一种保持角膜上皮状细胞层透明度的细胞株

摘要

本发明涉及一种保持角膜上皮状细胞层透明度的细胞株，称为小鼠胚胎细胞RMD6，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C201409。本发明还涉及包含该细胞株的细胞培养物以及培养悬液。本发明还描述了小鼠胚胎细胞RMD6的制备方法及其在药剂筛选中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种保持角膜上皮状细胞层透明度的细胞株。 

背景技术

角膜处于眼睛的最外侧，也就是眼珠前端位置的透明膜。因为是直接和外界接触的组织，所以也是最容易受到热、化学腐蚀等的伤害，用来生产角膜上皮的干细胞会因为某种损伤而消失。类似这类的角膜上皮干细胞病症，现在的技术是很难治愈的，如果要彻底治疗，就必须要给已失去了干细胞的角膜上皮提供干细胞。另一方面，关于角膜移植手术，由于角膜提供的人数较少，和等待移植的患者人数相比较，提供的人数是远远不足的。另外在角膜移植的时候，为了防止出现排异而使用免疫抑制剂造成术后的一些合并症也是比较容易发生的问题。 

为了弥补角膜捐献者过少这个问题，除了异体角膜，还可以使用自体角膜进行自体移植，自体角膜培养移植。另外，双眼都有疾患的情况，可以使用表皮或口腔粘膜代替角膜上皮进行自体表皮培养移植或者自体口腔粘膜培养移植。另外，当使用培养角膜，培养表皮，培养口腔粘膜等对角膜上皮状细胞层进行角膜上皮治疗时，角膜上皮状细胞层的透明度是非常重要的。但是，以上所描述的使用上皮系细胞培养来制作角膜上皮状细胞层时，大多数都使用Swiss3T3作为滋养层细胞，但Swiss3T3是会形成色素沉淀的，因此发明者们成功的发明了可以维持透明度的新细胞株。 

为了防止上皮系细胞的色素沉淀，抑制有色素生产性能的细胞增殖，抑制生产色素的活性，抑制从上皮系细胞取得色素，这些是至关重要的。 

针对上述问题，本发明提供了一种新的抑制上皮系细胞色素形成的细胞株。出人意料的是，在该细胞株的存在下，提供了透明度高的角膜上皮状细胞层。因而使得针对角膜上皮干细胞衰竭症等的角膜上皮疾患提供大面积均匀且 透明的角膜替代品成为可能。 

发明内容

本发明的发明者经过大量研究发现，特定的细胞对上皮样细胞层的色素沉淀有着显著的抑制效果。 

在本发明的一方面，提供了一种保持角膜上皮状细胞层透明度的细胞株，细胞株名称为小鼠胚胎细胞RMD6，保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：C201409。保藏日期为2014年1月7日。 

在本发明的另一方面，提供了一种细胞培养物，其包含本发明的小鼠胚胎细胞RMD6以及上皮系细胞。 

在本发明的一个实施方式中，所述上皮系细胞的生物来源选自：小鼠、大鼠、猪、牛、猴子和人。 

在本发明的一个实施方式中，所述RMD6细胞株作为滋养层细胞，抑制上皮系细胞的色素产生。 

在本发明的另一方面，提供了一种培养悬液，其包含本发明的小鼠胚胎细胞RMD6。 

在本发明的另一方面，提供了一种培养悬液，其包含本发明的小鼠胚胎细胞RMD6的细胞提取物。 

在本发明的另一方面，提供了一种小鼠胚胎细胞RMD6的制备方法，所述方法包括以下步骤： 

a.取小鼠皮肤片，进行细胞株的克隆过程； 

b.将上述克隆的细胞株与上皮系细胞共培养的培养过程； 

c.评价上皮系细胞的色素生产能力，选定能够保持角膜上皮状细胞层透明度的细胞株。 

在本发明的另一方面，提供了本发明所述细胞培养物在进行药剂筛选中的应用，其中所述细胞培养物包含本发明的小鼠胚胎细胞RMD6以及上皮系细胞。 

在本发明的另一方面，提供了本发明所述细胞培养物在制备用于治疗角膜上皮干细胞衰竭症的药物中的应用，其中所述细胞培养物包含本发明的小鼠胚胎细胞RMD6以及上皮系细胞。 

