一个特异响应渗透胁迫信号的启动子及应用

摘要

本发明发现了一个可以特异响应渗透胁迫信号进而激活目的基因表达的启动子序列。通过构建含该启动子的融合表达载体，并将表达载体分别转至固氮施氏假单胞菌以及大肠杆菌、苏云金芽孢杆菌及谷氨酸棒状杆菌3株工业微生物发酵菌株中，得到四株重组表达菌株。实验证实，与非胁迫条件相比，在渗透胁迫条件下，本发明的启动子在四种菌中都能够特异且高效启动目的基因的表达。因此该启动子在微生物发酵及基因工程领域具有应用价值。

说明书

技术领域：

本发明涉及一个能够特异响应渗透胁迫信号的启动子序列。本发明还涉及该启动子在 发酵工业微生物菌株遗传改造、提高发酵效率方面的应用。

背景技术：

高密度培养基因工程菌的表达产物，是提高微生物产量和目的基因表达产物浓度的有 效手段。因为利用普通浓度进行发酵时，表达产物量在菌体内和发酵液中的浓度比较低， 难以获得理想的生产效率和经济效益。但是，高密度培养造成了高渗透胁迫的环境。因为， 高密度的生物量需要投入几倍的基质，而高浓度的底物和产物形成的高渗透胁迫是影响微 生物生理功能充分发挥的最为重要的关键因素，将会导致发酵过程产物浓度和生产强度无 法进一步提高。

因此，发现能够特异响应渗透胁迫信号的启动子序列，并将其用于发酵工业微生物菌 株遗传改造，以增强微生物对渗透胁迫环境的响应效率与适应能力，有效消除由于渗透压 增高引起的抑制是高密度培养需要解决的问题。

许多细菌非编码RNA在细胞应激反应过程中能够高效表达，进而在细菌的胁迫应答反 应系统中发挥着重要的调节作用。例如，nfiS基因是可转录的有功能性的非编码RNA基因， 本申请人以往的研究显示该基因在提高菌株氧化胁迫抗性和盐胁迫抗性方面具有调节功 能(专利申请号：201410262604.3)。但现有技术并未发现nfiS基因的启动子作为功能元件 在特异响应渗透胁迫信号方面的功能。

发明内容：

本发明的目的是得到一个能够特异响应渗透胁迫信号的启动子序列，在渗透胁迫条件 下该启动子能够有效启动目的基因的翻译，以应用于微生物工业发酵菌株的遗传改造。

本发明首次发现了非编码RNA nfiS基因具有特异响应渗透胁迫信号的功能，体外表达 分析表明，该非编码RNA能够特异的响应山梨醇渗透胁迫信号(图1)。

本发明是通过以下工作得到上述启动子序列，并证实其功能：

1、分析和确定nfiS基因启动子

通过5'-RACE实验确定nfiS的转录起始位点和方向。结果表明nfiS的转录起始位点始于 一个腺嘌呤(A)，确定从该转录起始位点起上游153bp的基因区域为nfiS基因的启动子， 命名为pnfiS(图2)，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

2、构建nfiS基因启动子pnfiS融合表达载体，并分别转入四种不同细菌，获得四种重 组表达菌株

(1)构建pnfiS融合表达载体

首先进行PCR扩增，获得完整的启动子片段pnfiS，然后将克隆片段进行BamHI和HindIII 双酶切，插入到启动子表达载体pGD926的多克隆位点处即报告基因lacZ前，获得本发明启 动子与lacZ基因的融合表达载体pnifS-lacZ(图3)；

(2)将该表达载体分别转入四种菌中：

固氮施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、大肠杆菌(Escherich coli)、苏云金芽孢杆 菌(Bacillus thuringiensis)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)

(3)获得四种重组表达菌株：

P.stutzeri(pnfiS-lacZ)；E.coli(pnfiS-lacZ)；B.thuringiensis(pnfiS-lacZ)；C.glutamicum (pnfiS-lacZ)。

