克鲁斯假丝酵母LSA及其在降解氨氮中的应用

摘要

本发明公开了克鲁斯假丝酵母LSA及其在降解氨氮中的应用。本发明提供的克鲁斯假丝酵母LSA，保藏登记号为CGMCC NO.10562。本发明还保护克鲁斯假丝酵母LSA的培养物。本发明还保护克鲁斯假丝酵母LSA的菌悬液。本发明还保护一种产品，其活性成分为克鲁斯假丝酵母LSA、所述培养物或所述菌悬液；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)降解氨氮；(b)降解水中的氨氮；(c)降解粪便中的氨氮；(d)降低粪便的氨气散发量。本发明提供的克鲁斯假丝酵母可应用于如下方面：(1)改善氨氮污染的水质问题；(2)用于畜禽舍内，改善舍内环境卫生；(3)作为鸡的饲料添加剂使用。

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株克鲁斯假丝酵母，以及该克鲁斯假丝酵母在降解氨氮中的应用。

背景技术

畜禽养殖过程中产生的废水和粪便在储存过程中会产生大量的恶臭气体，其中以氨气的危害最为明显，轻者诱导家禽、猪等动物呼吸道疾病的发生，引起动物应激反应，重者可引起中毒死亡。同时大量的氨气排放促进可入肺颗粒物(PM2.5)的形成，并扩散到大气中与一些酸性物质反应，形成铵盐气溶胶，导致生态系统富营养化和酸化。此外，含有高浓度氨氮的畜禽养殖废水如果处理不当，也会引起水体的富营养化。因此，治理养殖业生产过程中氨气和氨氮的排放对保护人类生态环境、改善动物健康和福利具有重要意义。

研究表明，畜禽养殖废水和粪便中氨氮和氨气的产生很大程度上依赖于其中微生物的代谢活动，使通过调控环境微生物群落的活动控制氨氮或氨气的生成成为可能。而现有的控制养殖场氨气污染的措施大都采用物理方法(如加强舍内通风、建造粪尿分离设施等)，运行成本高且因为没有根本消除氨氮和氨气对周边环境的排放，仍会造成二次污染，而采用微生物方法则能克服上述方法的缺陷，因此在治理畜牧养殖氨气和氨氮污染方面具有较高的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供克鲁斯假丝酵母LSA及其在降解氨氮中的应用。

本发明提供的克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)LSA，已于2015年02月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.10562。克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)LSA CGMCC NO.10562，简称克鲁斯假丝酵母LSA。

本发明还保护克鲁斯假丝酵母LSA的培养物。 

本发明还保护克鲁斯假丝酵母LSA的菌悬液。所述菌悬液具体可通过用无菌生理盐水重悬菌体得到。所述菌悬液中的菌浓度具体可为8.0×10⁸cfu/mL-9.0×10⁸cfu/mL。

本发明还保护克鲁斯假丝酵母LSA、所述培养物或所述菌悬液在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)降解氨氮；(b)降解水中的氨氮；(c)降解粪便中的氨氮；(d)降低粪便的氨气散发量。所述粪便可为畜禽 粪便，例如鸡粪。

本发明还保护一种产品，其活性成分为克鲁斯假丝酵母LSA、所述培养物或所述菌悬液；所述产品的功能为如下(a)或(b)或(c)或(d)：(a)降解氨氮；(b)降解水中的氨氮；(c)降解粪便中的氨氮；(d)降低粪便的氨气散发量。所述粪便可为畜禽粪便，例如鸡粪。

本发明还保护克鲁斯假丝酵母LSA、所述培养物或所述菌悬液在降解氨氮中的应用。所述降解氨氮具体可为降解水中的氨氮或降解粪便中的氨氮。所述粪便可为畜禽粪便，例如鸡粪。所述应用中，温度可为20-40℃，具体可为30℃。所述应用中，pH值可为3.0-7.0，具体可为7.0。所述应用中，具体可以采用葡萄糖作为克鲁斯假丝酵母LSA生长所需的碳源。所述应用中，克鲁斯假丝酵母LSA生长所需碳氮质量比可为10-40，具体可为20。

