一种AMF+DSE组合菌剂及其在制备促进黄瓜生长与抗根结线虫的制剂中的应用

摘要

本发明提供了一种AMF+DSE组合菌剂及其在制备促进黄瓜生长与抗根结线虫的制剂中的应用，本发明设置不同的AMF+DSE组合对黄瓜进行接种试验，分析了不同AMF+DSE组合的侵染率、丛枝着生率、丛枝类型等对黄瓜生长发育及其根结线虫病害的影响。通过试验结果确定最佳的抗南方根结线虫的AMF+DSE组合为G.m+S.a+A.l+Ph.l，此组合处理的株高、茎粗、地上部干重、根系干重和单株产量最高、而病情指数最低，该最佳组合菌剂具有促进黄瓜生长与提高黄瓜植株抗根结线虫的功效，本发明为进一步探索AMF和DSE的相互作用与机制提供了依据、奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种AMF+DSE组合菌剂及其在 制备促进黄瓜生长与抗根结线虫的制剂中的应用。

背景技术

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是陆地生态系统中的重要 成员,能与植物根系建立互惠共生体。AMF可改善植物的矿质营养、增强植物 抗病性、提高植物在极端环境中的抗逆性，有助于植物抵御病原菌的侵害，并改 善土壤团粒结构、促进作物的高产稳产、优质高效。AMF侵染植物根尖的特性, 表明该真菌的生态位与土传病原物相同，这就为拮抗病原物创造了得天独厚的条 件。更为重要的是由根内伸展至根外于土壤中形成的巨大菌丝网络，以及由此形 成的菌根网路为其发挥生理生态功能(如水分养分吸收等)奠定了坚实的生物学 和生态学基础。AMF在农业可持续发展、生态保护、环境与食品安全等方面亦 具重要意义。

我国的AMF研究虽然起步较晚，开始于上世纪70年代末，10年后则进入 了快速发展阶段。进入本世纪后，我国AMF研究始终保持快速稳定的发展。例 如，AMF分类、资源与生物多样性方面报道7属130种，包括球囊霉属(Glomus)， 盾巨孢囊霉属(Scutellospora)，无梗囊霉属(Acaulospora)，原囊霉属 (Archaeospora)，巨孢囊霉属(Gigaspora)，类球囊霉属(Paraglomus)，内养囊霉属 (Entrophospora)，并不断有新种和新记录种报道。各国都分离到多种不同属的 AMF种类，球囊霉属出现频度最高，尤其是G.clarum，G.etunicatum，G. geosporum，G.intraradices，G.mosseae，G.sinuosum在全球分布最为广泛。同时 在生理效应及生态学等方面开展了系统研究工作；而菌根研究技术方面，也建立 了测定AMF接种势新的方法；提出了AMF诱导植物抗病性的理论。目前，国 际上已经建立了AMF菌种保藏库，收集世界AMF资源、繁殖、菌种保藏和交 流，为各国研究者提供菌种等措施来规范菌种的保藏工作。综上所述，AMF物 种多样研究取得了巨大进展，多样性和资源研究与保护得到了发达国家和发展中 国家的重视。

深色有隔内生真菌(dark septate endophytes,DSE)广泛定殖于植物根系皮层 细胞内或细胞间隙,形成深色有隔的菌丝和微菌核。DSE通常可以促进植物生 长，改善养分吸收，提高植物抗病性，增强抵御不良环境条件的能力。自然环境 下DSE和AMF可以同时侵染植物根系。DSE与其他土壤微生物有协同互助关 系，DSE可以在根内或根间与AMF形成致密菌丝桥，扩大根系养分吸收范围， 有效进行物质交换与信息传递，共同促进植物根围微生物活动，改善植物根围土 壤微环境，从而促进植物的生长发育。

有关DSE的研究报道从上世纪初已经开始，早期对DSE的认识源于研究者 在菌根真菌研究中所发现的一些非传统意义上的菌根真菌，经过一段时间的探索 将其正式命名为DSE。DSE分布广泛,几乎在地球所有生境中均有发现,但除了 少数几种DSE的分类地位已经明确外,大多数类群的分类地位尚不明确。目前 对这该类群真菌的认识仍处于起步阶段。

黄瓜(Cucumis sativus)作为一种全球性的重要蔬菜作物，日常生活中占据 重要地位。但是，生产中的连作障碍使得黄瓜土传病害，尤其是根结线虫病害的 发病率和死亡率不断升高，造成大面积减产，对黄瓜栽培影响很大，是当今黄瓜 生产中较为突出的问题之一。