发明详述 

本发明的细胞株能够有效抑制上皮状细胞层的色素沉淀的作用，提供了合适的角膜上皮状细胞层。因此，可以提供用于角膜上皮疾患的治疗所需的培养组合物并用于药物的筛选。 

本发明的株化细胞能够抑制上皮状细胞层的色素沉淀。这里所指的上皮状细胞层是由角膜上皮细胞，表皮角质细胞，口腔粘膜细胞等的上皮系细胞组成的。所谓的角膜上皮细胞是指构成角膜上皮的上皮系细胞。表皮角质细胞指的是构成表皮的上皮系细胞。另外，口腔粘膜上皮细胞指的是构成口腔的上皮系细胞。当上皮状细胞层中混入了有产生色素性能的细胞时，本发明的株化细胞能很好的抑制生产色素细胞的色素生产能力。另外还能抑制由生产色素细胞产出的色素进入上皮系细胞。本发明的“抑制色素沉淀的能力”可能是上述的某一种，也可能是2种作用同时存在。本发明的上皮系细胞不论是从那个部位由来，从角膜上皮基底层、表皮基底层、口腔粘膜基底层都是可以采取的。 

上述上皮系细胞是分裂次数有限的正常细胞，比如达到50～80次的分裂次数后就到达了细胞寿命。本发明对于上皮系细胞的生物种类来源没有特别的规定，优选使用小鼠、大鼠、猪、牛等哺乳类，或者是人、猴子等灵长类，最优选使用人来源的细胞。例如，上皮系细胞可以是已经建立的市售上皮系细胞，也可以是从患者自身提取的上皮系细胞。 

细胞株化使得上皮系细胞即使超过了分裂次数（例如：50～80次），也可以继续传代培养。这类的细胞株通过传代，即使细胞正常死亡或超过传代数，也可以通过选择可以增殖的细胞来达到继续培养。 

另外，遗传因子导入的细胞或者使用遗传因子技术制作，也能够从动物种中取得株化细胞。被导入的遗传因子并没有特殊的限定，比如，SV40病毒的LargeT抗原遗传因子，ras遗传因子，c-myc遗传因子，端粒酶遗传因子等。给细胞进行遗传因子导入的方法有显微注射法，电脉冲法，脂质体法等，这些都是被大家所熟知的公知技术。 

制备本发明细胞株的细胞的生物种类来源没有特别限制，可以包括大鼠，小鼠，猪，牛，人，猴子等哺乳类，优选使用大鼠、小鼠等啮齿类，最优选使用大鼠来源的细胞进行细胞株化。 

本发明的株化细胞能够抑制上皮状细胞层的色素沉淀。株化细胞对于上皮状细胞层的色素沉淀的抑制作用分为2种。1个是，抑制每个生产色素细胞的色素产生能力，提高上皮状细胞层的透明度。另一个降低生产色素细胞的细胞数量。不论是那种方法，结果都可以通过目测来确认上皮状细胞层的透明度有显著的提高。本发明中“保持上皮状细胞层的透明度”可能是上述的一种情况造成的，也可能是2种情况同时起到作用。 

本发明的株化细胞抑制上皮状细胞的色素沉淀的方式，例如：和上皮系细胞共培养的方法，株化细胞的培养悬液提供给上皮系细胞培养物的方法，株化细胞提取物提供给上皮系细胞培养物等的方法，其中比较好的方法是和上皮系细胞共培养。共培养的方法没有特定的规定，比如本发明的株化细胞和上皮系细胞混合培养的方法，本发明的株化细胞作为滋养层细胞培养上皮系细胞的方法。其中，株化细胞作为滋养层细胞配制物被认为是比较好的方法之一。 

这里所指的滋养层细胞是用于支持其他细胞的细胞（本发明的上皮系细胞）。另外，滋养层细胞配制物是指在培养容器中培养至细胞汇合或大部分汇合的片状的培养物。所谓的细胞汇合或大部分汇合指的是通过光学显微镜观察培养容器的基地，细胞的面积占到70～100%的一种状态。另外所谓的皮状培养物是指细胞堆积了1～5层的以2维方式连接展开得培养物。另外，滋养层细胞培养物即使使用丝裂霉素C，X照射来抑制细胞的增殖也是没有问题的。 