本发明还保护克鲁斯假丝酵母LSA、所述培养物或所述菌悬液在降低粪便的氨气散发量中的应用。所述粪便可为畜禽粪便，例如鸡粪。

本发明还保护一种降解氨氮的方法，包括如下步骤：将克鲁斯假丝酵母LSA、所述培养物或所述菌悬液与含有氨氮的样本混合，实现降解氨氮。

本发明还保护一种降低粪便的氨气散发量的方法，包括如下步骤：将克鲁斯假丝酵母LSA、所述培养物或所述菌悬液施加于粪便，从而降低粪便的氨气散发量。所述粪便可为畜禽粪便，例如鸡粪。

本发明还保护一种降低畜禽舍内的氨气浓度的方法，包括如下步骤：将克鲁斯假丝酵母LSA、所述培养物或所述菌悬液施加于畜禽舍内，从而降低畜禽舍内的氨气浓度。

本发明提供的克鲁斯假丝酵母，培养方法简单、生长速度快、能耐受高浓度的氨氮、环境适应性强、安全性高。本发明提供的克鲁斯假丝酵母可应用于如下方面：(1)由于其具有很强的氨氮降解能力，可用于改善氨氮污染的水质问题，适用于含高浓度氨氮的废水治理；(2)由于其可降低粪便氨气的散发量，可用于畜禽舍内，改善舍内环境卫生；(3)其生长条件接近鸡胃肠道的微环境，因此可作为鸡的饲料添加剂使用，可以提高饲料中氮素的利用率，在动物粪便中存活的菌体又能进一步减少氨气的散发量，从而达到改善舍内环境的作用。本发明具有较好的应用前景。

附图说明

图1为克鲁斯假丝酵母LSA的菌落图片。

图2为克鲁斯假丝酵母LSA的电镜图片。

图3为克鲁斯假丝酵母LSA降解高浓度氨氮的曲线图。

图4为温度(A)和pH(B)对克鲁斯假丝酵母LSA生长的影响。

图5不同碳源(A)和C/N(B)对克鲁斯假丝酵母LSA氨氮去除率的影响。

图6为克鲁斯假丝酵母LSA对家禽粪便氨气产生的控制效果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，用于制备各个培养基的水均为去离子水。以下实施例中用OD_600nm值表征菌体生长量。C/N即碳氮质量比，又称碳氮比。

YPD液体培养基：酵母膏10g、蛋白胨20g、葡萄糖20g，水1000mL，自然pH。

基础培养基：碳源、(NH₄)₂S0₄、NaCl 1.0g、K₂HP0₄·2H₂00.5g，MgS0₄·7H₂00.25g，微量元素溶液1.0ml，水1000mL，调pH7.2-7.4。(NH₄)₂S0₄为氮源。

微量元素溶液：EDTA 10.0g、ZnSO₄1.2g、CaCl₂1.5g、MnCl₂·4H₂O 1.0g、FeSO₄·H₂O2.0g、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.0g、CuSO₄·5H₂O 1g、CoCl₂·6H₂O 1.0g，水1000mL，调pH 7.2-7.4。

氨氮(NH₄⁺-N)含量的测定方法采用水杨酸-次氯酸盐光度法(GB7481—1987)。

实施例1、克鲁斯假丝酵母LSA的分离纯化及鉴定

一、克鲁斯假丝酵母LSA的分离纯化 

1、氨氮降解菌的富集

取20g鸡粪样品，接种于装有100ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中(瓶中加入灭菌玻璃珠)，30℃、150r/min振荡30min使菌胶团充分打散，静置20min。取上清液5ml，接种于装有100ml富集培养基的锥形瓶中，30℃、150r/min振荡培养2天，取1ml培养液再次接种于新的富集培养基中，如此反复连续富集10代。

2、氨氮降解菌的筛选、分离和纯化

吸取富集培养液1ml，经10^-1梯度稀释后，取200μl涂布于分离平板上，30℃培养24～72h。24h后开始观察菌的生长情况，选取生长快、菌落大、数量多的菌落采用三线法进行纯化。纯化3代后，分别进行4℃斜面保存。

将分离纯化后的供试菌株接种于活化培养基中，30℃振荡培养18-24h。然后按10％的接种量接种于无菌离心管中，4000r/min离心10min，弃上清液，用0.86％无菌生理盐水洗涤三次，最后用同体积的无菌生理盐水制成菌悬液，接种于50ml筛选培养基中，30℃、150r/min振荡培养24h，测定氨氮含量，筛选出一株降解效果最好的菌株，命名为LSA。

