一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法。本发明将家蚕乙酰胆碱酯酶基因与锚定蛋白基因AGα1相连插入到酵母表达载体pPIC9K中构建成表面展示载体并转化毕赤酵母GS115，筛选阳性重组子，并利用甲醇对阳性重组子进行诱导表达，表达结束后离心去除上清液，将菌体冷冻干燥即得重组家蚕乙酰胆碱酯酶。制备得到的重组酶稳定性好、操作简单、检出限低、灵敏度高、尤其成本低廉，可在家庭、市场、蔬菜生产基地等进行现场检测，非常适合大量样品的筛查，具有重要的实际应用推广意义。

说明书

技术领域

本发明涉及农药残留快速检测技术领域，具体地，涉及一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法，更具体地，涉及一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法。

背景技术

农药的使用在给农业生产带来巨大经济效益的同时，也对环境与产品造成严重的污染，给人民身心健康带来很大的影响。目前农药残留检测的方法主要有仪器分析法，免疫分析法和酶抑制法等。仪器分析法检测灵敏度高、选择性好、定性定量可同时进行、结果准确可靠，是目前检测农药残留的标准方法和仲裁方法，但仪器法需要使用实验室昂贵的大型分析仪器，依靠专业技术人员完成分析工作，而且样品前处理操作繁琐、时间较长，因而只能应用于实验室，很难适应现场简单快速和大量样品农药残留分析的要求，不利于在基层进行推广应用。免疫分析法具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，但该方法对试剂的选择性高，容易受到检测样品基质的影响，对结构类似的化合物也有一定的交叉反应，且具有多残留识别的宽谱特异性抗体的制备尚在研究阶段。当前我国农药残留快速检测技术中酶抑制法的发展时间比较长，较其他速测方法更为成熟，操作更加简单，成本更低，具有快速、灵敏、准确的优点，能有效弥补仪器分析方法前处理繁琐、检测费用高，难以满足高通量、快速和在线检测等方面的不足，更适合我国的国情，能够作为仪器分析方法的有益补充。但是，市售的农药残留快速检测试剂盒或试纸条其核心材料胆碱酯酶多是直接从家蝇、马血清、鱼肉组织、猪肝、羊血红细胞、植物组织等提取得到的，这些从生物体中直接分离提取的胆碱酯酶存在提取量低、纯化困难、种类间灵敏度差异大、稳定性差等不足，因此在实际检测中极易出现假阳性，应用中缺点较多。王栋等将家蝇乙酰胆碱酯酶基因分别构建到原核和真核表达系统中，分别进行原核和真核表达，但是，结果发现原核表达出来的重组家蝇乙酰胆碱酯酶活力很低，而真核表达出来的重组家蝇乙酰胆碱酯酶没有活性。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法。通过该方法制备得到的重组家蚕乙酰胆碱酯酶产量大、灵敏度高且稳定，而且可在家庭、市场、蔬菜生产基地等现场进行快速检测有机磷和氨基甲酸酯类农药的残留。

本发明的另一个目的是提供一种检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶制剂。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法，包括以下步骤：将家蚕乙酰胆碱酯酶基因与锚定蛋白基因AGα1相连插入到酵母表达载体pPIC9K中构建成表面展示载体并转化毕赤酵母GS115，筛选阳性重组子，并利用甲醇对阳性重组子进行诱导表达，表达结束后离心去除上清液，将菌体冷冻干燥即得重组家蚕乙酰胆碱酯酶。

现有技术中也有人采用重组表达技术来制备重组乙酰胆碱酯酶，如王栋等将家蝇乙酰胆碱酯酶基因分别构建到原核和真核表达系统中，分别进行原核和真核表达，但是，结果发现原核表达出来的重组家蝇乙酰胆碱酯酶活力很低，而真核表达出来的重组家蝇乙酰胆碱酯酶没有活性。本发明将家蚕乙酰胆碱酯酶基因与锚定蛋白基因AGα1相连构建到表面展示载体中并转化毕赤酵母，通过固定化展示技术得到的重组酶的活性很好。

    优选地，所述家蚕乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

由如上方法制备得到的重组家蚕乙酰胆碱酯酶。

如上方法制备得到的重组家蚕乙酰胆碱酯酶在检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留中的应用。

一种用于检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的酶制剂，包括如上所述的重组家蚕乙酰胆碱酯酶、辅助试剂A、辅助试剂B和辅助试剂C；其中，所述辅助试剂A为乙酸-α-萘酯，辅助试剂B为固蓝B盐，辅助试剂C为pH 7.5的磷酸盐缓冲液粉剂。

