一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物，是将金丝桃素白蛋白纳米粒和兔抗大肠杆菌混合后加入至乙二醇中，以碳离子进行辐照，辐照后低温放置2h，再进行低温离心，将沉淀冷冻干燥后即可得到金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物；并提供了其制备方法和应用。本发明的有益效果为：本发明提供的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物及其制备方法和应用，通过抑菌试验及临床药效试验，证明该靶向复合物较原药的效果大大提高，由大肠杆菌血清抗体寻找和捕捉大肠杆菌，由金丝桃素白蛋白纳米粒抑制和杀灭大肠杆菌，使其对大肠杆菌进行精确打击，增强了金丝桃素白蛋白纳米粒在鸡病灶部位的抗菌作用。

说明书

技术领域

本发明涉及兽用药领域，具体涉及一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物及其制备方法和应用。

背景技术

聚合物材料的研制和开发是各国学者多年来致力开展的热门课题。离子辐照会导致材料微观结构和宏观性能发生变化, 因而被用于改造聚合物材料的研究工作中。早期主要使用低电离辐射的粒子(如γ射线、电子等)作辐照源。研究发现，辐照在聚合物中产生的效应主要有分子键的断裂和交联、气体分子的释放以及新化学键形成等，分子键的断裂和交联改变材料的分子量及其分布, 从而影响材料的宏观性能。一般来说, 分子链的交联使分子量增加, 导致生物材料的可溶性降低, 吸收度降低。低电离辐射引发的这些现象已得到很好的研究, 并有相当广泛的商业应用。重离子在物质中主要以使靶原子的电子电离和激发的方式损失能量, 和低电离辐射粒子不同的是, 重离子具有很高的电子阻止本领(线性能量转移值LET )。这就使得重离子辐照引起电荷转移及能量沉积, 从而当离子穿越介质时, 沿其路径就会留下一个连续的柱状电离区域，故就产生交联并且可形成稳定的复合体，而又不会造成生物的活性损失，这种效应为研究生物医药中的复合体通过一种手段。

金丝桃素（Hypericin）为藤黄科金丝桃属植物贯叶连翘（Hypericum perforatum Ｌ．）的主要活性成分物质，其结构属萘骈二蒽酮类化合物。金丝桃素在体内、体外均有逆转病毒的作用，具有极强的抗病毒、抗菌、抗炎作用，能激活单核吞噬细胞，增强家禽机体免疫力。

自中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所通过对金丝桃素进行提取、化学合成与在兽医临床上的应用进行了研究，使产品在畜禽疾病应用越来越广泛。通过体内外临床试验，对大肠杆菌引起的仔猪黄痢、白痢和鸡白痢的治愈率达到95%以上。靶向制剂亦称靶向给药系统(targeting drug system , TDS ortargeted drug delivery system ,TDDS), 是一类能使药物浓集定位于病变组织、器官、细胞或细胞内结构的新型给药系统。靶向治疗可使治疗部位的药物浓度明显提高, 可减少用药量并使治疗费用降低, 减少药物对全身的毒副作用。靶向制剂目前主要应用于人类治疗癌症药物中, 在兽医临床尚未见有关报道。发明人将中药有效成分金丝桃素与抗体及乙二醇，通过重离子辐照进行交联结合,构建“生物导弹”,对病原菌实施“精确打击”的研究,本发明的结果表明，低剂量的碳离子辐照可引起生物分子的交联，并对其结构与活性不受影响，利用重离子交联技术为生物分子交联提供了新的途径。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物，是通过以下步骤制备得到的：

1）将金丝桃素白蛋白纳米粒和兔抗大肠杆菌混合，得到混合液；

2）将步骤1）得到的混合液加入至乙二醇中，得到乙二醇混液；

3）将步骤2）得到的乙二醇混液以碳离子进行辐照，辐照后于-2⁰ C -5⁰ C放置2h，得到辐照后混合液；

4）将步骤3）得到的辐照后混合液进行低温离心，弃除上清液后，将沉淀冷冻干燥后即可得到金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物。

进一步的，上述的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物，所述步骤1）中，金丝桃素白蛋白纳米粒和兔抗大肠杆菌是按照（800-1600）mg：（4-10）μg进行混合的。