二、菌种的鉴定

1、形态观察 

将LSA菌株接种在YPD固体培养基平板上，观察菌落形态特征。LSA菌株的菌落 照片见图1，电镜照片见图2。LSA菌株呈点状，白色、不透明，边缘光滑，凸起，无光泽，菌株为卵圆形、易堆积。

2、生化鉴定 

采用生物梅里埃(biomerieux)Vitek32-YST鉴定卡片对LSA菌株进行生理生化鉴定，鉴定结果为Candida krusei。

3、分子生物学鉴定

对LSA菌株的18S rDNA进行扩增，将纯化后的PCR产物测序，测序结果如序列表的序列1所示。

综合形态鉴定、生化鉴定和分子生物学鉴定的结果，LSA菌株属于克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)。

克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)LSA，已于2015年2月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.10562。克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)LSA CGMCC NO.10562，简称克鲁斯假丝酵母LSA。

实施例2、克鲁斯假丝酵母LSA降解氨氮功能的研究

一、克鲁斯假丝酵母LSA对高浓度氨氮的降解特性研究

1、制备培养基甲

培养基甲：采用葡萄糖作为唯一碳源，在基础培养基的基础上调整碳源和(NH₄)₂S0₄的浓度，使氨氮浓度为1200mg/L，C/N为10，pH为7.0。

2、挑取克鲁斯假丝酵母LSA单克隆，接种于100mL YPD液体培养基中，30℃、150r/min振荡培养24-36h(使培养体系中的菌体浓度达到8.0-9.0×10⁸cfu/mL)，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。

3、取步骤2得到的菌体，用无菌生理盐水重悬，得到菌浓度为8.0×10⁸cfu/mL的菌悬液。

4、将0.1mL步骤3得到的菌悬液接种至80mL培养基甲，30℃、150r/min振荡培养，每隔12小时采样一次，测定培养体系中的氨氮浓度和培养体系的OD_600nm值。

结果见图3。接种后0-24小时，克鲁斯假丝酵母LSA快速生长，36h后达到高峰。与之相对应，培养体系中的氨氮浓度在0-36h内快速下降，36h以后氨氮浓度下降趋势逐渐变缓。结果表明：克鲁斯假丝酵母LSA能够很快适应新的环境，快速进入对数生长期，初期降解氨氮的能力强；高浓度的氨氮对菌株的生长并未产生抑制作用，当氨氮浓度为1000mg/L时，菌体含量最大可达到OD_600nm＝2.96。

二、温度和pH对菌株生长的影响

1、挑取克鲁斯假丝酵母LSA单克隆，接种于100mL YPD液体培养基中，30℃、150r/min振荡培养24-36h(使培养体系中的菌体浓度达到8.0-9.0×10⁸cfu/mL)，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。

2、取步骤1得到的菌体，用无菌生理盐水重悬，得到菌浓度为8.0×10⁸cfu/mL的菌悬液。

3、将0.8ml步骤2得到的菌悬液接种至80mL YPD液体培养基(pH7.0)，某一温度下150r/min振荡培养24h，然后检测OD_600nm值。采用的培养温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃或40℃。结果见图4A。在20-40℃的温度范围内，克鲁斯假丝酵母LSA的生长没有受到显著的影响。

4、将0.8ml步骤2得到的菌悬液接种至80ml YPD液体培养基(pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0或9.0)，30℃、150r/min振荡培养24h，然后检测OD_600nm值。结果见图4B。pH3-7的范围内，克鲁斯假丝酵母LSA能够保持良好的生长状态。碱性环境下，克鲁斯假丝酵母LSA的生长则受到一定的抑制作用。克鲁斯假丝酵母LSA较适宜在偏酸性环境下生长,且在生长发酵过程中产生有机酸。

结果表明，克鲁斯假丝酵母LSA具有较强的环境耐受性，其适宜的温度和pH生长条件，正好与鸡舍中的环境相适应，利于其生长，具有在舍内应用的潜力。克鲁斯假丝酵母LSA在pH为3的强酸环境下和40℃的温度下生长，此环境接近鸡胃肠道内的微环境，因此，克鲁斯假丝酵母LSA同时具有作为饲料添加剂的潜力。