优选地，所述辅助试剂A使用时溶于丙酮中，配成浓度为0.03 mol/L的溶液。

优选地，所述辅助试剂B使用时溶于甲醇中，配成浓度为0.06 mol/L的溶液。

优选地，所述辅助试剂C使用时的浓度为50mM。

    辅助试剂A的制备：将酯类物质乙酸-α-萘酯溶于有机溶剂，有机溶剂为丙酮，搅拌均匀使其浓度为0.03 mol/L，溶液于4℃可保存一个月。

辅助试剂B的制备：将显色剂固蓝B盐溶于有机溶剂，有机溶剂为甲醇，搅拌均匀使其浓度为0.06 mol/L，稳定性比其水溶液好。

辅助试剂C的制备：将Na₂HPO₄^．12H₂O与NaH₂PO₄^．2H₂O按质量比10:1混合而成，用时溶于一定量的蒸馏水中，其浓度为50mM，pH 为7.5。

本发明的酶制剂在检测过程中还会使用到标准比色卡，标准比色卡根据不同浓度的农药在检测时所显示的颜色制作而成。

本发明的应用原理是：正常情况下，乙酰胆碱酯酶能够催化神经传导代谢产物乙酰胆碱的替代物乙酸-α-萘酯水解，其水解产物α-萘酚可与显色剂固蓝B盐反应，生成紫红色的偶氮化合物。而有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶正常功能有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，有农药存在时，溶液的颜色呈浅红色或固蓝B盐原有的黄色，而非紫红色，根据颜色的变化可判断出样品中是否有高剂量的有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。

一种检测有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的方法，包括以下步骤，将重组家蚕乙酰胆碱酯酶与辅助试剂C混匀后得液体酶制剂，将待测样品和适量液体酶制剂混合，2~3分钟后加入辅助试剂A和辅助试剂B，1~2分钟后观察待测液的颜色，如果出现紫红色，则说明农药残留未超标，如果出现浅红色或黄色，则说明农药残留超标；另外，将检测结果与标准比色卡作比较，则可粗略知道农药的残留量。

检测时使用的容器可以是离心管、玻璃试管、血袋等形式，配以比色计，还可以以速测计形式使用。

本发明既可以检测蔬菜中有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留，也可以检测水果、地下水、粮食中的有机磷或氨基甲酸酯类农药的残留。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

（1）稳定性好：重组家蚕乙酰胆碱酯酶是利用酵母表面展示获得的固定在酵母菌体表面的固定化酶，经冷冻干燥后易于保存，低温避光条件下放置两年活力仍很高；辅助试剂为固态形式，保存期比一般溶液形式有效期大大延长。

（2）灵敏度高：对有机磷农药和氨基甲酸酯类农药检测限极低，一般检测限为几个ppb，最低可达0.2 ppb。

（3）耗时短：一般操作者一次可同时处理多个样品，从取样到测定完成平均测定一个样品只需要3~5分钟。

（4）操作简单：不需要使用昂贵的大型分析仪器，亦不需要专业技术人员分析，方便在家庭、农贸市场、蔬菜基地等现场进行检测。

（5）成本低廉：重组家蚕乙酰胆碱酯酶酵母表达工程菌株构建完成之后，可利用甲醇大量诱导表达，产量高且价格低廉，辅助试剂费用几乎可以忽略不计。

附图说明

图1为重组家蚕乙酰胆碱酯酶表面展示载体的构建流程图。

图2为常见有机磷农药结构示意图。

图3为常见氨基甲酸酯类农药结构示意图。

图4为几种有机磷农药对重组家蚕乙酰胆碱酯酶的抑制曲线。

图5为几种氨基甲酸酯类农药对重组家蚕乙酰胆碱酯酶的抑制曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

将家蚕乙酰胆碱酯酶基因与锚定蛋白基因AGα1相连插入到酵母表达载体pPIC9K中构建成表面展示载体，整个载体构建过程如图1所示。建成的表面展示载体转化毕赤酵母GS115，筛选阳性重组子。

具体步骤如下：

1、采用Trizol试剂抽提家蚕头部总RNA；用RT-PCR试剂盒以家蚕头部总RNA为模板，Oligo(dT)₁₈为引物，在M-MuLV反转录酶的作用下反转录合成cDNA第一链；以第一链cDNA为模板通过PCR扩增家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace（基因全长序列如SEQ ID NO.1），将bmace基因连入PMD-18-T载体，连接产物转化转化大肠杆菌DH5α；以重组质粒PMD-18-T-bmace为模板PCR扩增带MluⅠ酶切位点的bmace基因，并在5′端引入6×His标签。