进一步的，上述的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物，所述步骤2）中，乙二醇的使用量为金丝桃素白蛋白纳米粒：乙二醇为（800-1600）mg：（12-30）g。

进一步的，上述的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物，所述步骤3）中，碳离子辐照剂量为3-10Gy。

进一步的，上述的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物，所述步骤4）中，低温离心温度为-2⁰ C -5⁰ C，离心转速为16500r/min，沉淀冷冻温度为-2-0℃。

进一步的，上述的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物，所述步骤1）中，金丝桃素白蛋白纳米粒和兔抗大肠杆菌是按照1600mg：4μg进行混合的；所述步骤2）中，乙二醇的使用量为金丝桃素白蛋白纳米粒：乙二醇为1600mg：12g；所述步骤3）中，碳离子辐照剂量为5Gy，放置温度为0⁰ C；所述步骤4）中，低温离心温度为0⁰ C，离心转速为16500r/min，沉淀冷冻温度为-1℃。

本发明的第二个目的是提供了一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物的制备方法，包括以下步骤：

1）将金丝桃素白蛋白纳米粒和兔抗大肠杆菌混合，得到混合液；

2）将步骤1）得到的混合液加入至乙二醇中，得到乙二醇混液；

3）将步骤2）得到的乙二醇混液以碳离子进行辐照，辐照后于-2⁰ C -5⁰ C放置2h，得到辐照后混合液；

4）将步骤3）得到的辐照后混合液进行低温离心，弃除上清液后，将沉淀冷冻干燥后即可得到金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物。

进一步的，上述的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物的制备方法，所述步骤1）中，金丝桃素白蛋白纳米粒和兔抗大肠杆菌是按照（800-1600）mg：（4-10）μg进行混合的；所述步骤2）中，乙二醇的使用量为金丝桃素白蛋白纳米粒：乙二醇为（800-1600）mg：（12-30）g；所述步骤3）中，碳离子辐照剂量为3-10Gy；所述步骤4）中，低温离心温度为-2℃-5℃，离心转速为16500r/min，沉淀冷冻温度为-2-0℃。

进一步的，上述的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物的制备方法，所述步骤1）中，金丝桃素白蛋白纳米粒和兔抗大肠杆菌是按照1600mg：4μg进行混合的；所述步骤2）中，乙二醇的使用量为金丝桃素白蛋白纳米粒：乙二醇为1600mg：12g；所述步骤3）中，碳离子辐照剂量为5Gy，放置温度为0℃；所述步骤4）中，低温离心温度为0℃，离心转速为16500r/min，沉淀冷冻温度为-1℃。

本发明的第三个目的是提供了上述一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物在制备大肠杆菌靶向药物中的应用。

表1显示为兔抗血清与金丝桃素白蛋白纳米粒结合条件的筛选。用微量移液管按照表1的剂量将金丝桃素白蛋白纳米粒和兔抗大肠杆菌血清抗体加入到准备好的小离心管中,加样后,并充分的摇匀，在电子天平上按表1称取适量的乙二醇，将金丝桃素白蛋白纳米粒、兔抗大肠杆菌血清抗体分成不同的比例,按照表1中的数据分成六个不同的剂量组。将各管充分摇匀, 反应温度（-2⁰ C -5⁰ C），控制在室温（3-10Gy）辐照交联，pH控制为中性，将偶联时间定为2，回收沉淀。结果发现, 金丝桃素白蛋白纳米粒(mg):兔抗血清(μg):乙二醇(g)以1600:4:12:5的浓度比获得了收率最大的沉淀物，收率达77.19%，此时，沉淀物10499mg；以1600:4:18:10的浓度比获得了最大质量的沉淀物，沉淀物质量为11195mg。考虑到成本及药物的含量等情况，确定1600:4:12:5的浓度比为最佳比。

