCACATCAAGGTGTACTGGCACGACGTGGTGAGCGGGCCGAG CCCGACGGCGGTGCAGGTGGCGAGGGCGGCGACGACCAACTCGTCGGCGAGCTTCTTCGGCGCCGTG GTGGTGATCGACGACCCGCTGACGTCGGGCCCCGACCTGAACGCCTCGTCGCCGGTGGGCCGCGCCC AGGGCACCTACGTCAGCGCCGGCAAGGACACGGTGGCGCTGCTCATGAACATGAACTTCGTCTTCCA GTCCGGCAGGTACAACGGCAGCACCGTCGCCATCATGGGCCGCAACGAGGTCTTCGCCGCCGTCCGC GAGATGGCCGTCGTCGGCGGCACCGGCGTCTTCCGGTGGGCCCGCGGCTACGCCCAGGCCCGGACCC ACACCTTCGACATGAAGACCGGCGACGCCACCGTTGAGTACAACCTCTACATCAACCACTGAactagtcatc tttctcatgagttttttttttaccttttcagaaattatggatttagttaatagttaatttttacttagcaccaaataattgatgattaatcttgcttggct

SEQ ID NO:49

小麦中EG261直系同源物cDNA，GenBank BJ260151

aagggaaatcATGGCCTCTGCCGTGCTCTTCGTCCTCCTCGCCCTGGCCACCATGCAACCGCAGACCGCGTC GTCCCAGAAGGAGACGCACCTCAAGGTGTACTGGCACGACGTGGTGAGCGGACCGGACCCGACGTCA GTGCCGGTGGCGCGCGCGACCACGACCAACACCTCCAAGACAGCCTTCGGCGTCGTCATGGTCATGG ACAACTCACTCACCGAGGGGCCGAGCCTCAACTCATCCAGGCTCATGGGCCGCGCCCAGGGCACCTA CATCGCCGCCGGCAAGGACCAGCTGGCGCTGCTCATGCTCATGAACTTCCTTTTCACCGCCGGCAAGT ACAACGGCAGCAGCGTCGCCATTATGGGTCGCAACGCCGTGTTCACCGAGGTCCGCGAGATGGCTGT CGTCGGCGGTACCGGCGTTTTCAGGTGGGCTCCAGGGTACGCGCAGGCCAGGACGCACACCTTGGAC CTCAAGACCGGCGACGCCACCGTTGAGTACAACGTATTCATCATGCACTAGtc

SEQ ID NO:50

大麦中EG261直系同源物的部分cDNA，GenBank AK373627

ggactactcgacagaaaatccATGGCCTCTGCAGCGCTCTTCTTTGTCCTCCTCGCCCTGGCCACAATGCTGCCGC AGACCGCGTCGTCCGAGAAGGAGACGCACCTCAAGGTGTACTGGCACGACGTGGTGAGCGGCCCGAA CCCGACGTCGGTGCCGGTGGCGCGTGCGGCCACGACCAACACCTCCAAGACAGCCTTCGGCGTCGTC ATGGTCATCGACAACCCACTCACCGAGGGGGGCAGCCTCAACTCATCCAGGCTCATGGGCCGCGCCC AGGGCACCTACATCGCCGCCGGCAAGGACCAGCTGGCGCTGCTCATGCTCATGAACTTCGTCTTCACT GCCGGCGAGTACAACGGCAGCAGCGTCGCCATTATGGGTCGCAACGCCGTGTTCACCGAGGTCCGCG AGATGGCTGTCGTCGGCGGTACCGGCGTTTTCAGGTGGGCTCGTGGGTACGCGCAGGCCAGGACGCA CACCTTGGACCTCAAGACCGGCGACGCCACCGTTGAGTACAAAGTATTCGTCATGCACTAGtcgtctcggcc gtggtcacattttaccaggacttttgtatacactcaagttacaagaataatttatttatttttgcggatgaagaataaatttatttatatgcgttacttacggaaaacttttctcacaat tcgtgtgtgtgtcattcacaattgatggtgctgccgtttaatattgatattgtattattgt