3、pnfiS对渗透胁迫信号的响应的验证实验

分别将上述四种重组表达菌株加入不同浓度的高渗透性山梨醇溶液中，测定在诱导条 件下重组菌中lacZ基因编码产物β-半乳糖苷酶的酶活。在四株重组菌中，山梨醇均能够激 活本发明启动子的表达，进而启动lacZ基因的有效翻译。

本发明的有益效果

实验证实，在渗透胁迫条件下，本发明所述启动子无论是在假单胞菌中还是3株工业 微生物发酵菌株中都能够特异、高效的启动目的基因的表达。

本发明的启动子序列可以用于不同细菌中异源基因的有效表达，因此可应用于微生物 发酵工程菌株的遗传改造、提高发酵目的产物产量等方面。

附图说明

图1：非编码RNA nfiS对不同胁迫信号响应的分析。

图中纵坐标表示非编码RNA基因nfiS在mRNA水平上的相对表达量，横坐标代表 P.stutzeri A1501菌株不同诱导条件。其中黑色柱状图代表正常LB培养基条件下非编码 RNA nfiS基因的表达量；波浪柱状图代表300mM Sorbitol(山梨醇)胁迫条件下非编 码RNA nfiS基因的表达量；网格柱状图代表0.05％SDS(sodium dodecyl sulfate,十二 烷基硫酸钠)胁迫条件下非编码RNA nfiS基因的表达量。

图2：固氮施氏假单胞菌A1501中非编码RNA nfiS基因的启动子分析。

图中nfiS基因的转录起始位点用下划线表示，转录方向用箭头表示。启动子序列用黑 色粗体表示。

图3：启动子pnfiS与目的基因融合表达示意图。

图中基因转录方向用箭头表示，其中a图表示pnfiS与报告基因lacZ融合表达示意图， 启动子用pnfiS表示，插入位点为B(BamHI)和H(HindШ)，报告基因用lacZ表示；图中 b图表示pnfiS与其他目的基因融合表达模式图，其中启动子用pnfiS表示，目的基因用target  gene表示。

序列信息

非编码RNA(nfiS)编码基因的启动子PnfiS核苷酸序列SEQ ID NO:1

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本 发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域 技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York:Cold  Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1非编码RNA nfiS对胁迫信号的响应

(1)将A1501菌在LB液体培养基中活化，30℃过夜培养；

(2)次日转接至LB培养基中30℃培养至OD₆₀₀≈0.6；

(3)首先各取1ml菌体，作为对照，然后再各取1ml菌体加入终浓度为0.3M山梨醇 或0.05％SDS，37℃，200rpm摇床培养60min；

(4)8000rpm离心5min，收集菌体；

(5)采用Promega大量提取RNA试剂盒Z3741提取细菌总RNA，将使用量相同的样品 RNA进行单链DNA(cDNA)反转；

(6)通过qRT-PCR方法对nfiS基因在不同胁迫条件下的表达水平进行了分析，发现山 梨醇胁迫条件下nfiS的转录水平显著提高，SDS胁迫条件下nfiS的转录水平没有显著变 化，表明nfiS能够特异的感应山梨醇渗透胁迫信号(图1)。

实施例2nfiS基因启动子分析

采用Invitrogen公司的5'-RACE试剂盒(5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA  Ends,Version 2.0)。具体步骤如下：

(1)提取总RNA

(2)合成第一条cDNA链

a、加如下组分于一0.5ml离心管(或PCR管)中，混匀

GSP1L/R...................................................................2.5pmoles(～10to 25ng)

DEPC-treated water.....................sufficient for a final volume of 15.5μl (or sterile,distilled water)

b、70℃孵育10min，冰浴1min，短暂离心后依次加入下列组分

10X PCR buffer.......................................................................2.5μl

25mM MgCl₂...........................................................................2.5μl

10mM dNTP mix........................................................................1μl

0.1M DTT.................................................................................2.5μl

final volume.............................................................................8.5μl

The final volume of step 1and 2is 24μl.

c、轻轻混匀，短暂离心，42℃孵育1min

d、加1μl Super Script^TM II RT，轻轻混匀，42℃孵育50min

反应体系最终组成如下:

