长链非编码RNA以及检测细胞及组织中该长链非编码RNA表达水平的引物对及试剂盒

摘要

本发明提供新的长链非编码RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)Lnc21q22.11序列、检测细胞和组织中的该长链非编码RNA表达水平的引物对及试剂盒。本发明首次鉴定出LncRNALnc21q22.11全长共1202bp，并应用特异性引物通过半定量RT-PCR首次在胃癌细胞及35对胃癌系及癌旁组织中以及结直肠癌细胞系和10对结直肠癌及癌旁组织中检测LncRNALnc21q22.11的表达水平，具有首创性。利用本发明所述试剂盒及特异性引物对胃癌组织中LncRNALnc21q22.11的表达的检测可作为胃癌及结直肠癌诊断、疗效观察、预后判断、病灶残留以及复发检测等的有效手段，而且操作简便、稳定性好、灵敏度高，具有深远的临床意义和推广性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的长链非编码RNA以及用于检测细胞及组织中 的该长链非编码RNA表达水平的引物及试剂盒。

背景技术

根据2012年全球肿瘤流行病统计数据(GLOBOCAN2012)，在 2012年大约有100万胃癌新发病例(952000,6.8％)，为全球第五位常 见恶性肿瘤；胃癌在全球致死癌症中为第三位(723000，8.8％)。多于 70％的胃癌病例发生在发展中国家，世界范围总数的50％胃癌发生在 东亚地区，主要在中国。胃癌在中国是发病率第二致死率第三的恶性 肿瘤(Ferlay J,Soerjomataram I,Ervik M,Dikshit R,Eser S,Mathers C, Rebelo M,Parkin DM,Forman D,Bray,F.

GLOBOCAN 2012v1.0,Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No.11[Internet].Lyon,France:International Agency for  Research on Cancer；2013.Available from:http://globocan.iarc.fr,accessed  on day/month/year.)胃癌的高发病率和高致死率严重威胁着人类的健康， 很多胃癌患者在确诊时便已处于进展期，目前手术切除是唯一根治胃 癌的手段。早期筛查和诊断成为胃癌预测的核心手段，同时胃镜检查 合并组织活检有助于对早期胃肿瘤类型的诊断，但由于胃镜检查的昂 贵使其无法成为胃癌的广泛筛查手段。当前所应用的筛查胃癌的肿瘤 标志物分析方法简单快速，但是其灵敏度和特异性低(Ming-Ming Tsai, Chia-Siu Wang,etc,Potential prognostic,diagnostic and therapeutic  markers for human gastric cancer,World J Gastroenterol 2014October 14； 20(38):13791-13803)。因此发现胃癌的早期诊断和治疗的有效方法具 有十分重要的意义。

结直肠癌在全球范围男性中为第三位常见癌症(746,000例,占总 数的10.0％)，在女性中为第二常见癌症(614,000例,占总数的9.2％)， 大约55％的病例发生在发达国家。结直肠癌的死亡率占总癌症死亡率 的8.5％，结直肠癌导致死亡多发生在欠发达地区，而且预后差(Ferlay  J,Soerjomataram I,Ervik M,Dikshit R,Eser S,Mathers C,Rebelo M, Parkin DM,Forman D,Bray,F.GLOBOCAN 2012v1.0,Cancer Incidence  and Mortality Worldwide:IARC CancerBase No.11[Internet].Lyon, France:International Agency for Research on Cancer；2013.Available from: http://globocan.iarc.fr,accessed on day/month/year.)。近些年来由于肿瘤 筛查的普及及诊断手段的发展，结直肠癌的新发病例及死亡病例均有 所下降，但是全球每年仍有约783000新的结直肠癌病例被诊断，大约 一半的结直肠癌患者会发生局部复发和远处转移。结直肠癌主要的治 疗手段为化疗，而进展期结直肠癌长久以来被认为更加耐受化疗 (MyoungSookKim,JunaLeeandDavidSidransky.DNAmethylationmarkersi  ncolorectalcancer.CancerMetastasisRev(2010)29:181–206)。因此结直肠癌 早期诊断标志物的发现以及有效的治疗的发现具有重要的意义。