SEQ ID NO:51

预测的由玉米直系同源物SEQ ID NO:46编码的EG261多肽

MAAAVPLLLLLLLPTTLMAASAASGGEKSTHIKLYWHDVVSGPSPTAVPVAQAAVTNTSK

TAFGMVVVIDDPLTEGPDLKSSKPLGRAQGTYVGAGKDELSLMMNMNFVFQAGEYNGSTV

AIMGRNAVFDAVREMAVVGGTGAFRMARGYAQARTHTFDLNTGDATVEYNLYIKH

SEQ ID NO:52

预测的由高粱直系同源物SEQ ID NO:47编码的EG261多肽

MATTTLFLLLCAAAALASAAAAADDTGFTTFKLYFHDIVAGTSSPTAVRIAQAASSNTSS

TSFGAVVAIDDPLTTGPTRSSGTEIGRAQGTYTFADQTTFGLLMVMNFVFTAGDHNGSTL

SILGRNEVLTDVREMSIVGGSGKFRMAKGYVQAHTIDSGATTGETVVQYTVNVKTP

SEQ ID NO:53

预测的由大米直系同源物SEQ ID NO:48编码的EG261多肽

ETTATTTHIKVYWHDVVSGPSPTAVQVARAATTNSSASFFGAVVVIDDPLTSGPDLNASSP

VGRAQGTYVSAGKDTVALLMNMNFVFQSGRYNGSTVAIMGRNEVFAAVREMAVVGGTGVFR

WARGYAQARTHTFDMKTGDATVEYNLYINH

SEQ ID NO:54

预测的由小麦直系同源物SEQ ID NO:49编码的EG261多肽

MASAVLFVLLALATMQPQTASSQKETHLKVYWHDVVSGPDPTSVPVARATTTNTSKTAFG

VVMVMDNSLTEGPSLNSSRLMGRAQGTYIAAGKDQLALLMLMNFLFTAGKYNGSSVAIMG

RNAVFTEVREMAVVGGTGVFRWAPGYAQARTHTLDLKTGDATVEYNVFIMH

SEQ ID NO:55

预测的由大麦直系同源物SEQ ID NO:50编码的EG261多肽

MASAALFFVLLALATMLPQTASSEKETHLKVYWHDVVSGPNPTSVPVARAATTNTSKTAF

GVVMVIDNPLTEGGSLNSSRLMGRAQGTYIAAGKDQLALLMLMNFVFTAGEYNGSSVAIM

GRNAVFTEVREMAVVGGTGVFRWARGYAQARTHTLDLKTGDATVEYKVFVMH

SEQ ID NO:56

棉(Gossypium hirsutum)中的EG261直系同源物部分cDNA，品种FJ600364

ATGGCTAAACTTTCAGAAAACACCCTAGCTGCCCACTTCATCTTCACCATTTTCATCGTTTCAG CTTTAGCTGAAAACGGCAGTAGCTTCGCGAGAACCATGGACAAGAAGGTGTTGGGGATGAAGAAGG AAAAGCTCAGCCACTTTAGGCTATACTGGCACGACATTGTTGGCGGGAAAAACGCGACGGCGGTTCC GGTGGTTTTCCCATCGAGGAATTCAACGACGGCGTTCGGTATGATCAGTGTAATAGACGATCCTTTAA CGATGAGACCTGAATTAAGTTCGAAAATGGTGGGAAGAGCACAAGGGTTTTACTCGGCGGCGTCACA ACAAGAAGTAGGATTGTTGATGGCGATGAATTTTGCTTTTATGGAAGGGAAATATAATGGGAGTACG ATAACGATATTGGGGAGGAACACGGTGTTTTCAAAGGCGAGGGAAATGCCGGTGATCGGCGGTAGTG GACTATTTAGGTTTGCTAGAGGGTATGTTGAAGCTAGAACGCATCTTTTTGATCCTGCTACTGGTGATG CTGTGGTTCAGTATGATTGTTATGTTATGCATTATTGA