20mM Tris-HCl(pH 8.4)

50mM KCl

2.5mM MgCl2

10mM DTT

100nM cDNA primer(GSP1)

400μM each dATP,dCTP,dGTP,dTTP

1-5μg(～40ng/μl)RNA

200units SuperScript^TMII RT

e、70℃，15min终止反应

f、离心10-20s后将反应体系至于37℃下

g、加1μl of RNase mix，轻柔充分混匀，37℃孵育30min

h、短暂离心聚集反应液，置冰上

(3)S.N.A.P柱纯化回收cDNA

a、室温下，binding solution平衡柱子

b、每份待纯样品分装～100μl DEPC-treated water，65℃预热备用

c、加120μl binding solution(6M NaI)于the first strand reaction中

d、将cDNA/NaI solution转至S.N.A.P柱，13,000x g离心20s

e、取出离心柱，将离心液转至一小离心管中保存，知道确保成功回收到cDNA。把 纯化柱再放回收集管中。

f、加0.4ml(4℃预冷的)1x washing buffer于离心柱中13,000x g离心20s倒掉离心液， 如此再重复洗三次

g、加400μl(4℃预冷的)70％乙醇于离心柱中13,000x g离心20s倒掉离心液，洗两次

h、13,000x g离心1min除去残余乙醇

i、将纯化柱转至一新回收管中，加入50μl 65℃预热DEPC-treated water 13,000x g离心 20s收集洗脱出的cDNA

(4)cDNA加尾

a、在一PCR管中加入以下组分，并轻轻混匀

DEPC-treated water..............................................................6.5μl

5X tailing buffer.....................................................................5.0μl

2mM dCTP.............................................................................2.5μl

S.N.A.P.-purified cDNA sample.........................................10.0μl

final volume............................................................................24.0μl

b、94℃加热2-3min，置冰上1min，短暂离心后冰上放置

c、加1μl TdT轻柔混匀，37℃反应10min

d、65℃，10min失活TdT终止反应，短暂离心后置冰上

(5)PCR扩增

a、将下列组分加入到冰上放置的PCR管中

ddH₂0.................................................................................................31.5μl

10X PCR buffer[200mMTris-HCl(pH 8.4),

500mM KCl].......................................................................................5.0μl

25mM MgCl2......................................................................................3.0μl

10mM dNTP mix................................................................................1.0μl

nested GSP2R/L(prepared as 10μM solution)................................2.0μl

Abridged Anchor Primer(AAP)(10μM)...........................................2.0μl

dC-tailedcDNA...................................................................................5.0μl

final volume......................................................................................49.5μl

b、随后立即加0.5μl Taq DNA polymerase(5units/μl)，混匀

c、PCR扩增

d、取5-20μl 5'RACE产物进行琼脂糖凝胶电泳常规分析

(6)PCR产物纯化及测序分析

以AAP和GSP2R/L为引物进行第一轮的PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测表明本实 验以AAP和GSP2L为引物扩增获得了预期大小为～200bp的目的片段，将目的片段切胶回 收进行序列测序，将测序获得的序列通过与A1501菌基因组中的nfiS序列进行比对分析最 终确定nfiS的转录起始位点和方向。

本实验所用引物如下：

                 GSP1L：5'-CTGGCTCGCCAGCCTGGCACTGC-3'

                 GSP1R：5'-CGGCACAGCAGCAGCAAG-3'

Abridged Anchor Primer(AAP)：5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG-3'

                   GSP2L：5'-AGCCTGGCACTGCTGATCC-3'

                   GSP2R：5'-ATCCCGCCGTGCGCGCCATG-3'

实施例3启动子pnfiS融合表达载体的构建(图3)

(1)nfiS基因启动子片段的PCR扩增：以A1501菌基因组为模板，利用引物pnfiSF和 pnfiSR进行PCR扩增获得长度约为150bp的启动子pnfiS的片段；