人类基因组中只有不到2％的序列可以编码蛋白质，但70％～90％ 的人类基因组DNA是被转录的，其转录产物在过去被认为是“暗物质” 或“垃圾”，近年来人们发现这些转录产物可参与细胞的分裂、分化等 生命活动，有着重要的生物学功能。非编码RNA包括miRNA、piRNA 以及长链非编码RNA等许多类型，其中长链非编码RNA逐渐受到人 们的关注。长链非编码RNA即长度大于200nt且缺乏开放阅读框的 RNA，大多数长链非编码RNA具有polyA尾(Kung,J.T.,D.Colognori, and J.T.Lee,Long noncoding RNAs:past,present,and future.Genetics. 193(3):p.651-69,2013.Esteller,M.,Non-coding RNAs in human disease. Nat Rev Genet.12(12):p.861-74,2011.Mercer,T.R.,M.E.Dinger,and J.S. Mattick,Long non-coding RNAs:insights into functions.Nat Rev Genet. 10(3):p.155-9,2009.)。LncRNA可以在转录、翻译和转录后水平对基 因的表达进行调控(Gutschner,T.and S.Diederichs,The hallmarks of  cancer:a long non-coding RNA point of view.RNA Biol.9(6):p.703-19, 2012.)。

随着高通量测序技术的发展和RNA芯片技术的成熟，越来越多的 lncRNA被发现，但是大部分lncRNA的功能并不明确。有研究显示， lncRNA在细胞增殖、细胞周期、凋亡、侵袭迁移等生理和病理过程中 发挥重要作用(Maruyama,R.and H.Suzuki,Long noncoding RNA  involvement in cancer.BMB Rep.45(11):p.604-11,2012.)。与肿瘤相关 的研究比较成熟的lncRNA主要有MALAT1，PANDA，PCAT-1等。 MALAT1(Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1)在 多种恶性肿瘤如肝癌、子宫内膜间质肉瘤及肺癌中均表达上调，在转 移的肺癌中MALAT1的表达量是非转移肺癌的三倍，是评估早期肺 腺癌生存时间的独立预后指标(Ji,P.,et al.,MALAT-1,a novel  noncoding RNA,and thymosin beta4predict metastasis and survival in  early-stage non-small cell lung cancer.Oncogene.22(39):p.8031-41,2003. Yamada,K.,et al.,Phenotypic characterization of endometrial stromal  sarcoma of the uterus.Cancer Sci.97(2):p.106-12,2006.Lin,R.,et al.,A large noncoding RNA is a marker for murine hepatocellular carcinomas and  a spectrum of human carcinomas.Oncogene.26(6):p.851-8,2007.)。 PANDA在人类乳腺癌中高表达，是乳腺癌化疗耐药的标志物(Hung,T., et al.,Extensive and coordinated transcription of noncoding RNAs within  cell-cycle promoters.Nat Genet.43(7):p.621-9,2011)。PCAT1(prostate  cancer associated transcript-1)是在前列腺癌病例中通过高通量转录本测 序技术获得的在前列腺癌中特异性高表达的lncRNA，另一个lncRNA  PCA3(The prostate cancer antigen-3gene)已被美国食品和药品管理局 (FDA)于2012年批准用于前列腺癌的早期检测和预后评估(Prostate  cancer:Biomarkers PCA3and TMPRSS2-ERG:better together.Nat Rev  Urol,2014.Porpiglia,F.,et al.,The roles of multiparametric MRI, PCA3,and PHI:which is the best predictor of prostate cancer after a  negative biopsy？Results of a prospective study.J Urol,2014. Schroder,F.H.,et al.,Prostate cancer antigen 3:diagnostic outcomes in  men presenting with urinary prostate cancer antigen 3scores>/＝100. Urology.83(3):p.613-6,2014.)。但与胃癌发生发展相关的lncRNA的 研究尚少，lncRNA在胃癌中的作用机制以及临床价值尚有待深入研究。

发明内容

本发明所涉及的碱基序列如SEQ ID NO：1所示的长链非编码 RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)(以下记作Lnc21q22.11)是通 过对正常胃黏膜及3株胃癌细胞系(AGS，SGC7901，BGC823)所提 取的总RNA进行高通量转录本测序并通过生物信息学分析得到差异表 达的lncRNA中新的首次发现的在胃癌组织中表达降低的lncRNA。通 过3’RACE(rapid-amplification of cDNA ends)和5’RACE获得 Lnc21q22.11的全长序列为1202bp，位于人类21号染色体长臂。预实 验结果提示细胞Lnc21q22.11可能是胃癌中新的抑癌基因，在胃癌组织 中对Lnc21q22.11表达量的检测可能是一个崭新的肿瘤分子标记物。在 此基础上，本发明人应用半定量RT-PCR方法对大量胃癌组织标本以及 癌旁组织标本进行检测，以明确Lnc21q22.11在胃癌中的表达量的改变。