发明内容

本发明提供了一种AMF+DSE组合菌剂及其在制备促进黄瓜生长与抗根结 线虫的制剂中的应用，利用本发明所述的组合菌剂可以用于促进植物的生长发育 和提高植物的抗病性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了茎点霉F2-3-10菌株，其分类命名为Phoma leveillei，保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC  No.10482。

本发明还提供了一种AMF+DSE组合菌剂，所述组合菌剂包括AMF菌剂和 DSE菌剂，所述DSE菌剂为保藏编号为CGMCC No.10482的茎点霉F2-3-10菌 株制成的菌剂。

所述AMF菌剂为：摩西球囊霉、全球盾巨孢囊霉或光壁无梗囊霉中的一种 或几种。

本发明进一步提供了所述的AMF+DSE组合菌剂在制备促进植物生长的制 剂中的应用。

所述组合菌剂能提高黄瓜的株高、地上部干重、地下部干重和单株产量。

本发明进一步提供了所述的AMF+DSE组合菌剂在制备抗根结线虫的制剂 中的应用。

所述根结线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)。

所述组合菌剂能显著降低黄瓜根内二龄幼虫数、线虫雌虫数和卵数。

与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明在温室栽培条件下采 用盆栽方法，设置不同AMF+DSE组合对黄瓜进行接种试验，测定分析了不同 AMF+DSE组合的侵染率、丛枝着生率、丛枝类型等对黄瓜生长发育和黄瓜根结 线虫的影响，通过试验结果确定最佳的抗南方根结线虫的AMF+DSE组合为 G.m+S.a+A.l+Ph.l，该组合处理的黄瓜植株高度、茎粗度、地上部干重、根系干 重和单株产量最高、而病情指数最低，分别为130.3cm、0.95cm、20.7g、2.9g、 562.9g和15.3。表明促进黄瓜生长发育、抗南方根结线虫的最佳组合是G.m+S.a+ A.l+Ph.l。此最佳组合菌剂具有促进黄瓜的生长与提高抗根结线虫的功效，本发 明为进一步探索AMF和DSE的相互效应与作用机制奠定了基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

实施例1

1.试验材料

黄瓜(Cucumis sativus，品种为“津优35号”)，由天津科润农业科技股份有限 公司提供，也可采用其它常见黄瓜品种；南方根结线虫(Meloidogyne incognita， Mi)由青岛农业大学植物保护学院线虫实验室提供；DSE为茎点霉(Phoma  leveillei)F2-3-10菌株(简称Ph.l)，由青岛农业大学菌根生物技术研究所提供； AMF为摩西球囊霉Glomus mosseae(保藏编号Gm32)，地表球囊霉Glomus  versiforme(保藏编号Gv39)，光壁无梗囊霉Acaulospora laevis(保藏编号Al57)， 全球盾巨孢囊霉Scutellospora aurigloba(保藏编号Sa97)，保藏编号Gm32、保藏 编号Gv39、保藏编号Al57和保藏编号Sa97均是由青岛农业大学菌根生物技术研 究所提供，本发明中的AMF也可以采用现有技术中的其它AMF菌株。

以保存在三叶草的根段及其石英砂培养基质中的AMF孢子作为接种物；黄 瓜盆栽基质为砂土比2∶1，全氮含量0.1％，速效磷含量16.1mg/kg，速效钾含 量102.6mg/kg，有机质含量7.9g/kg。

2.试验设计

本发明试验采用温室栽培的方法，设28个处理，分别为Meloidogyne  incognita(Mi)、Glomus mosseae(G.m)、Glomus versiforme(G.v)、Acaulospora  laevis(A.l)、Scutellospora aurigloba(S.a)，Phoma leveillei(Ph.l)、G.m+Ph.l、 S.a+Ph.l、G.v+Ph.l、A.l+Ph.l、G.m+S.a+Ph.l、G.m+G.v+Ph.l、G.m+A.l+Ph.l、 G.m+S.a+G.v+Ph.l、G.m+G.v+A.l+Ph.l、G.v+S.a+A.l+Ph.l、G.m+S.a+A.l+Ph.l、 G.m+Ph.l+Mi、S.a+Ph.l+Mi、G.v+Ph.l+Mi、A.l+Ph.l+Mi、G.m+S.a+Ph.l+Mi、 G.m+G.v+Ph.l+Mi、G.m+A.l+Ph.l+Mi、G.m+S.a+G.v+Ph.l+Mi、G.m+G.v+A.l+ Ph.l+Mi、G.v+S.a+A.l+Ph.l+Mi、G.m+S.a+A.l+Ph.l+Mi和不接种对照(CK)， 随机排列，每个处理重复5次。