金丝桃素白蛋白纳米粒的制备见专利申请《一种金丝桃素白蛋白纳米粒的制备方法》（申请号：CN201210020213.1，公开号CN102525937B）。

表1

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本发明通过碳离子辐照将乙二醇生成聚乙二醇，并成功与金丝桃素白蛋白纳米粒、大肠杆菌血清抗体偶联, 制备出专一针对大肠杆菌的兽用靶向金丝桃素白蛋白纳米粒复合物，由大肠杆菌血清抗体寻找和捕捉大肠杆菌, 由金丝桃素抑制和杀灭大肠杆菌, 使其对大肠杆菌进行“精确打击”, 以此增强金丝桃素的靶向抗菌效果。其中，金丝桃素与抗体的结构如图1和图2所示。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物及其制备方法和应用，通过抑菌试验及临床药效试验，证明该靶向复合物较原药的效果大大提高，由大肠杆菌血清抗体寻找和捕捉大肠杆菌，由金丝桃素白蛋白纳米粒抑制和杀灭大肠杆菌，使其对大肠杆菌进行“精确打击”, 以此增强金丝桃素白蛋白纳米粒在鸡病灶部位的抗菌作用。

附图说明

图1为金丝桃素结构图。

图2为抗体结构图。

图3为聚丙烯酞胺凝胶电泳(PAGE)电泳结果图。

其中，泳道M：蛋白Marker；泳道1：金丝桃素白蛋白纳米粒与金丝桃素的混合物；泳道2：金丝桃素白蛋白纳米粒；泳道3：金丝桃素白蛋白纳米粒与金丝桃素及聚乙二醇的混合物；泳道4：金丝桃素；泳道5：聚乙二醇；泳道6：兔抗血清；泳道7：兔抗血清和药物及结合物的混合物；泳道8：靶向结合物。

具体实施方式

实施例1：

一种金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物，由以下质量的各组分组成：1600mg金丝桃素白蛋白纳米粒，4μg兔抗血清，12g乙二醇。

其制备方法，包括以下步骤：

按比例称取金丝桃素白蛋白纳米粒（含金丝桃素1600mg）, 加入到含兔抗血清4μg的4-10ml大肠杆菌兔血清抗体（购自上海抚生实业有限公司）中, 再加入12g乙二醇，按无菌操作法,18-20⁰C下，搅拌匀速，进行重离子辐照, 辐照后于4⁰C冰箱中放置2h后, 通过冷冻离心机（湖南湘仪：H1650R台式高速冷冻离心机，16500r/min，-2⁰C）分离，弃去上清液, 将沉淀冷冻干燥后即制得靶向金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物。

实施例2：

具体实施方式与实施例1相同，所不同之处在于：

靶向金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物由以下质量的各组分组成：800mg金丝桃素白蛋白纳米粒，4μg兔抗血清，30g乙二醇。

其制备方法与实施例1相同。

实施例3：

具体实施方式与实施例1相同，所不同之处在于：

靶向金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物由以下质量的各组分组成：1200mg金丝桃素白蛋白纳米粒，6μg兔抗血清，15g乙二醇。

其制备方法与实施例1相同。

实施例4：

具体实施方式与实施例1相同，所不同之处在于：

靶向金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物由以下质量的各组分组成：1000mg金丝桃素白蛋白纳米粒，4μg兔抗血清，18g乙二醇。

其制备方法与实施例1相同。

实施例5：

碳离子辐照制备金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物：

要构建针对细菌的抗体靶向药物,使抗体能携带药物向细菌主动移行,就必须将抗体和药物结合在一起,形成复合物,并且复合物要具有一定的稳定性。同时,抗体与药物的结合也不能发生化学反应,破坏抗体的生物学活性和药物的抗菌作用,以保证抗体的靶向作用和药物的抗菌作用。因此建立科学的抗体与药物结合方法至关重要，本发明以乙二醇为偶联物原料,将大肠杆菌血清抗体与金丝桃素白蛋白纳米粒通过重离子辐照交联, 乙二醇形成聚乙二醇并将大肠杆菌血清抗体与金丝桃素白蛋白纳米粒结合成复合物。