本发明首次通过5’RACE和3’RACE技术鉴定Lnc21q22.11全长 1202bp，全长序列如SEQ ID NO：1所示，即：

GCTCAACGGGTTGACGGCGCCCGACGGCCAGGTCCAGCAG GGGCGCCCCGCAGGTGGGGCCTGGCGGCCTTCACCTTCCGGATC CCCGACCCGGCGCGACCGGGAGCCGGCAGACTTTTGTCTAGGAG GGAAAACCCGAGCGCGGGGCCGGCCGCGACATCGCAGCATCCC AAAGAGCTTTTGGAATTTGGGTCACTCCCTTCTACCCCGACGTCA CACACTTACTGCTCCCGGCAGCGGAGGCTCCAGCGCCTGGCCGC GCACAAACCACGACTTCTACCGTCCTGCCGGGGAAAACTACAGG TCCCGAAATGCACCGCTACGTGCTCAGGCGCAGTGGGCCGGTGC CGCCGACGAGAGTGCACTACTCCGTGCGCAGGCGCAGTGGGCCC GGGCAGAAGACCTGGGGCGCGCTGCTCACTGCGCAGGCGCAGT GAGCCCAGGCGGGCAGCCCTGGCCAGCAGCTCTTGTCCCTGTGG CTGGAGGCTGAAGTCCACGTAGGCCCCGGCGGGGAGCCGCTGG GGTGTAGGCCGGGTGCCTTTGTCCAAGCCTGGCGCCACTGCCCA GACACTTTACTTCAAATTTGGCTTTATTTTCATCATTGATATTGATT AAAATGACATTCACTTGCCCGGAAAGTAAAAGAGGTCTTCAGCA CAAAATATTGCTCCAACAAGCAAGCATAAATCACTGAGATTGAAA TGTCATCTATCTTTATTGGCCAACCACATAATCTCCATGAAAATTCT CAACAGAGAGCAAGGAACTCACTTTCTTCTAAGCAAAGACAATT TGGATTTGCCTCGTGGCACTGGCATCTCTTCATGTCTGGACGTCA GATGTTAGCTTGGTGCCTTTCTCCCTTATCAGGGGGACATTTTGAA CCCAGCCGCACCAATGTTCTCATGGATGGTGGCCTTCGATTCTTCT AGATTCAAGATTTGGCTCTTGTACTTTTCCTGCCAGTCCTCTACAA TGTACTGGTGGTAGGGGTCATTGGAGTGTTCCCGTCTCTTGGATT TCACAGTGCTCACCAGGATGGCCACGATGATGAAAGAGAACATT CCAATCATCACCATGAGGTACAGGATGACATAGTAGAAGTTCTCA GCATCAACTTTGGCTTGGAGGGCCTCTTGCTCAGCTGTTGTGTTC TGGCGCCAATTGTCCATATAAGTAATAAAAATCCTTCGGAAGACG TC。

本发明还提供一种检测胃癌细胞和组织中的长链非编码RNA Lnc21q22.11表达水平的特异性半定量RT-PCR引物对，所述引物对的 上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，即： 5’-AATTTGGGTCACTCCCTTCTAC-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ  ID NO：3所示，即：5’-GTGAGTTCCTTGCTCTCTGTTG-3’。

本发明还提供一种用于检测胃癌细胞和组织及结直肠癌细胞和组 织的试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有上述引物对。

进一步地，本发明的试剂盒还可以含有内参GAPDH的半定量 RT-PCR引物，该内参GAPDH的半定量RT-PCR引物可以为本领域常 用的引物，例如其上游引物可以核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示， 即：5’-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物核苷酸序列可 以如SEQ ID NO：5所示，即：5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