(2)nfiS基因启动子表达载体的构建：将PCR扩增获得的nfiS基因启动子片段进行 HindШ和BamHI双酶切后，连入启动子检测载体pGD926上，挑取阳性克隆提取质粒，酶切 和PCR验证后得到lacZ融合载体pnfiS-lacZ。

(3)重组表达菌株的获得：将构建的启动子pnfiS融合表达载体分别通过三亲结合方式 导入P.stutzeri或电激转入E.coli、B.thuringiensis和C.glutamicum中，通过抗性(四环素 抗性)筛选和PCR验证获得四株重组表达菌株。

实施例4四种重组菌株β-半乳糖苷酶活性分析

(1)实验目的：

验证四种重组表达菌株中pnfiS对渗透胁迫信号的响应

(2)实验材料和仪器：

质粒及菌株：启动子表达载体：pnifS-lacZ；重组表达菌株：E.coli(pnfiS-lacZ)、B. thuringiensis(pnfiS-lacZ)、C.glutamicum(pnfiS-lacZ)和P.stutzeri(pnfiS-lacZ)

实验仪器：紫外分光光度计为岛津UV-160A型

(3)实验方法

E.coli、B.thuringiensis、C.glutamicum或P.stutzeri中pnfiS-lacZ融合表达的β-半乳糖 苷酶活性测定的方法如下：

(1)分别挑取四株重组菌株单菌落，接种在含四环素的LB液体培养基中培养，其中E. coli(pnfiS-lacZ)培养温度为37℃，其余三株重组菌株的培养温度为30℃，第二天按照2％转 接量接种于LB液体培养基中，测菌液OD₆₀₀值，直到OD₆₀₀值达到0.6以上,分别加入300 mM、500mM、700mM和1000m M山梨醇，诱导4小时，其中以无诱导物作为阴性对照；

(2)取适量菌液，4℃，5,000rpm离心5min，弃上清，用无菌水洗两次，弃上清。按 需要重新悬浮菌体；

(3)菌体悬浮液与bufferZ混合，使总体积为1ml，加入2-3滴氯仿，混匀。开盖于37℃ 保温40min；

(4)转入30℃保温5min，之后加入200μl(4.0mg/ml)邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷 (ONPG)，混匀后30℃继续保温，开始反应，记录反应起始时；

(5)待样品出现黄色，再加入500μl 1mol/l的Na₂CO₃终止反应，记录反应终止时间，样 品放冰上待测。

(6)用紫外分光光度计分别测定OD₄₂₀和OD₅₅₀值。

(7)按照以下公式计算β-半乳糖苷酶活性值

β-Galactosidase Units＝1000×(OD₄₂₀-1.75×OD₅₅₀)/(T×V×OD₆₀₀)。

以上每个实验均进行平行实验三次，所得到的结果是计算了三次独立实验的平均误差 的β-半乳糖苷酶活性值。

4、实验结果

1)在四株重组菌中，各实验浓度的山梨醇均能够激活本发明启动子的表达，进而 驱动lacZ基因的有效翻译；

2)诱导最高活性的浓度对于不同菌有所不同

例如重组菌E.coli(pnfiS-lacZ)中，在700mM山梨醇诱导下β-半乳糖苷酶的活性最高 (186±25.72Miller Units)；

而在P.stutzeri(pnfiS-lacZ)中，本发明启动子在500mM山梨醇诱导下活性最高 (179±20.5Miller Units)。

以下表1是本发明启动子与lacZ基因融合表达载体pnfiS-lacZ分别在E.coli、B. thuringiensis、C.glutamicum或P.stutzeri中的β-半乳糖苷酶活性测定。

表中所列实验结果数据的误差是三次独立实验的平均误差，以0mM山梨醇作为对照， 山梨醇的诱导浓度分别为300mM，500mM，700mM和1000mM。

具体数据如表1所示：

表1重组表达载体在四种重组表达菌株不同浓度渗透胁迫下的活性测定

5、结论

在高渗透胁迫条件下，本发明发现的启动子无论是在假单胞菌中还是3株工业微生物 发酵菌株中都能够特异、高效地启动目的基因的表达。