下面将描述本发明细胞株的具体制备过程： 

（1）本发明细胞株的克隆过程 

所谓的细胞株克隆过程，就是取得完全相同的遗传背景的细胞株集合的过程。从原代到传代培养所建立的细胞株，一般会有好几种遗传背景。所以想要维持稳定平衡是很困难的。所以在这里必须以一个细胞为起源来建立细胞集合，得到同质量的具有稳定特性的细胞集合。作为操作方法，例如可以将细胞株的分散液稀释到临界点，也存在单一的细胞分离方法。作为克隆的细胞株，可以是由原代细胞形成的细胞株，也可以是由已细胞株化的STO细胞或3T3细胞派生出来的细胞株。 

（2）培养含有细胞株和上皮系细胞的细胞培养组合物的过程 

所谓的培养含有细胞株和上皮系细胞一起的细胞培养组合物的过程是指将本发明细胞株克隆过程（1）中取得的单一遗传背景的细胞株和上皮系细胞 一起培养的过程。这里所谓的细胞培养组合物指的是含有本发明细胞株和上皮系细胞的细胞培养物。相关的细胞培养组合物既可以是由细胞株以及上皮系细胞构成，也可以包含其他细胞。所谓的其他细胞，包括例如表皮角质细胞，成纤维细胞等。通过细胞株和上皮系细胞共培养，可以观察被单独分离的细胞株对上皮系细胞会产生什么影响。共培养的方法包括例如：将含有细胞株和上皮系细胞的细胞悬液接种到培养容器；或者让单独分离的细胞株形成滋养层细胞培养物，然后在这个上面接种含有上皮系细胞的细胞悬浊液；以及类似的方法。具体的操作方式，例如单独分离的细胞株形成滋养层细胞培养物后，在这个上面接种含有上皮系细胞的皮肤片经过消化酶处理的细胞悬液，但这并不是唯一的方法。 

（3）上皮状细胞层的透明度的评价过程 

所谓上皮状细胞层的透明度的评价过程，由过程（2）共培养后得到的包含细胞株和上皮系细胞的培养组合物，对这个培养组合物进行上皮状细胞层的透明度评价的过程。作为上皮状细胞层的透明度评价的方法，1通过目测观察法2将上皮状细胞层装入透明的容器，放到打印了字的白色地板上，上皮状细胞层和文字重叠，进行透明度的判断。上皮系细胞的色素生产能力的评价，过程（2）中细胞株对于上皮系细胞的影响，在充分的培养后进行评价。培养的时间没有特定的规定，一般1～20天，较理想的是7～14天的培养，然后对上皮系细胞的沉淀能力进行评价。具体的操作方式，将单独分离的细胞株作为滋养层细胞，接种含有上皮系细胞的皮肤片消化悬液，在7～14的培养后，将培养的上皮状细胞层和文字重叠，然后观测其透明度，但这并不是唯一的方法。 

通过过程（3）的操作，将上皮系细胞的色素产生能力最好的细胞株挑选出来。或者重复进行过程（1）至（3）的筛选，反复进行2次以上也是可以的。通过这个操作，就能取得本发明的细胞株。在一个具体的实施方式中，本发明的细胞株是细胞株RMD6。该细胞株作为以保藏号CCTCC NO:C201409保藏。 

另外，本发明也涉及此类细胞株衍生的细胞。所谓“衍生”，是指以这类细胞株为起源的意思。具体就是指使用遗传因子导入技术将这类细胞株改变了的细胞，本发明也包括从这类细胞株中被单独分离的亚种细胞株。 

本发明的细胞株，具体是可以通过和上皮系细胞共培养后，很好的抑制上皮系细胞的色素沉淀。关于本发明的细胞株的序列，虽然不清楚，但可以肯定本发明的细胞株含有有诱导作用的体液因素或者含有细胞黏附因子。不仅是作 为滋养层细胞培养物，也可作为细胞株和细胞培养基材的混合物，含有细胞株的细胞分散液等，含有本发明的细胞株的产物是本发明的操作形态。另外，从细胞株中得到的培养悬液，以及细胞提取物也是本发明的操作形态之一。 