将所述茎点霉(Phoma leveillei)F2-3-10菌株进行菌种保藏，保藏单位的名 称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。Phoma leveillei的保 藏日期：2015年3月31日；保藏编号：CGMCC No.10482。

3.接种与栽培管理

基质高压灭菌(121℃，1h)后装入经消毒过的花盆(17cm×20cm)；CK则 加入与接种物相同体积的灭菌砂和接种物滤液；黄瓜种子先用0.10％的升汞溶液 浸泡10min，然后用清水洗净，再用60-70℃的温水浸种10-15min，用清水浸种 12h后，在25-28℃的恒温箱内催芽，待胚芽露出后播种。将两粒带芽黄瓜种子播 入花盆内，然后覆土盖种。每个花盆在播种前接种AMF的混合接种物20mL，待 黄瓜出苗生长至3-5叶时，接种Phoma leveillei(Ph.l)的菌液50ml/盆(在马铃薯 葡萄糖液体培养基(PDB)中接入菌丝块，于25℃转速为100r/min摇床中振荡 培养14d后，用灭菌纱布过滤收集菌丝团，用灭菌水冲洗数次后，将菌丝团打碎 配制成5×10⁵CFU/mL的菌液备用)，待黄瓜幼苗生长至7～9叶时，接种Mi的卵， 接种量约为1500卵/株盆,采用灌根法，均匀倒入黄瓜根周围。根据基质的肥力 以及植株的生长状况的需要施肥浇水等，其他采用统一的常规管理。

4.数据分析方法

采用DPS 7.05和Microsoft Excel 2003版统计软件进行数据分析。

5.实验结果

(1)接种南方根结线虫(Mi)对黄瓜AMF和DSE的侵染特征的影响

AMF侵染率(％)＝∑(0％×根段数+10％×根段数+…+100％×根段数)×100％/总根段 数；

A型丛枝着生率(％)＝∑(0％×根段数+10％×根段数+…+100％×根段数)×100％/总 根段数；

P型丛枝着生率(％)＝∑(0％×根段数+10％×根段数+…+100％×根段数)×100％/总 根段数；

P/A为P型丛枝着生率(％)与A型丛枝着生率(％)的比例；

DSE侵染率(％)根据McGonigle(1990)方法测定。

如表1所示，接种线虫后G.m+S.a+A.l+DSE+Mi处理的AMF侵染率、A型 丛枝侵染率均显著高于其他处理，G.m+G.v+A.l+DSE+Mi处理的DSE侵染率、 P型丛枝侵染率显著高于其他处理。

表1接种南方根结线虫(Mi)后黄瓜AMF、DSE的侵染特征

注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(α＝0.05)

(2)不同AMF+DSE组合对南方根结线虫(Mi)繁殖体数量的影响

根上卵囊数：每处理随机选取3株黄瓜的根系，将其切成1cm左右根段，随机称 1g，记录卵囊数。

单个卵囊含卵量：将约10个卵囊放入5％的次氯酸钠中溶解2-3min，然后记录每 个卵囊的卵数。

实验结果如表2所示，AMF+DSE组合处理的黄瓜根内雌虫数、卵囊数和含 卵量均显著低于单接种线虫的处理，尤其是在卵囊数和含卵量指标上。同时，各 个处理间也存在差异，G.m+S.a+A.l+Ph.l+Mi组合处理的根内二龄幼虫数、根内 雌虫数、卵囊数和含卵量均显著低于其它组合处理，即该组合处理的南方根结线 虫繁殖体数量在各个处理中是最低的，表明在一定程度上也是抑制线虫最好的。

表2接种AMF+DSE对南方根结线虫繁殖体数量的影响

注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(α＝0.05)

(3)不同AMF+DSE组合对黄瓜根结线虫病的影响

根结线虫发生危害的分级标准，采用0-6级分级标准，具体如下：

6级-形成根结的根系数量占根系总数的100％，根结会聚形成明显的根系膨 大，无须根系，根系具明显的腐烂症状；

5级-形成根结的根系数量占根系总数的70％-90％，根结会聚形成明显的根 系膨大，只有少数须根系；

4级-形成根结根系数量占根系总数的50％-70％，大部分根结团聚形成明显 的根系膨大(30％-70％)；

3级-形成根结根系数量占根系总数的20％-50％左右，部分根结团聚形成明 显的根系膨大；

2级-形成根结根系数量占根系总数的10％-20％左右，根结中等大小，出现 了较明显的须根团；

1级-形成根结根系数量占根系总数的10％以下，根结稍微有些膨大，有一 些须根团的形成；

0级-没有形成根结；

0.5级-形成根结根系数量占根系总数的10％以下，根结较小，须根系的发育 几乎没有受到影响。分别以下公式计算病情指数、发病率、防效。

病情指数＝∑(各病级数×各级的株数)×100/(最高病级数×总调查的株数)

