含有降血糖活性成分的长效控释脂质体凝胶组合物及其制备方法

摘要

本发明提供了含有胰岛素或艾塞那肽作为降血糖活性成分的皮下注射长效控释脂质体凝胶组合物及其制备方法。所提供的控释组合物具有高生物利用度并表现出在一段时间内以有效的药物浓度持续释放，而不会出现过高的初始快速释放。本发明的注射控释剂型的制备方法包括下述步骤：混合胰岛素或艾塞那肽、脂质和水性分散介质后，再与泊洛沙姆(如F127或P123等)和/或明胶、透明质酸(HA)等凝胶溶液混合，从而在每个脂质微米囊或纳米囊表面形成保护层，以进行肌肉注射、腹部注射或皮下注射给药，使得一次注射可维持达2至7天的有效期，降低疼痛和刺激性等副作用。

说明书

技术领域

本发明涉及含有胰岛素或艾塞那肽等降血糖活性成分的长效控释脂质体凝胶组合 物及其制备方法。

背景技术

胰岛素临床应用于治疗糖尿病数十年，其是由胰脏内的胰岛β细胞分泌的一种蛋 白质激素胰岛素；并参与调节糖代谢，控制血糖平衡。第一代动物胰岛素的抗原性较 强，哺乳动物的胰岛素分子的氨基酸序列和结构稍有差异，而猪胰岛素与人最相似 【Baker,EN,Blundell,TL,et al.The structure of Zn2+pig insulin crystals at1.5A  resolution.Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.1988.319:369-456】。第二代人胰岛素分 子量为5,808道尔顿，注射量可减少约30%；人胰岛素比较稳定，其在常温25℃左右 可保存约一个月，并且据报道注射需在餐前30分钟进行。胰岛素类似物是第三代胰岛 素，模拟人体生理降糖模式，可紧临餐使用，也称为餐时胰岛素或速效胰岛素。

激动胰岛β细胞先分泌由84个氨基酸组成的胰岛素原(Proinsulin)，并且在胰岛素原 转化酶(PC1和PC2)和羧肽酶E的作用下，胰岛素原C链被切割，使得胰岛素原的羧基端 A链和氨基端B链通过二硫键结合在一起形成胰岛素。胰岛素储存在胰岛β细胞内的分 泌囊泡中，并与锌离子配位成六聚体。在葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素 等刺激下胰岛素从分泌囊泡释放至血液中，并发挥其生理作用。维持空腹血糖正常的 胰岛素称为基础胰岛素，而降低餐后血糖以维持餐后血糖正常的胰岛素称为餐时胰岛 素。餐时胰岛素抑制肝内源性葡萄糖的生成而控制餐后血糖升高的幅度和时间 【Mitrakou A,Kelley D,Veneman T,et al.Contribution of abnormal muscle and liver  glucose metabolism topostprandial hyperglycemia in NIDDM.Diabetes1990;39:1381-90】。 这样，血糖在任何时间都被控制在接近空腹状态的水平；并且餐后血糖水平高于5.5 mmol/L的时间不超过30分钟【Boehm B,Home P,Behrend C,et al.Premixed insulin aspart 30vs.premixed human insulin30/70twice daily:a randomized trial in type1and type2 diabetic patients.Diabet Med2002；19:393-399】。I型糖尿病患者胰岛β细胞发生自身免 疫性破坏，导致餐时和基础胰岛素分泌均减少。II型糖尿病患者胰岛β细胞功能异常低 效，胰岛素分泌减少【Bell DS.Importance of postprandial glucose control.South Med J 2001;94:804-9】，且有胰岛素抵抗现象，因而空腹血糖正常而餐后血糖升高持续数小 时至下一餐前【Polonsky KS,Given BD,Hirsch LJ,et al.Abnormal patterns of insulin  secretion in non-insulindependent diabetes mellitus.N Engl J Med1988;318:1231-9】。目 前治疗II型糖尿病的胰岛素及其类似物制剂有诺和灵N、诺和锐等。I型糖尿病的治疗多 用持续脉冲式胰岛素泵释放的胰岛素制剂维持空腹血糖的正常。在生活方式和口服糖 尿病治疗后，血糖仍不能有效控制，大多很快转向选择基础胰岛素类似物地特胰岛素 治疗。

艾塞那肽(Byetta/Exenatide)是一种强效促胰岛素分泌药，用于II型糖尿病(T2DM) 的血糖控制，尤其是用于二甲双胍、磺酰脲类及二甲双胍合用磺酰脲类都难以控制血 糖的患者。艾塞那肽较能抵抗蛋白水解酶Ⅳ(二肽酰胺酶Ⅳ)的降解，半衰期约为2分钟， 较哺乳动物胰高血糖素样多肽-1(GLP-1)长【Pridal,et a1.,Eur.J.Drug.Metab. Pharmacokinet.,21:51-59,1996；Deacon,et al.,Diabetes,47:764-769，1998】；氨基酸 序列与GLP-1的相似性达53%【Goke,et a1.,J.Biol.Chem.,268:19650-19655，1993】； 能够激动GLP-1受体，抗糖尿病作用与GLP-1受体结合有关，且作用与GLP-1类似。艾 塞那肽还能增强葡萄糖依赖性的胰岛素的分泌和抑制葡萄糖依赖性的异常增高的胰高 血糖素的分泌、减慢胃排空【Schira,et a1.,J.Clin.Inves t.,97:92-103,1996】、减少食 物摄入、促进β-细胞增殖和再生、减少脂肪堆积及胰岛素增敏作用(动物模型)。吉拉毒 蜥的艾塞那肽-4具有长时间降低血糖的效果【Greig et a1.,Diabetologia42:45-50, 1999】。当它以0.2μg/kg或更高剂量皮下注射时，会产生呕吐、恶心和头痛等副作用【Drug  Development Research,53:260-267,2001】。