1、实验材料：

大肠杆菌兔血清抗体：购自上海抚生实业有限公司；

金丝桃素白蛋白纳米粒（自制）；

金丝桃素：上海瀚香生物科技有限公司（含量98%）；

乙二醇：天津试剂一厂（AR）。

2、重离子加速器：

中国科学院近代物理研究所兰州重离子加速器国家实验室提供辐照所需的束流。

3、制备方法：

表2显示为血清抗体与金丝桃素白蛋白纳米粒结合条件的筛选，选择兔抗血清、乙二醇和金丝桃素白蛋白纳米粒有效结合方法抗体、乙二醇和金丝桃素白蛋白纳米粒结合条件的筛选：用微量移液管按照表2的剂量将金丝桃素白蛋白纳米粒和抗体血清加入到准备好的小离心管中,加样后,并充分的摇匀。在电子天平上按表2称取适量的乙二醇、将金丝桃素白蛋白纳米粒、乙二醇和兔抗大肠杆菌血清分成不同的比例,按照表2中的数据分成六个不同的剂量组。

表2

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将各管充分摇匀,在重离子加速器辐照后，并放入4℃的恒温箱中作用24h,然后取出观察沉淀的多少。

4、检测抗体、乙二醇和金丝桃素白蛋白纳米粒结合及其稳定性：

PAGE电泳：配制10%分离胶,5%浓缩胶。电泳样品为抗体、复合物、混合物等,每泳道加样品20μL。

5、结果与分析：

本发明主要是利用特异性的抗原一抗体的免疫学反应,将猪大肠杆菌兔抗血清抗体的特异性靶向作用与金丝桃素白蛋白纳米粒的杀菌作用相结合,构建靶向金丝桃素白蛋白纳米粒,从而使药物金丝桃素白蛋白纳米粒能精确的到达相应的病变部位,抑杀大肠杆菌,从而既能达到最佳的治疗效果又能最大限度降低药物的使用量。结果发现, 金丝桃素白蛋白纳米粒(mg):兔抗血清(μg):乙二醇(g)以1600:4:18:10的浓度比获得了最大质量的沉淀物。

本发明通过碳离子辐照乙二醇，形成聚乙二醇，可以使大肠杆菌血清抗体与金丝桃素白蛋白纳米粒复合物沉淀,从而从溶液中分离出来,大大减少了结合物中游离的乙二醇分子和游离的金丝桃素白蛋白纳米粒分子。抗体蛋白与金丝桃素白蛋白纳米粒和乙二醇的偶联并不仅仅是简单的混合,而是通过辐照交联形成了一种较为稳定的结构。

本发明将抗体蛋白与金丝桃素白蛋白纳米粒结合复合物的聚丙烯酞胺(PAGE)电泳的结果与抗体的聚丙烯酞胺(PAGE)电泳的结果及抗体蛋白与金丝桃素白蛋白纳米粒和PEG的混合物的聚丙烯酸胺(PAGE)电泳的结果进行了比较,靶向复合物的聚丙烯酞胺(PAGE)电泳的结果中出现了新的电泳条带,证明抗体蛋白与金丝桃素白蛋白纳米粒和乙二醇是以一定的方式结合,改变了些蛋白的分子量。

实施例6：

大肠杆菌血清抗体与乙二醇和金丝桃素白蛋白纳米粒复合物的的体外抗菌试验：

金丝桃素为金丝桃属植物中常见的抗病毒物质,属二蒽酮类。植物化学和药理学研究发现,金丝桃素具有抗抑郁、抗肿瘤、抗病毒、止血消炎及光动活性等特点。目前关于金丝桃素的研究,国内多处于药理临床研究阶段,主要集中于肿瘤的辅助治疗和抗病毒研究方面,国外现已将其用于抑郁症、艾滋病等的临床治疗。金丝桃素还在畜牧业上有了一些研究工作:可用于猪高热病、猪繁殖与呼吸系统综合症、伪狂犬病、猪瘟、传染性胃肠炎、猪细小病毒病等疾病单纯性感染或混合感染的预防和治疗；对高致病性的 H5N1 和 H9N2 亚型禽流感病毒有极强的杀灭作用。由中国农科院兰州畜牧兽医研究所研制的金丝桃素新制剂,经权威机构检测,对高致病性禽流感病毒最后杀灭率可达百分之百。因此,金丝桃素及其新制剂一直是国内外研究开发的热点,是寻找有开发应用前景的生物活性成分的源泉。金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物的抑菌作用研究尚未见报道。为了探索金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物的抑菌作用,使用了金丝桃素对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果进行了体外试验研究,对进一步探索金丝桃素的药理作用具有重要意义。