本发明的细胞株，具体是可以通过和上皮系细胞共培养后，很好的抑制上皮系细胞的色素沉淀。虽然关于本发明的细胞株的序列不是很了解，但可以明确本发明的细胞株中含有诱导作用的液性因子以及细胞结合因子。不仅仅是滋养层配制物，细胞株和细胞培养基材的混合物，含细胞株的细胞分散液等，都属于本发明的实施条件。另外，从细胞株得到的培养悬液，以及细胞提取液也是本发明实施条件之一。 

由于本发明的细胞株能够很好的抑制上皮系细胞的色素沉淀，所以能够培养出透明度很高的上皮状细胞层。例：将含有上皮系细胞的细胞分散液接种到由本发明的细胞株形成的滋养层细胞配制物上，培养后形成培养组合物，将此培养物移植到因角膜上皮干细胞衰竭引起的角膜干细胞缺落的区域，从而使上皮状细胞层的色素形态大面积的恢复良好并保持正常的透明度。作为这个培养组合物的具体实施条件，就是将含有上皮系细胞的皮肤片消化液接种到由本发明的细胞株形成的滋养层细胞配制物上后培养，后面有培养得到的培养皮肤等的案例。 

关于包含本发明的细胞株的滋养层细胞配制物和上皮系细胞培养组合物的制作方法没有特定的规定，通过以下方法能够很好的完成制作。 

以角膜上皮作为上皮系细胞源，从角膜上皮干细胞较富裕的区域采集2mm角。以表皮角质细胞作为上皮系细胞源，表皮组织采集10mm角。以口腔粘膜细胞为上皮系细胞源，口腔粘膜组织采集10毫米角。采集了的组织在培养之前，最好先用含有消化酶的培养液浸泡处理以下比较好。作为消化酶，有胰蛋白酶，胶原酶，中性蛋白酶等都可以使用。作为溶解消化酶的培养液，和初代培养时使用的无血清培养液相同的东西也是可以使用的，比如，Dulbecco’s MEM等都可以使用。 

由本发明的细胞株形成的滋养层细胞配制物，细胞株在培养液中达到80%～100%的汇合后，用丝裂霉素c或X线照射等进行抑制细胞增殖。细胞株的培养所使用的培养液没有特殊的规定，比如包含10%牛胎血清的Dulbecco’sMEM等都可以使用。 

将含有上皮系细胞以及表皮角质细胞的分散液接种到配制好的滋养层细 胞配制物上培养。作为比较理想的培养液中Ca²⁺浓度，一般在0.5～1.9mM，或者0.8～1.6mM之间，最理想的是1.4mM，所以可以使用含这些浓度的KGM培养液。该培养液中培养7～14天，最理想的培养的天数是5～12天后，细胞就形成多层的皮状培养组合物。 

在这个KGM的培养液中还可以添加胰岛素，KGF,EGE,FEF等的激素，成长因子。另外，一般用于细胞培养的培养液也是可以使用，比如：除了上述的KGM以外，DMEM(Dulbecco’s MEM),RPMI1640,F-10,F-12,MEM,Dulbecco’s MEM+10%FBS等。作为添加物，除了上述的以外，还可以有氢化可的松，转铁蛋白，孕甾酮，乙醇胺等。 

如果有双眼疾患，因为可以用于移植方面，所以得到的上皮系细胞通过传代培养很多细胞也是可以的。但是，过多的传代数会造成细胞的老化，比较理想的是使用在0～3代的传代细胞。关于细胞传代，使用普通的胰蛋白酶处理等的方法就可以。 

在滋养层细胞配制物上，用上述方法培养7～14天，理想天数5～12天后就能得到由上皮系细胞形成的培养组合物。 

通过培养后得到的培养组合物就是透明的上皮状细胞层。打印Times字体等的轮廓比较清晰的字体，然后将培养物和其重叠，然后目测观察其透明度，对其进行评价。 

本发明的培养组合物虽然没有规定动物的物种，但是对于角膜上皮干细胞衰竭症等的时候最思想的是人由来，特别是在构筑上皮状细胞时，上皮系细胞最好是自体，因为自体的上皮系细胞培养组成不会有排异性。 