2、使用酵母基因组抽提试剂盒提取酿酒酵母INVSc1基因组DNA，以此为模板通过PCR扩增锚定蛋白基因AGα1（AGα1基因全序列GenBank序列号：X16861.1），同时在扩增片段的5′端引入一段linker序列（linker序列见表1）。

3、通过PCR将步骤1中的bmace基因与步骤2中的锚定蛋白基因AGα1预拼接在一起，通过重叠延伸PCR扩增融合基因bmace-AGα1。

4、将酵母表达载体pPIC9K和步骤中的融合基因bmace-AGα1同时做双酶切（MluⅠ、NotⅠ），酶切过后将二者连接在一起构成重组质粒pPIC9K-bmace-AGα1，连接产物转化大肠杆菌DH5α。经过PCR鉴定和酶切鉴定正确后将重组载体pPIC9K-bmace-AGα1转化毕赤酵母GS115形成转化子GS115/pPIC9K-bmace-AGα1。经PCR鉴定目的基因正确整合转化子为重组子，可用于下一步的诱导表达。

表1. PCR扩增所用的所有引物及序列

实施例2

重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备：将酵母表达工程菌株GS115/pPIC9K-bmace-AGα1诱导表达4天，离心去除上清液，将菌体冷冻干燥后，即得重组家蚕乙酰胆碱酯酶，分装于塑料离心管中，扣盖置于低温避光条件下保存。用时取0.1 g 冷冻干燥的固体酶制剂，加入50 mL辅助试剂C，振荡混合均匀制成液体酶制剂。

重组家蚕乙酰胆碱酯酶活力测定：

取重组家蚕乙酰胆碱酯酶800 μL，分别加入100 μL底物和100 μL显色剂反应5 min，同时以空菌GS115/pPIC9K的菌悬液代替表面展示的重组家蚕乙酰胆碱酯酶悬液的体系作为空白对照，离心收集上清测定412 nm 波长下的吸光度值，计算酶活时定义1分钟内能催化1微摩尔底物的酶量为一个单位。经计算，诱导表达的菌体酶活达到104.2 U/mL，按菌体重量计算则为787.7 U/g。

为了验证制备的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的活性情况，测定了几种有机磷农药和几种氨基甲酸酯类农药对重组家蚕乙酰胆碱酯酶的抑制效果，抑制曲线分别见图4和图5。

辅助试剂A的制备：称取56 mg 乙酸-α-萘酯溶于10 mL 丙酮中，即配制成0.03 mol/L 乙酸-α-萘酯丙酮溶液，4 ℃ 可保存一个月。

辅助试剂B的制备：称取285 mg 固蓝B盐溶于10 mL 甲醇中，即配制成0.06 mol/L 固蓝B盐甲醇溶液，2周内使用效果较好。若没有甲醇，可用蒸馏水配置，但固蓝B盐水溶液不如固蓝B盐甲醇溶液稳定性好，需要配制当天使用，否则很容易由最初的淡黄色变为深褐色，影响结果的判定。

辅助试剂C的制备：将Na₂HPO₄^．12H₂O与NaH₂PO₄^．2H₂O按质量比10:1混合而成，用时溶于一定量的蒸馏水中，其浓度为50mM，pH 为7.5。

实施例3

    实施例2所述酶制剂在检测各样品中农药残留的应用。

水果：将少许水果切碎，取约2 g水果碎块置于50 mL锥形瓶中，加入10 mL 辅助试剂C，振荡1分钟，静止。取一支空离心管加入100 μL重组酶制剂和2.5 mL 水果提取液，混合均匀孵育2分钟后，加入辅助试剂A和辅助试剂B各100 μL，显色2~3分钟，观察离心管中液体的颜色。如果出现紫红色，则说明水果中农药残留未超标，如果出现浅红色或黄色，则说明水果中农药残留超标。与标准比色卡作比较，则可粗略知道农药的残留量。

蔬菜：冲洗掉蔬菜表面泥土，剪成1 cm左右见方碎片，取蔬菜样品大约2 g置于50 mL锥形瓶中，加入10 mL 辅助试剂C，振荡1分钟，静止。取一支空离心管加入100 μL重组酶制剂和2.5 mL 蔬菜提取液，混合均匀孵育2分钟后，加入辅助试剂A和辅助试剂B各100 μL，显色2~3分钟，观察离心管中液体的颜色。如果出现紫红色，则说明蔬菜中农药残留未超标，如果出现浅红色或黄色，则说明蔬菜中农药残留超标。与标准比色卡作比较，则可粗略知道农药的残留量。