控制初始血药浓度、限制初始释放是研发艾塞那肽控释制剂的一大屏障之一。美 国专利US7,164,005和US2005/0271702以及中国专利申请CN101646424A公开了使用聚 (乳酸-共-乙醇酸)共聚物(PLGA)通过相分离法制备含有艾塞那肽的脂质凝胶纳米囊。其 制备方法包括相分离法、喷雾干燥法等。除此以外，中国专利申请CN102274182A公开 了使用复乳溶剂蒸发法制备艾塞那肽多囊脂质体，此方法虽然皮下一次注射艾塞那肽 多囊脂质体剂量可控制大鼠血糖水平达七天，但该方法不但引入有机溶剂且处方复杂， 可能会对皮肤产生刺激性，更重要的是该专利多囊脂质体粒径为5～50μm。J.Senior等 【J.Senior,M.Radomsky,Sustained-Release Injectable Products,1st ed.,Interpharm/CRC, New York,2000】指出，如果脂质体的粒径越大，其皮下释放就越缓慢。但已有文献【陈 亭亭、陆伟根，多囊脂质体的应用现状。临床用药；2007（28）170-173】指出多囊脂 质体粒径大，不能静脉给药，其在贮存过程出现的沉降和聚集尚未得到解决，可能影 响制剂的稳定性，且目前开发的多囊脂质体产品为混悬液，不便于保存和运输；此外， 多囊脂质体的制备对生产条件要求比较苛刻，不易扩大生产，这也使其发展受到一定 的限制。美国食品药品监督管理局(FDA)于2012年1月27日批准每周一次注射的艾塞那 肽缓释型注射液上市(Bydureon/Exenatide)，每周注射一次用于II型糖尿病的辅助治疗。 然而，美国FDA要求制药公司(Amylin)建立一个严重低血糖风险以及甲状腺髓样癌 (MTC)和急性胰腺炎病例连续注册系统，检测美国由此引发癌症的年发生率至少15年， 并制订一套危险评估和减轻策略(REMS)。

除胰岛素计算器控制泵外，胰岛素泵还需要胰岛素储存器、接管、特殊注射针和 粘贴材料等，且针头和接管需经常更换，以防感染和堵塞；其价格昂贵从而未纳入医 疗保险，多为患者自费。在胰岛素泵中使用的胰岛素浓度是100单位/毫升，其与人胰岛 素笔芯的浓度相同。采用胰岛素泵注射胰岛素及其类似物到皮下组织后，其吸收速度 和曲线与一般注射器皮下注射胰岛素类似。溶液中胰岛素六聚体分解成单体较慢，超 短效胰岛素类似物双聚体分解成单体迅速，胰岛素泵需要分别注入基础胰岛素24小时 分布剂量和餐前追加胰岛素剂量，需要随时调整注入量，以免低血糖；也需要根据进 食量和时间调整胰岛素追加剂量；也一样需要经常请内分泌医生或售后服务点的专业 医生检查胰岛素泵的情况，调节胰岛素剂量。Jose MB.等【Jose MB.,Mariko M.,Kozo T. et al.Absorption of insulin from Pluronic F-127gels following subcutaneous administration  in rats.Int.J.Pharmaceutics.1999(184):189-198】利用泊洛沙姆水凝胶(Pluronic hybrid  hydrogels)PF127制备了皮下注射的胰岛素缓释剂，但该剂型在大鼠体内的血药浓度和 血糖浓度只维持了12小时，并没有达到良好的缓释效果；但若仅仅通过将PF127浓度增 大来提高缓释效果，则会增加皮肤的刺激性。

如上所述，对于胰岛素依赖型糖尿病患者而言，为了治疗的安全、有效和依从性， 急需开发一种价格合适、稳定、对皮肤低刺激性且易于大规模生产的长效控释制剂。

发明内容

为满足上述大量需求中的一个或多个，本发明提供了一种含有胰岛素或艾塞那肽 等降血糖活性成分的生物兼容性长效控释脂质体凝胶组合物，其是一种具有高生物利 用度的皮下注射控释剂型，其中胰岛素或艾塞那肽等降血糖活性成分的释放得到有效 的控制。此外，本发明还提供了制备所述皮下注射控释剂型的方法。