该试剂盒还可以含有长链非编码RNA高表达细胞系BGC823提取 总RNA后逆转录并稀释的cDNA，作为检测上述引物对的可行性的阳 性模板。

进一步地，本发明的试剂盒还可以含有RT-PCR反应所需的下列成 分：5×PCR buffer，10mM dNTPs，Hot start Taq酶，ddH₂O。

本发明还提供一种用于检测胃癌和结直肠癌的RT-PCR反应体系， 以总体积25ul计，其包括：

(1)模板：2.5ul；

(2)浓度为10uM的上述引物对以及内参GAPDH的半定量 RT-PCR引物，其中，上游引物与下游引物各1ul；

(3)5×PCR buffer：5ul；

(4)10mM dNTPs:0.5ul；

(5)Hot start Taq酶：0.25ul；

(6)ddH₂O:14.75ul。

本发明具有如下优点：利用本发明所述引物对及试剂盒检测胃癌 组织和癌旁组织，与癌旁组织相比在胃癌组织中Lnc21q22.11表达降低 80％(28/35)，表明该lncRNA在胃癌中低表达，是胃癌中潜在的抑癌 基因，可作为胃癌的新的分子标志；同时利用本发明所述引物对及试 剂盒检测结直肠癌组织和癌旁组织，与癌旁组织相比在结直肠癌组织 中Lnc21q22.11表达降低70％(7/10)，表明该lncRNA在结直肠癌中 低表达，是结直肠癌中潜在的抑癌基因，可作为结直肠癌的新的分子 标志。本试剂盒首次选用Lnc21q22.11作为检测标志物，该lncRNA是 本发明人首次在胃癌和结直肠癌中筛选出的在胃癌组织和结直肠癌中 表达下降的lncRNA，具有首创性。因此，应用本发明提供的引物对及 试剂盒来检测胃癌或结直肠癌Lnc21q22.11的表达水平可作为胃癌或 结直肠癌诊断、疗效观察、预后判断、残留病灶及复发检测等的有力 手段，而且，操作简便，稳定性好，灵敏度高，具有深远的临床意义 和推广性。

附图说明

图1应用上述Lnc21q22.11半定量RT-PCR引物对在10株胃癌细 胞系中Lnc21q22.11的表达水平检测，GAPDH为内参，ddH₂O为体系 对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O检测的结果 为阴性，则体系结果可信，本体系扩增产物大小为587bp。

图2在5对配对的胃癌及癌旁组织中应用上述Lnc21q22.11半定 量RT-PCR引物对检测Lnc21q22.11的表达水平，GAPDH为内参， ddH₂O为体系对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O 检测的结果为阴性，则体系结果可信，本体系扩增产物大小为587bp。

图3在10株结直肠癌细胞系中，应用上述Lnc21q22.11半定量 RT-PCR引物对在10株胃癌细胞系中Lnc21q22.11的表达水平检测， GAPDH为内参，ddH₂O为体系对照，用以评估体系是否存在PCR产 物的污染，如ddH₂O检测的结果为阴性，则体系结果可信，本体系扩 增产物大小为587bp。

图4在5对配对的结直肠癌及癌旁组织中应用上述Lnc21q22.11 半定量RT-PCR引物对检测Lnc21q22.11的表达水平，GAPDH为内参， ddH₂O为体系对照，用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O 检测的结果为阴性，则体系结果可信，本体系扩增产物大小为587bp。

图5将Lnc21q22.11高表达的胃癌细胞系BGC823的cDNA与 ddH₂O按比例混合，应用上述Lnc21q22.11半定量RT-PCR引物对检测 Lnc21q22.11的表达水平，扩增条带如图所示。BGC823细胞cDNA含 量依次为100％，50％，5％，1％，0.5％，0％。ddH₂O为体系对照，用 以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O检测的结果为阴性， 则体系结果可信，本体系扩增产物大小为587bp。

具体实施方式

为更详细地了解本发明，以下通过实施例对本发明作进一步的说 明。

实施例一

1、模板的制备(总RNA的提取及逆转录过程)

RNA的制备：获取胃癌组织样本及对应的癌旁组织样本以及结直 肠癌组织样本和对应的癌旁组织样本，在本实施例中各取5个胃癌组 织样本GC1～GC5，5个与胃癌组织配对的癌旁组织样本GN1～GN5， 以及在本实施例中各取5个结直肠癌组织样本CRC1～CRC5，5个与结 直肠癌组织配对的癌旁组织样本CN1～CN5。

应用TRIZOL抽提的方法分别对上述样本进行总RNA的提取，紫 外分光光度仪测定吸光度(A)值确定其含量及纯度，1％琼脂糖凝胶 电泳鉴定RNA质量。

cDNA合成：将上述胃癌组织及对应的癌旁组织中和结直肠癌组织 及对应的癌旁组织所提取的总RNA5ug应用 SuperscriptIII-reversetranscriptasekit(Invitrogen)中的随即引物逆转录为 第一链cDNA，所得cDNA用加去离子水稀释至100ul，取其中的2.5ul cDNA用于25ul体系半定量RT-PCR。

2、半定量RT-PCR

以Lnc21q22.11半定量RT-PCR引物进行扩增的PCR反应体系， 以总体积25ul计，包括：

(1)模板(cDNA)：2.5ul；

(2)浓度为10uM的所述引物对，其中，上游引物与下游引物各 1ul；

上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，即： 5’-AATTTGGGTCACTCCCTTCTAC-3’：1ul，

下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，即： 5’-GTGAGTTCCTTGCTCTCTGTTG-3’：1ul；

(3)5×PCR buffer：5ul；

(4)10mM dNTPs:0.5ul；

(5)Hot start Taq酶：0.25ul；

(6)ddH₂O:14.75ul。

扩增条件：

Lnc21q22.11采用Stepdown PCR条件扩增，条件如下：

95℃5min

95℃ 30s→64℃ 30s→72℃ 60s，3个循环；

95℃ 30s→61℃ 30s→72℃ 60s，3个循环；

95℃ 30s→58℃ 30s→72℃ 60s，3个循环；

95℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，26个循环；

72℃ 5min.