生活饮用水：取一支空离心管加入100 μL重组酶制剂和2.5 mL 生活饮用水，混合均匀孵育2分钟后，加入辅助试剂A和辅助试剂B各100 μL，显色2~3分钟，观察离心管中液体的颜色。如果出现紫红色，则说明生活饮用水中农药残留未超标，如果出现浅红色或黄色，则说明生活饮用水中农药残留超标。与标准比色卡作比较，则可粗略知道农药的残留量。

粮食：取大约2 g粮食置于50 mL锥形瓶中，加入10 mL 辅助试剂C，振荡1分钟，静止。取一支空离心管加入100 μL重组酶制剂和2.5 mL 粮食提取液，混合均匀孵育2分钟后，加入辅助试剂A和辅助试剂B各100 μL，显色2~3分钟，观察离心管中液体的颜色。如果出现紫红色，则说明粮食中农药残留未超标，如果出现浅红色或黄色，则说明粮食中农药残留超标。与标准比色卡作比较，则可粗略知道农药的残留量。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  华南农业大学

 

<120>  一种用于检测农药残留的重组家蚕乙酰胆碱酯酶的制备方法

 

<130> 

 

<160>  14   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1914

<212>  DNA

<213>  家蚕bmace基因全长序列

 

<400>  1

atgatcaact acggcaagat tgtattcact aagcttcttc tatgcgtact catgtccggt     60

 

acttttgctc gatcttgggc caatcaccat gataccacaa catctacaac acaaactacc    120

 

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tctttcacac agtttgctct taccggaaaa cctcacaagc ctgacgagaa gtggcctctg   1680

 

tactcccggt cttcgcctca ttactacaca tacacggcgg tgggtccaag cggtccagct   1740

 

ggaccccgcg gcccgcgtgc ctccgcttgc gctttctgga acgatttctt gaacaaactt   1800

 

aacgagttgg agcgtgtacc gtgtgacggc gccgtgaccg gtccttacag cagtgtcgcc   1860

 

ggcactgccc tccctgtaac ccttctcacc actttggcaa tcactattgc tttg         1914

 

 

<210>  2

<211>  49

<212>  DNA

<213>  bmace（F）

 

<400>  2

cgacgcgtca tcatcatcat catcatagat cttgggctaa ccaccacga                 49

 

 

<210>  3

<211>  33

<212>  DNA

<213>  bmace（R）

 

<400>  3

gcggcggccg cagaggagta tggaccggta aca                                  33

 

 

<210>  4

<211>  51

<212>  DNA

<213>  bmace -Flag（F）

 

<400>  4

gcgacgcgtg actacaagga cgacgacgac aagatgatca actacggtaa g              51

 

 

<210>  5

<211>  32

<212>  DNA

<213>  AGα1-linker（F）

 

<400>  5

gccgcggccg cgaatagcag gtacgacaaa ag                                   32

 

 

<210>  6

<211>  49

<212>  DNA

<213>  AGα1（R）

 

<400>  6

aggcggaggt ggctctggcg gtggcggatc gaacctcggt acagctagc                 49

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  ace-FQtest（F）

 

<400>  7

gcatcaagaa cgctacgaat                                                 20

 

 

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  ace-FQtest（R）

 

<400>  8

cgccctgtat tgcatagaag c                                               21

 

 

<210>  9

<211>  20

<212>  DNA

<213>  GAP（F）

 

<400>  9

cgtcggtatt aacggtttcg                                                 20

 

 

<210>  10

<211>  19

<212>  DNA

<213>  GAP（R）

 

<400>  10

gcttgtaagc cttgtgggt                                                  19

 

 

<210>  11

<211>  50

<212>  DNA

<213>  ace-linker（R）

 

<400>  11

ccagagccac ctccgcctga accgcctcca ccagaggagt atggaccggt                50

 

 

<210>  12

<211>  21

<212>  DNA

<213>  α-factor

 

<400>  12

tactattgcc agcattgctg c                                               21

 

 

<210>  13

<211>  21

<212>  DNA

<213>  AOX(F)

 

<400>  13

gactggttcc aattgacaag c                                               21

 

 

<210>  14

<211>  21

<212>  DNA

<213>  AOX(R)

 

<400>  14

gcaaatggca ttctgacatc c                                               21