由本发明的培养组合物中的上皮系细胞形成的上皮状细胞层，能够提供接近类似活体的环境。该条件可以通过HE染色等对其进行上皮系细胞培养组合物的染色，然后通过光学显微镜观察。该条件也是上皮状细胞层作为角膜上皮来使用的一个判断指标。 

本发明的培养组合物能够很好的适用于治疗角膜上皮干细胞衰竭症。还有，不仅是医疗用途，对于上皮系细胞药物，眼药水等的评价的时候也能够使用。比如：上述的培养组合物的培养的时候，在培养液中添加各种药剂，对上皮系细胞的透明度，氨基酸等的产生的效果进行评价，以此来对药物等进行筛选。 

附图简述 

图1显示了完成的细胞培养组合物。其中图1A显示了滋养层细胞RMD6存在下的细胞形态，图1B显示了在Swiss3T3细胞存在下的细胞形态，其中，Swiss3T3是市售获得的细胞，例如可以ATCC,CCL-92从http://www.atcc.org/Products/All/CCL-92.aspxhttp://www.atcc.org/Products/All/C CL-92.aspx购得。 

图2显示了上皮状细胞层的HE染色结果。采用的显微镜是OLYMPUS公司制造IX51,DP26显微摄影系统，焦距：x10倍。 

具体实施方案

以下是对于此项发明的表皮组织培养物以及用途和制造方法的实例展示以及具体说明，但是本发明并不局限于此。 

（1）RMD6细胞的选定 

小鼠皮肤片在10%FCS-DMEM（含有10%牛胎儿血清的Dulbecco’s）中进行培养，培养出成纤维细胞。将成纤维细胞进行30次以上的传代培养，得到细胞株。用10%FCS-DMEM对细胞株进行极限稀释，接种于96孔的滴定板上，得到细胞株的克隆。将细胞株的克隆扩大培养，接种在6孔培养皿，培养至100%一体化。将从人皮肤组织取得的角质细胞接种到滋养层细胞培养物上，培养10～30天后，目测确认有诱导菌落形成能力的细胞株的存在（诱导角质细胞和上皮细胞形成菌落）。选择菌落形成能力好的细胞株，选定RMD6。 

（2）滋养层细胞的制作 

RMD6接种到培养皿中，使用10%FCS-DMEM将其培养到100%细胞汇合。100%细胞汇合后，添加培养液将丝裂霉素C调制成4μg/ml，培养1.5～2个小时。将培养液去除，用DMEM清洗2次，换成10%FCS-DMEM继续培养1天。另外，使用3T3的小鼠细胞作为对照，调制方法相同。 

（3）皮肤样品采集以及细胞培养组合物的制作 

在实验者腰部使用70%酒精棉球进行灭菌，从患者身体采集组织片。采集的组织片浸泡在碘液中进行消毒，然后用PBS清洗。将组织片切碎，放入消化液中（消化液：TrypLE被PBS5倍稀释后）4℃环境下放置16～24个小时。常温30分钟搅拌，使用cell strainer过滤设备将残渣除去。形成的细胞悬液进行离心处理，回收细胞。然后关于残渣的处理，使用胶原蛋白酶（GIBCO公司）37℃环境3小时处理，然 后进行细胞回收。回收的细胞播撒到60mm培养皿中，使用KGM、放置于37℃5%二氧化碳培养箱中培养。培养10～20天，长满后再培养3～7天，培养组合物培养完成（图1）。作为对照，另外制作了一份没有使用滋养层细胞培养物的培养组合物。 

（4）HE染色 

对培养组成的外观进行评价后，进行HE染色，上皮细胞染色后，通过光学显微镜，观察被HE染色的上皮细胞的形状，观察堆积的细胞数量（参见图2）。 

结果表明，本发明的细胞株可以很好的抑制上皮细胞的色素沉着。因此，含有本发明的细胞株和上皮细胞的培养组合物对于角膜上皮衰竭等的治疗都非常有效，能够大面积的均匀的使角膜上皮组织再生。 

虽然本发明已经以较佳实施例揭示如上，但是其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围应当视所附的权利要求所界定的为准。