拟利用不同浓度梯度的金丝桃素白蛋白纳米粒-大肠杆菌血清抗体复合物测定对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC),确定该药新制剂与原药的抗菌作用比较。

1、材料与方法：

1.1 试验材料标准菌种:

菌种：大肠杆菌（E.coil）C₄₄₀₃；金葡菌(staphylococcus.aureus)C₂₆₁₁₂均购自甘肃省微生物研究所。

试剂：吡啶、氯化钠、氢氧化钠,均为分析纯,金丝桃素（上海瀚香生物科技有限公司 含量98%），靶向金丝桃素（自制）。蛋白胨、琼脂粉、牛肉膏为常用生化级试剂。

1.2 第一组试验方法：

1.2.1 培养基的制备：

(1)固体培养基的制备：

胰蛋白胨 5g、氯化钠 5g、酵母粉 2.5g、琼脂 7.5g-10g、蒸馏水500ml，pH：7.2-7.4，121℃灭菌 20min。

(2)液体培养基的制备：

胰蛋白胨 5g、氯化钠 5g、酵母粉 2.5g、蒸馏水500ml，pH：7.2-7.4，121℃灭菌 20min。

1.2.2 菌液制备：

用接种环挑取冷藏保存好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落各少量,分别悬浮于普通液体培养基中,37℃复苏 24h,然后划线接种于普通液体培养基上,37℃培养至细菌达到生长平衡期,选择典型的菌落传代 2至3代,待活力恢复后,挑选典型菌落,接种于普通琼脂平板培养基上,取典型菌落接种于液体培养基中,37℃培养18h 备用。

1.2.3 供试药液的制备：

称取药物,根据靶向金丝桃素及金丝桃素含量，计算称取加灭菌的吡啶溶液 500ml 配置成含金丝桃素浓度是51.2μg/ml液体。

1.2.4 靶向金丝桃素及金丝桃素最低抑菌浓度测定：

采用二倍稀释法测定药液对各供试菌的最小抑菌浓度(MIC)。取灭菌有棉塞的试管 10 支,编号,每管先加入无菌肉汤培养基 2.0ml,然后于第一支试管中加入配置好的含金丝桃素 51.2μg/ml 的药液 2.0ml,混合均匀后取出 2.0ml 放入第二个试管中,依此类推做倍比稀释,直到第八支试管取出 2.0ml 弃去,八支试管的药液浓度分别是 25.6μg/ml、12.8μg/ml、6.4μg/ml、3.2μg/ml、1.6μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml、0.2μg/ml。第九支试管不加药剂加菌液做为阳性对照,第十支试管不加药剂不加菌液做为阴性对照。各管平行 3 份,经液体培养基培养 18h 的试验菌液用无菌液体培养基稀释 100 倍。取细菌稀释液 0.1ml 分别加入上述 1 至 9 试管中混合均匀,10 号试管加入 0.1ml 灭菌生理盐水,置各试管于恒温培养箱中培养24h,观察结果。在阳性对照管细菌生长呈浑浊状,而阴性对照管无细菌生长呈透明状的前提下,观察其它试管的浑浊情况。如试管内浑浊,说明有细菌生长;如试管内澄清透明,证明无细菌生长。眼观察选出无细菌生长的各管,分别取其液体涂布于琼脂平板培养基上,于恒温培养箱培养 24h,观察结果。琼脂平板上无细菌生长而含药液浓度最低者,即为该药物对该菌株的最低抑菌浓度。

1.2.5 制备营养琼脂培养基：

根据用量按比例配制:琼脂 2%,牛肉膏 0.5%,蛋白胨 1%,氯化钠 0.5%依次称取成分,牛肉膏常用玻璃棒挑取,放在小烧杯或培养皿纸片中称量,用热水溶化后倒入烧杯。在烧杯中加入少于所需要的水量,加热,逐一加入各成分,使其溶解,琼脂在溶液煮沸后加入,融化过程需不断搅拌。溶好后,补足所需水分。用 4% NaOH 把 pH 调至 7.4-7.6。按试验要求,可将配制的培养基分装培养皿内,冷凝后用牛皮纸包扎,121℃高温流通蒸汽灭菌 15min。