发病率(％)＝[发病植株数/调查总株数]×100％

相对防效(％)＝[(单接种根结线虫的病情指数－接种AMF+DSE+Mi的病情指数)/ 单接种根结线虫的病情指数]×100％

实验结果如表3所示，接种S.a+Ph.l和G.v+Ph.l组合处理的黄瓜根结线虫 病病情指数达到66.7，与对照没有显著差异，同时防效较低；而G.m+S.a+A.l+Ph.l 组合的发病率仅有40％，显著低于对照和其他AMF+DSE组合，并且病情指数 最低、防效最高，与对照或其他处理差异显著，表明G.m+S.a+A.l+Ph.l组合处理 相比较其他AMF+DSE组合在一定程度上可更显著减轻南方根结线虫对黄瓜造 成的危害。

表3接种AMF和DSE对黄瓜根结线虫病的影响

注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(α＝0.05)

(4)不同AMF+DSE组合和南方根结线虫(Mi)对黄瓜生长的影响

实验结果如表4所示：单接种AMF或DSE的各项生长指标差异并不大，但 都显著低于接种AMF+DSE组合的处理，其中，G.m+S.a+A.l+Ph.l组合处理的株 高、茎粗、地上/下部干重和单株产量最高，于其他单接种处理差异显著。同时， 在接种南方根结线虫(Mi)后，AMF+DSE组合在产量、株高、地下部干鲜重等 指标中，多数处理显著高于CK和只接种Mi的处理，尤其是G.m+S.a+A.l+Ph.l+Mi 组合处理的株高、地上部和地下部干重以及单株产量都要高于其它接线虫的组合 处理。实验结果显示，对于同一组合，接种线虫的黄瓜产量远远低于不接种的植 株。因此，试验表明在接种南方根结线虫后，AMF+DSE组合对黄瓜生长发育有 一定的促进作用，对根结线虫也有一定的抑制作用。

表4接种AMF、DSE和根结线虫(Mi)对黄瓜生长发育的影响

注：表中同列数据后不同小写字母表示差异显著(α＝0.05)

AMF可以不同程度地抑制土传病原菌和线虫的生长、繁殖及危害，提高植 物的抗病性，DSE是广泛定殖于植物根细胞内或细胞间隙的土壤真菌，能够提 高寄主的抗逆性、增强寄主的抗病能力。本发明中不同AMF+DSE组合处理的 黄瓜根内二龄幼虫数、线虫雌虫数和卵数都显著低于Mi处理(表2)，其中 G.m+S.a+A.l+Ph.l+Mi组合处理的南方根结线虫繁殖体数量在各个处理当中是最 低的。

本发明中单独接种AMF或DSE处理明显提高黄瓜的生长量以及地上、地下 部干重，其中不同AMF+DSE组合处理的各指标显著高于单接种AMF或DSE 的处理，AMF和DSE均能促进寄主植物的生长发育。实验结果表明， G.m+S.a+A.l+Ph.l组合处理的产量、株高、干重指标显著高于其它组合处理(表 4)。这是由于AMF和DSE能够相互作用共同促进植物的生长发育。

本发明中接种不同AMF+DSE组合处理后，S.a+Ph.l+Mi和G.v+Ph.l+Mi 组合处理的发病率与对照无显著差异，而G.m+S.a+A.l+Ph.l+Mi组合的发病率最 低(40％)，显著低于对照和其他AMF+DSE组合的处理，并且病情指数最低、 防效最高，与对照达到显著水平。同时，实验结果显示，G.m+S.a+A.l+Ph.l+Mi 组合的P型丛枝着生数量显著高于其他组合，表明P型丛枝具备更强的诱导植 物抗病性的作用。

现有技术中通常对黄瓜生长发育及抗根结线虫的研究主要是一种真菌(如 AMF)在对株高、产量、干鲜重等生长指标，以及线虫发病指标的测定上，而 对两种真菌组合(如AMF+DSE组合)对根结线虫的影响鲜有研究。因此，本 发明在以往研究的基础上测定不同AMF+DSE组合处理对黄瓜生长发育及抗根 结线虫的效应。通过试验结果可以看出，G.m+S.a+A.l+Ph.l组合明显提高黄瓜生 长、降低线虫发病率以及减少根内线虫数量，防御南方根结线虫的效果最佳。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然 可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等 同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护 的技术方案的精神和范围。