三、碳源和C/N对菌株氨氮降解性能的影响

1、碳源对菌株氨氮降解性能的影响

(1)制备培养基乙 

培养基乙：在基础培养基的基础上调整碳源和(NH₄)₂S0₄的浓度，使氨氮浓度为300mg/L，C/N为10，pH为7.0。分别采用淀粉、甘露醇、柠檬酸钠、葡萄糖、乙酸钠或碳酸氢钠作为唯一碳源。

(2)挑取克鲁斯假丝酵母LSA单克隆，接种于100mL YPD液体培养基中，30℃、150r/min振荡培养24-36h(使培养体系中的菌体浓度达到8.0-9.0×10⁸cfu/mL)，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。

(3)取步骤(2)得到的菌体，用无菌生理盐水重悬，得到菌浓度为8.0×10⁸cfu/mL的菌悬液。

(4)将0.8ml步骤(3)得到的菌悬液接种至80mL培养基乙，30℃、150r/min振荡培养24h，然后检测培养体系中的氨氮浓度并计算氨氮降解率。

氨氮降解率＝(初始时刻培养体系中的氨氮浓度-培养24小时后体系中的氨氮浓度)/初始时刻培养体系中的氨氮浓度*100％。

初始时刻培养体系中的氨氮浓度＝培养基乙中的氨氮浓度/1.01。

结果见图5A。葡萄糖为碳源时，克鲁斯假丝酵母LSA氨氮氧化的能力最强，其次为乙酸钠，不能利用无机碳。

2、C/N对菌株氨氮降解性能的影响

(1)制备培养基丙 

培养基丙：采用葡萄糖作为唯一碳源，在基础培养基的基础上调整葡萄糖和(NH₄)₂S0₄的浓度，使氨氮浓度为300mg/L，C/N为5、10、20或40，pH为7.0。

(2)挑取克鲁斯假丝酵母LSA单克隆，接种于100mL YPD液体培养基中，30℃、150r/min振荡培养24-36h(使培养体系中的菌体浓度达到8.0-9.0×10⁸cfu/mL)，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。

(3)取步骤(2)得到的菌体，用无菌生理盐水重悬，得到菌浓度为8.0×10⁸cfu/mL的菌悬液。

(4)将0.8ml步骤(3)得到的菌悬液接种至80mL培养基丙，30℃、150r/min振荡培养24h，然后检测培养体系中的氨氮浓度并计算氨氮降解率。

结果见图5B。当C/N<20时，随着C/N的升高，氨氮降解率呈现升高趋势。在C/N为20时，24h内氨氮降解率达到最高，为82％。C/N为5时，氨氮降解率显著低于其他各组，表明碳源不足，会直接影响克鲁斯假丝酵母LSA的生长代谢，导致氨氮降解率下降。C/N高达40时，克鲁斯假丝酵母LSA依然具有良好的降解性能。

实施例3、克鲁斯假丝酵母LSA对粪便氨气散发量的影响

1、挑取克鲁斯假丝酵母LSA单克隆，接种于100mL YPD液体培养基中，30℃、150r/min振荡培养24-36h(使培养体系中的菌体浓度达到8.0-9.0×10⁸cfu/mL)，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。

2、取步骤1得到的菌体，用无菌生理盐水重悬，得到菌浓度为8.0×10⁸cfu/mL的菌悬液。

3、取一个大烧杯(1L)，在大烧杯中放入一个小烧杯(小烧杯中装有20ml吸收液；吸收液为0.01mol/L硫酸溶液)，在大烧杯中放入100g新鲜鸡粪样品和10ml步骤2得到的菌悬液(将等体积无菌生理盐水作为菌悬液的空白对照)并充分混匀，然后用6层保鲜膜密封大烧杯，室温培养，分别于24h、48h、72h和96h进行检测(检测项目：测定吸收液中的氨氮含量并得到氨气散发量结果。

结果见图6(图6的纵坐标为吸收液中的氨氮浓度，mg/L)。与空白对照组相比，加入菌悬液的试验组的氨气散发量显著降低，即克鲁斯假丝酵母LSA能够在鸡粪中定植并发挥除臭作用。