1.3 第二组试验方法：

1.3.1 培养基的制备：

(1)固体培养基的制备：

胰蛋白胨 5g、氯化钠 5g、酵母粉 2.5g、琼脂 7.5g-10g、蒸馏水500ml，pH：7.2-7.4，121℃灭菌 20min。

(2)液体培养基的制备：

胰蛋白胨 5g、氯化钠 5g、酵母粉 2.5g、蒸馏水500ml，pH：7.2-7.4，121℃灭菌 20min。

1.3.2 菌液制备：

用接种环挑取冷藏保存好的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌菌落各少许,分别悬浮于普通液体培养基中,37⁰C复苏 24h,然后划线接种于普通液体培养基上,37℃培养至细菌达到生长平衡期,选择典型的菌落传代 2 至 3 代,待活力恢复后,挑选典型菌落,接种于普通琼脂平板培养基上,37℃培养 28h,取典型菌落接种于液体培养基中,37℃培养 18h 备用。

1.3.3 靶向金丝桃素及金丝桃素最低抑菌浓度测定：

采用二倍稀释法测定药液对各供试菌的最小抑菌浓度(MIC)。取灭菌有棉塞的试管 10 支,编号,每管先加入无菌肉汤培养基 2.0ml,然后于第一支试管中培养基表面,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种的培养皿各 20个,分成二组,每组 10 个培养皿。接种金黄色葡萄球菌的二组培养皿分别放入以吡啶为溶剂配制浓度是 6.4μg/ml、12.8μg/ml、25.6μg/ml 的金丝桃素药液与靶向金丝桃素药液试管,接种大肠杆菌的二组培养皿分别放入用吡啶配制浓度是 3.2μg/ml、6.4μg/ml、12.8μg/ml 的靶向金丝桃素药液与金丝桃素药液试管。37℃恒温培养箱中培养 24h。

2、结果：

2.1 金丝桃素药液与靶向金丝桃素药液最低抑菌浓度测定结果：

2.1.1金丝桃素药液与靶向金丝桃素药液对两种菌的最小抑菌浓度：

金丝桃素药液与靶向金丝桃素药液对大肠杆菌最低抑菌浓度试验如表3所示。

表3

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靶向金丝桃素及金丝桃素对金黄色葡萄球菌最低抑菌浓度试验如表4所示。

表4

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选择澄清的各试管分别取其液体涂布于琼脂平板培养基上,在恒温培养箱培养 24h,记录下平板上无细菌生长的各试管编号,得出最低抑菌浓度。

靶向金丝桃素及金丝桃素对两种菌最低抑菌浓度确定如表5所示。

表5

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通过上表所列数据可以反映出,金丝桃素对大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.4μg/ml,而金丝桃素对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为 0.8μg/ml,大肠杆菌的敏感性高于金黄色葡萄球菌。

3、讨论：

金丝桃素为金丝桃属植物中常见的活性物质,属二蒽酮类,该属植物分布很广泛。依据近代植物化学和药理学研究,金丝桃素在抗抑郁、治疗艾滋病、止血消炎等方面有明显疗效。临床应用广泛,近年来虽然在药理学研究方面做了大量工作并取得一定成果,但对革兰氏阴性菌、阳性菌抑菌作用研究尚未见报道,因此本发明以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为研究对象,测定靶向金丝桃素及金丝桃素对这两种菌的最低抑菌浓度并比较不同药物浓度之间抑菌效果,对了解靶向金丝桃素及金丝桃素有无抑菌作用、抗菌效果如何,确定金丝桃素的用药剂量和研究抗菌机理等方面具有重要意义。通过实试验可以看出无论是对大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌, 金丝桃素敏感度远低于靶向金丝桃素。对大肠杆菌的敏感度大体一致,对金黄色葡萄球菌则略低一点。