SEQ ID NO:57

由棉(Gossypium hirsutum)直系同源物SEQ ID NO:56编码的EG261多肽，品种FJ600364

MAKLSENTLAAHFIFTIFIVSALAENGSSFARTMDKKVLGMKKEKLSHFRLYWHDIVGGK

NATAVPVVFPSRNSTTAFGMISVIDDPLTMRPELSSKMVGRAQGFYSAASQQEVGLLMAM

NFAFMEGKYNGSTITILGRNTVFSKAREMPVIGGSGLFRFARGYVEARTHLFDPATGDAV

VQYDCYVMHY

SEQ ID NO:58

棉(Gossypium hirsutum)中的EG261直系同源物部分cDNA EST，品种FJ600365

ATGGCTAGGATTCCTCTTCTCTTAGCTTCCAAATTCATCTTCTTATCCATTTTATCCTCCTCAGG CGTCATCCGATGCACCCGAGGCGAAAACAATGACGATCATGGCTTCATCCAGAGCCTTGACCGAGAG TCGATGGGCTTAAAAAAAGAAAAGCTAAGTCACTTTCGCATCTACTGGCACGACATTGTTAGTGGCCG CAATGCTACGTCGATACGAGTGGTTCGACCTTCTAACGCATCGGTAACAGGGTTCGGAATAATCAACA TGATCGACAATCCATTAACCTTAGGGCCGAACCTAAGCTCGAAACTAGTGGGAAGAGCACAAGGGTT CTACGCACTCTCGTCACAAGAAGAAGTGGGATTGTTGATGTCGATGAACTTTGCTTTCACGGAAGGGA AATACAATGGTAGCACGATCACAGTGTTGGGGAGAAACCCAGTTTTCAACAAAGTGAGGGAAATGCG GGTGATCGGAGGCAGCGGACTTTTCCGATTCGCCCGAGGCTATGTTCAAGCAAGAACTAATACATTA AACTTGACAACCGGAGATGCCATTGTTGAATACACTTGTTATGTGATGCATTATTGA

SEQ ID NO:59

由SEQ ID NO:58编码的EG261多肽，棉(Gossypium hirsutum)中的直系同源物，品种FJ600365

MARIPLLLASKFIFLSILSSSGVIRCTRGENNDDHGFIQSLDRESMGLKKEKLSHFRIYW

HDIVSGRNATSIRVVRPSNASVTGFGIINMIDNPLTLGPNLSSKLVGRAQGFYALSSQEE

VGLLMSMNFAFTEGKYNGSTITVLGRNPVFNKVREMRVIGGSGLFRFARGYVQARTNTLN

LTTGDAIVEYTCYVMHY

SEQ ID NO:60

收集自非洲的猴尾(Heliotropium curassavicum)中的EG261直系同源物中的部分cDNA

gctctaaccaccataatcATGGCTACCAAATTCCTCTTATCGTTCCTTTTCATCTCCTGCTATGTCCTCTCC ATCTCAGCAGACAAAGAAACAGGTTTCGTGGGCCCAGTTGATCCTAAGTCCGTAAGCTACAAGAAGA AGCACACATTTAGCCACTTCAGGTTCTATTGGCACGAAATCTTCAGTGGAAGCAACCCCTCCTCTGTT AGAATCGTTCCACCACAACCAAAGTACAGCACAACCACCACCTTCGGTTCTGTGGGAGTATTCGACA ACGTGTTGACCCTAGGACCCGAGTTGTACTCAAAGGTTGTGGGAAGTGCCGAAGGGTTGTACTCCTCT GCTTCACAAAAGGAGTTTGCCCTTTTGGTCATTATGAACTTCGCGTTGACCGAAGGGAAGTACAATGG TAGCACCATCACGTTCGTGGGGAGAAGCCCCATCGCTCAAAAGGTGAGAGAGATGCCTGTAATTGGT GGCACCGGTGTTTTCAGATTTGCCAGGGGCTATGTTGAGTCCTCGACCATCACCTTTGATCCTCAAAC GAGGAACAACACAATTGAGTACAACGTCTATGTTTACCACTAAttgttgtgttttgaaggatgttgaggagtttgatcattgttgtt cttgttgttcttgaaaaaggctttagtgtgcc