产物大小：587bp

内参GAPDH的半定量RT-PCR 25ul体系包括：

(1)模板：2.5ul；

(2)半定量RT-PCR引物(10pmol/ul)：

上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，即：5’ -GACCACAGTCCATGCCATCAC-3’：1ul，

下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，即：5’ -GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’：1ul；

(3)5×PCR buffer：5ul；

(4)10mM dNTPs:0.5ul；

(5)Hot start Taq酶：0.25ul；

(6)ddH₂O:14.75ul。

产物大小：454bp

扩增条件为：

反应条件:95℃5min；95℃30s→63℃30s→72℃45s，25个循环； 75℃5min，产物大小：454bp。

3.PCR反应产物的检测

PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪检测并照相。

4.结果

根据琼脂糖凝胶电泳PCR产物条带强弱判断胃癌组织及配对癌旁 组织中和结直肠癌组织及配对癌旁组织中Lnc21q22.11的表达量。在5 对胃癌组织和配对癌旁组织中，胃癌组织中Lnc21q22.11的表达量低于 配对癌旁组织(图2)在5对结直肠癌组织和配对癌旁组织中，其中3 对结直肠癌中Lnc21q22.11的表达量低于配对癌旁组织。其中GC为胃 癌组织，GN为配对的胃癌癌旁组织，CRC为结直肠癌组织，CN为配 对的结直肠癌癌旁组织，GAPDH为内参，ddH₂O为体系对照，用以评 估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O检测的结果为阴性，则体 系结果可信，本体系扩增产物大小为587bp。

实施例二：临床标本检测

(1)取35对配对的胃癌组织和癌旁组织，进行Lnc21q22.11的半 定量RT-PCR扩增，模板制备、PCR扩增体系及条件、扩增产物的检 测均与实施一中的相同，检测结果(表达水平为互相配对的胃癌组织 与癌旁组织相比的相对水平)请见下表1：

表1

(2)取10对配对的结直肠癌组织和癌旁组织，进行Lnc21q22.11 的半定量RT-PCR扩增，模板制备、PCR扩增体系及条件、扩增产物 的检测均与实施一中的相同，检测结果(表达水平为互相配对的结直 肠癌组织与癌旁组织相比的相对水平)请见下表2：

表2

实施例三：敏感度实验

将Lnc21q22.11高表达的胃癌细胞系BGC823的cDNA与ddH₂O 按比例混合，应用上述Lnc21q22.11半定量RT-PCR引物对检测 Lnc21q22.11的表达水平，扩增条带如图5所示。BGC823细胞cDNA 含量依次为100％，50％，5％，1％，0.5％，0％。ddH₂O为体系对照， 用以评估体系是否存在PCR产物的污染，如ddH₂O检测的结果为阴性， 则体系结果可信，本体系扩增产物大小为587bp。

图5的结果显示：用本发明中的Lnc21q22.11的特异性引物对及反 应体系、条件检测细胞Lnc21q22.11表达，其灵敏度可达到1％，灵敏 度高。

实施例四：检测胃癌及结直肠癌细胞中Lnc21q22.11表达的试剂盒 组成

检测胃癌肿瘤细胞的试剂盒包括以下成分，其中一次半定量 RT-PCR的用量为：

1、浓度为10pmol/ul的Lnc21q22.11的RT-PCR引物对：上游引物 核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 3所示，各为1ul。

2、浓度为10pmol/ul的GAPDH的RT-PCR引物：上游引物核苷 酸序列如SEQ ID NO：4所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5 所示，各为1ul。

3、反应体系总2份，分别配合Lnc21q22.11RT-PCR引物对和 GAPDH RT-PCR引物试用，每份反应体系包括：5×PCR buffer,10mM dNTPs,Hot start Taq酶,ddH₂O。

一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次半定量RT-PCR的用量， 如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。

为防止出现半定量RT-PCR扩增产物的假阳性和假阴性，试剂盒还 包括以下几项组成：

(1)阳性对照PCR模板：高表达Lnc21q22.11的正常胃组织提取 总RNA后逆转录并稀释的cDNA，进行一次RT-PCR的用量为：2.5ul。

(2)阴性的体系对照：ddH₂O，用以评估体系是否存在PCR产物 的污染，如ddH₂O检测的结果为阴性，则体系结果可信。