实施例7：

大肠杆菌血清抗体与乙二醇和金丝桃素白蛋白纳米粒复合物的的药效学验证：

大肠杆菌病是一种家禽常见病和多发病,对养禽业危害非常严重,该病在各国流行日趋严重,并导致巨大的经济损失。鸡大肠杆菌病(Chicken Colibacillosis)是由埃希氏大肠杆菌(Echerlchia coli,E.coil)的某些血清型引起的一种常见细菌性传染病,包括E.coli性肉芽肿、腹膜炎、输卵管炎、脐炎、滑膜炎、气囊炎、眼炎、卵黄性腹膜炎等疾病。鸡大肠杆菌病主要发生在雏鸡和成年产蛋鸡产蛋阶段,尤其对高峰产蛋鸡的危害严重。该传染病的发病率为11%-69%；死亡率为3.8%-72.9%；致死率为40.2%-90.3%。近年来,几次鸡大肠杆菌病的大爆发,给世界养禽业造成了严重的经济损失。鸡大肠杆菌病越来越引起了各国家政府、研究工作者以及养禽专业户的高度重视。我国大部分地区的养禽企业或专业户仍都采用抗菌药物进行预防和治疗。由于抗菌药物长期滥用,使得鸡E.coil流行株对多种抗菌药物产生了广泛的耐药性,长期使用高效抗生素,终会导致耐药菌株的产生。不仅抗菌药物防治效果差,耐药菌株增多,而旦耐药谱也不断加宽，同时，抗菌素药物残留问题也日渐突出。

1、材料和方法：

1.1材料：

1.1.1金丝桃素（上海瀚香生物科技有限公司，含量98%），靶向金丝桃素（自制）。将以上二种原料配制含金丝桃素为10%的制剂。

1.1.2标准菌种：

大肠杆菌（E.coil） C₄₄₀₃，

巴氏杆菌(pasteurella.multocid)C_44-1，

金葡菌(staphylococcus.aureus)C₂₆₁₁₂，

均购自甘肃省微生物研究所。

1.1.3实验动物：

健康昆明系小白鼠100只,雌、雄各半,体重18-22g,购于兰州大学实验动物部、实验室温度控制在18-22℃,相对湿度40-70%,保持室内通风良好,雌雄分笼饲喂,笼底垫料为刨木花屑,经日光暴晒后使用,隔日清扫鼠笼一次,更换垫料并消毒鼠笼,饲料为中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所小动物实验室提供的全价营养固体颗粒鼠饲料,其中含蛋白质约21%,自由采食饲料,自由饮水。

1.1.4患病家禽：

病鸡来甘肃临洮某养鸡场,病鸡为45日龄肉鸡，症状表现为:下痢,羽毛蓬松,精神不振,食欲差,有较高的死亡率。剖检病变:腹膜混浊,体腔中有大量干酩徉渗出物,脏器粘连。

1.1.5大肠杆菌血清抗体一金丝桃素白蛋白纳米粒复合物（靶向复合物）：自制,含金丝桃素10g/mL的透明溶液,备用。

1.1.6大肠杆菌血清抗体：自制,间接ELISA效价为1:1024。

1.1.7荧光抗体:购自北京鼎国生物技术发展中心，批号Y2300141。

1.1.8培养基和溶液：

(1)体外抑菌及微生物学诊断试验材料:

营养肉汤、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂、含糖发酵培养基、三糖铁培养基(TSI)、VP试剂(甲液: α-萘酚酒精溶液(α-萘酚5g,无水酒精100mL),乙液:KOH溶液(KOH 40g,水1O0mL)。将甲液和乙液分别装于棕色瓶中,于4-10℃保存)均按常规方法配制。

(2)莫法兰德浊度计的制备:制备标准硫酸钡悬液,并进行比浊判定。

(3)间接免疫荧光试剂:pH7.4，0.1M磷酸缓冲液。

1.2方法：

1.2.1靶向复合物治疗鸡大肠杆菌病：

免疫荧光技术快速诊断：

无菌采取不同的有大肠杆菌病症状和病变鸡的粪便或病死鸡肠内容物,加灭菌生理盐水作1：5稀释,静置,作为病料。将处理后的病料经腹腔接种小白鼠,0.5ml/只。将小白鼠放置动物暂养室喂养,提供充足的水和饲料,观察小白鼠。待小白鼠死亡后,将小白鼠解剖,取其肝脏、研磨,以1:5的比例加生理盐水稀释,静置5分钟,取上清夜,以上清夜:血清抗体=4:1的比例与靶向复合物充分混合后开始计时,于10min时开始涂片,用接种环勾取混合液,干燥后用丙酮固定,再加荧光抗体稀释染色,干燥后于荧光显微镜下观察。