SEQ ID NO:61

SEQ ID NO:60编码的EG261多肽，猴尾中的直系同源物

MATKFLLSFLFISCYVLSISADKETGFVGPVDPKSVSYKKKHTFSHFRFYWHEIFSGSNP

SSVRIVPPQPKYSTTTTFGSVGVFDNVLTLGPELYSKVVGSAEGLYSSASQKEFALLVIM

NFALTEGKYNGSTITFVGRSPIAQKVREMPVIGGTGVFRFARGYVESSTITFDPQTRNNT

IEYNVYVYH

SEQ ID NO:62

豌豆，品种Risina Del Trasiorfino(采自佩鲁贾，意大利)和窝棚豌豆(采自南卡罗莱纳州，美国)中的 EG261直系同源物的部分cDNA

gctctaaccaccataatcATGGCTACCAAATTCCTCTTATCGTTCCTTTTCATCTCCTGCTATGTCCTCTCC ATCTCAGCAGACAAAGAAACAGGTTTCGTGGGCCCAGTTGATCCTAAGTCCGTAAGCTACAAGAAGA AGCACACATTTAGCCACTTCAGGTTCTATTGGCACGAAATCTTCAGTGGAAGCAACCCTTCCTCTGTT AGAATCGTTCCACCACAACCAAAGTACAGCACAACCACCACCTTCGGTTCTGTGGGAGTATTCGATAA CGTGTTGACCCTAGGACCCGAGTTGTACTCAAAGGTTGTGGGAAGTGCCGAAGGGTTGTACTCCTCTG CTTCACAAAAGGAGTTTGCCCTTTTGGTCATTATGAACTTCGCGTTGACCGAAGGGAAGTACAATGGT AGCACCATCACGTTCGTGGGGAGAAGCCCCATCGCTCAAAAGGTAAGAGAGATGCCTGTGATTGGTG GCACCGGTGTTTTCAGATTTGCCAGGGGCTATGTTGAGTCCTCGACCATCACCTTCGATCCTCAAACG AGGAACAACACAATTGAGTACAACGTCTATGTTTACCACtaattgttgtgttttgaaggatgttgaggagtttgatcattgttgttcttga aaaaggctttagtgtgcc

SEQ ID NO:63

由SEQ ID NO:62编码的EG261多肽，豌豆、品种Risina Del Trasiorfino(采自佩鲁贾，意大利)和窝 棚豌豆(采自南卡罗莱纳州，美国)中的直系同源物