靶向复合物治疗鸡大肠杆菌病:

试验鸡分组:将发病鸡群分成4组,每组50羽并作好标记,各组采用不同药物治疗。

采用肌肉注射,在饲料和饮水中不再添加任何药物,各治疗组给药及给药方法:

各治疗组给药及给药方法如表6所示。

表6

。

给药后症状观察:仔细观察和一记录各组鸡的临床变化和死亡情况。

评价标准：

治愈:用药一个疗程后鸡停止死亡,精神食欲正常。

有效:用药一个疗程后,停止死亡,精神好转,食欲增加。无效:用药一个疗程后,主要症状无改善或病情加剧。

2、结果与分析：

2.1复合物大肠杆菌动物模型治疗：

大肠杆菌病动物模型治疗效果显示:与对照组金丝桃素相比较,用靶向高浓度金丝桃素复合物注射液每次肌注1.0mL/只,一次用药后的有效率、治愈率分别为100%和90%；用中等浓度复合物注射液每次肌注1.0mL/只,一次用药后的有效率、治愈率分别为100%和75%；用低浓度结合物注射液每次肌注1mL/只,一次用药后的有效率为100%,治愈率为65%。而金丝桃素对照组用金丝桃素注射液每次肌注1.0mL/只,发病小白鼠有效率为90%,治愈率为33.3%。大肠杆菌血清（抗体）对照组也治疗无效。原药与靶向药物小白鼠大肠杆菌病的疗效，即大肠杆菌病动物模型治疗效果如表7所示。

表7

。

2.2复合物治疗鸡大肠杆菌病：

间接免疫荧光快速诊断:通过间接免疫荧光快速诊断,可以确定该病的病原是致病性大肠杆菌。结合临诊症状观察和剖检观察,该病可以确诊为鸡大肠杆菌病。

各组药物治疗鸡大肠杆菌病:靶向复合物各剂量组给药ld,病鸡病症均明显减轻,靶向高剂量组第2d鸡停止死亡,鸡的食欲和精神基本恢复；靶向中剂量组治疗效果与高剂量组的治疗效果基本一致；靶向低剂量组第2d鸡停止死亡,腹泻症状基本消失,鸡的食欲与精神状态第3d也基本恢复。金丝桃素组给药第2d症状开始减轻,到第4d腹泻症状基本消失,食欲和精神状态到第5d恢复。从上表数据可以看出:靶向复合物结合物注射液高、中、低三种剂量对鸡大肠杆菌病疗效显著,有效率和治愈率分别为100%,100%,92%；而金丝桃素组的有效率和治愈率分别为80%。就症状变化情况看,靶向金丝桃素结合物各剂量组给药后腹泻症状改善速度和鸡的精神状态恢复速度较快,和金丝桃素组相比能更快地改善鸡腹泻症状和恢复鸡的精神状态。原药与靶向药物对鸡大肠杆菌病的疗效统计结果如表8所示。

表8

。

2.3分析：

复合物对鸡大肠杆菌病治疗结果显示,靶向复合物各剂量组给药1d，病鸡病症均明显减轻, 靶向高剂量组第2d鸡停止死亡,鸡的食欲和精神基本恢复； 靶向中剂量组治疗效果与高剂量组的治疗效果基本一致；靶向低剂量组第2d鸡停止死亡,腹泻症状基本消失,鸡的食欲与精神状态第3d也基本恢复。金丝桃素对照组给药第2d症状开始减轻,到第4d腹泻症状基木消失,食欲和精神状态到第5d恢复。从上表数据可以看出:靶向复合物注射液高、中、低三种剂量对鸡大肠杆菌病疗效显著。就症状变化情况看,靶向复合物各剂量组给药后腹泻症状改善速度和鸡的精神状态恢复速度较快,和金丝桃素组相比能更快地改善鸡腹泻症状和恢复鸡的精神状态。从免疫荧光技术快速诊断后，取小鼠血清抗体与靶向复合物充分混合后开始计时,染色,干燥后于荧光显微镜下观察。可得出以下结论：大肠杆菌血清抗体是血清多抗,能和各型大肠杆菌结合。因此,复合物的靶向性是大肠杆菌特异性的,但能治疗各种动物的大肠杆菌病。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。