MATKFLLSFLFISCYVLSISADKETGFVGPVDPKSVSYKKKHTFSHFRFYWHEIFSGSNP

SSVRIVPPQPKYSTTTTFGSVGVFDNVLTLGPELYSKVVGSAEGLYSSASQKEFALLVIM

NFALTEGKYNGSTITFVGRSPIAQKVREMPVIGGTGVFRFARGYVESSTITFDPQTRNNT

IEYNVYVYH

SEQ ID NO:64

棉(Gossypium hirsutum)中分离的EG261直系同源物cDNA

cgtgcagaagATGGCTAGGATTCCTCTTCTCTTAGCTTCCAAATTCATCTTCTTATCCATTTTATCCTC CTCAGGCGTCATCCGATGCACCCGAGGCGAAAACAATGACGATCATGGCTTCATCCAGAGCCTTGAC CGAGAGTCGATGGGCTTAAAAAAAGAAAAGCTAAGTCACTTTCGCATCTACTGGCACGACATTGTTA GTGGCCGCAATGCTACGTCGATACGAGTGGTTCGACCTTCTAACGCATCGGTAACAGGGTTCGGAATA ATCAACATGATCGACAATCCATTAACCTTAGGGCCGAACCTAAGCTCGAAACTAGTGGGAAGAGCAC AAGGGTTCTACGCACTCTCGTCACAAGAAGAAGTGGGATTGTTGATGTCGATGAACTTTGCTTTCACG GAAGGGAAATACAATGGTAGCACGATCACAGTGTTGGGGAGAAACCCAGTTTTCAACAAAGTGAGG GAAATGCGGGTGATCGGAGGCAGCGGACTTTTCCGATTCGCCCGAGGCTATGTTCAAGCAAGAACTA ATACATTAAACTTGACAACCGGAGATGCCATTGTTGAATACACTTGTTATGTGATGCATTATTGAatgtgt gacccatttgctttgcattattataaagttaaatttgctttaatcat

SEQ ID NO:65

棉中EG261直系同源物的分离的编码序列

ATGGCTAGGATTCCTCTTCTCTTAGCTTCCAAATTCATCTTCTTATCCATTTTATCCTCCTCAGG CGTCATCCGATGCACCCGAGGCGAAAACAATGACGATCATGGCTTCATCCAGAGCCTTGACCGAGAG TCGATGGGCTTAAAAAAAGAAAAGCTAAGTCACTTTCGCATCTACTGGCACGACATTGTTAGTGGCCG CAATGCTACGTCGATACGAGTGGTTCGACCTTCTAACGCATCGGTAACAGGGTTCGGAATAATCAACA TGATCGACAATCCATTAACCTTAGGGCCGAACCTAAGCTCGAAACTAGTGGGAAGAGCACAAGGGTT CTACGCACTCTCGTCACAAGAAGAAGTGGGATTGTTGATGTCGATGAACTTTGCTTTCACGGAAGGGA AATACAATGGTAGCACGATCACAGTGTTGGGGAGAAACCCAGTTTTCAACAAAGTGAGGGAAATGCG GGTGATCGGAGGCAGCGGACTTTTCCGATTCGCCCGAGGCTATGTTCAAGCAAGAACTAATACATTA AACTTGACAACCGGAGATGCCATTGTTGAATACACTTGTTATGTGATGCATTATTGA

SEQ ID NO:66

Glycine pescadrensis中EG261 cDNA SEQ ID NO.5的相应mRNA序列

auaaauucuugcauuaauucaucacuuucaucacccaauccauuuccucuaauuaacacccaccaaaaccAUGGCUUCCCACUUC CUCAAAUCCCUCCUUCUCCUCUCCACCUAUGCCCUCACCAUCUCAGCAGAAUACACAGGCUUCGUG GGCACACUAGACCCAAAGUCCAUAGGCAUACACCACAAGAAAACCCUAAACCACUUCAGGUUCUAC UGGCACGAAGUCUUCAGCGGAGAAAACCCCACAUCGGUUAGAAUCAUUCCCUCACUCCCCAAAUAC AACACAACCACAACCUUCGGUUCCGUUGGAAUCUCUGACAACGCUUUAACCGUGGGACCUGAGGU GUACUCCAAGGUUGUCGGAAAAGCCGAGGGCUUGUUUGUCUCCACGUCACAAACGCAGUUUGACC UGUUACUGAUUUACAACUUCGCGUUGACCCAAGGGAAGUACAACGGCAGCACCAUCACGUUCACG GGGAGGAGCCCCCUCUCGGAGAAGGUGAGGGAGCUGCCCAUUGUAGGUGGCAGUGGGGUCUUCAA AUUUUCCACUGGGUAUGUUGAGUCUAGGACGCUAAGUUUUGAUCCCCAAACGAGGAAUAACACGG UUCAGUUCGACGUGUAUAUUUACUAUugaugauuauugaauguguuuuuuccauguugauguguuauagcuuugguauguguc acuuaguuucua