本发明提供的皮下注射控释剂型的脂质体凝胶组合物在被给予人体后具有高生物 利用度和最小的药物初始快速释放，并且在一次注射后能够在体内提供有效量的降血 糖活性成分胰岛素或艾塞那肽等长达2-7天或更长时间。本发明的控释组合物可包含治 疗有效量的降血糖活性成分、脂质、可逆温变凝胶和水性分散介质，所述可逆温变凝 胶选自泊洛沙姆水凝胶、含硫醇功能端基的泊洛沙姆、明胶、透明质酸、低取代多巴 胺-透明质酸结合物和其任何组合。

在一个实施方式中，本发明提供了一种注射用长效控释脂质体凝胶组合物，其包 含：治疗有效量的降血糖活性成分；脂质；可逆温变凝胶，所述可逆温变凝胶选自泊 洛沙姆水凝胶、含硫醇功能端基的泊洛沙姆、明胶、透明质酸、低取代多巴胺-透明质 酸结合物和其任何组合；和水性分散介质。

在一个方面中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛 沙姆与选自下列的一种或多种的组合：明胶、透明质酸和低取代多巴胺-透明质酸结合 物。在进一步的方面中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的 泊洛沙姆与明胶、透明质酸或低取代多巴胺-透明质酸结合物的组合。在进一步的方面 中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙姆与明胶和透 明质酸的组合。在进一步的方面中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇 功能端基的泊洛沙姆与明胶和低取代多巴胺-透明质酸结合物的组合。在进一步的方面 中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙姆与透明质酸 和低取代多巴胺-透明质酸结合物的组合。在进一步的方面中，可逆温变凝胶可以为泊 洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙姆与明胶、透明质酸和低取代多巴胺-透明 质酸结合物的组合。

在一个方面中，泊洛沙姆水凝胶为泊洛沙姆F127或P123。

在一个方面中，可逆温变凝胶的含量按组合物重量计可以为0.05-50%、0.5-35%、 1-20%、5-15%或10-12%。

在一个方面中，当可逆温变凝胶为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙 姆与上文所述的选自明胶、透明质酸和低取代多巴胺-透明质酸结合物的一种或多种的 组合时，两者的含量按组合物重量计可以分别为10-30%和0.05-2%、15-25%和0.08-1%、 18-20%和0.1-0.5%、或者20%和0.1%。在一个方面中，泊洛沙姆水凝胶与明胶、透明质 酸或低取代多巴胺-透明质酸结合物的含量按组合物重量计分别为10-30%和0.05-2%、 15-25%和0.08-1%、18-20%和0.1-0.5%、或者20%和0.1%。

在一个方面中，脂质选自磷脂、糖脂、甾醇、甘油酯和脂溶性维生素。在本发明 的组合物中，脂质的含量按组合物重量计可以为0.05-50%、0.7-30%、1-20%、1-10%或 2-5%。

在一个方面中，在本发明的组合物中，降血糖活性成分为胰岛素、艾塞那肽、利 拉鲁肽、普兰林肽或其组合。在进一步的方面中，胰岛素可选自下列的一种或多种： 胰岛素类似物、人胰岛素和动物胰岛素。艾塞那肽可选自下列的一种或多种：艾塞那 肽-3、艾塞那肽-4、其C端带有酰胺取代基或不带有取代基的艾塞那肽衍生物以及它们 的可药用盐。

在一个方面中，在本发明的组合物中，降血糖活性成分的含量按组合物重量计为 0.01-2.5%。

在一个方面中，在本发明的组合物中，水性分散介质可选自可注射用的纯水、氨 基酸类缓冲溶液、多肽类缓冲溶液和pH缓冲溶液。

在一个方面中，在本发明的组合物中，脂质形成粒径为50nm-20_μm的脂质小球凝 胶、脂质体悬浮液、W/O/W型乳液或均一混合物，降血糖活性成分装载或分散于脂质 中，并且该装载或分散了降血糖活性成分的脂质装载于可逆温变凝胶中。

在一个方面中，本发明的组合物持续释放降血糖活性成分2至7天或更长时间。

在一个实施方式中，本发明提供了一种制备含有降血糖活性成分的长效控释脂质 体凝胶组合物的方法，所述方法包括下列步骤：混合治疗有效量的降血糖活性成分、 脂质和水性分散介质，从而制备所述降血糖活性成分装载或分散于其中的脂质小球凝 胶、脂质体悬浮液、W/O/W型乳液或均一混合物；和将所述脂质小球凝胶、脂质体悬 浮液、W/O/W型乳液或均一混合物加入至可逆温变凝胶水性溶液中进行乳化，以形成 脂质体凝胶微米囊或纳米囊，其中所述可逆温变凝胶选自泊洛沙姆水凝胶、含硫醇功 能端基的泊洛沙姆、明胶、透明质酸、低取代多巴胺-透明质酸结合物和其任何组合。

在一个方面中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛 沙姆与选自下列的一种或多种的组合：明胶、透明质酸和低取代多巴胺-透明质酸结合 物。在进一步的方面中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的 泊洛沙姆与明胶、透明质酸或低取代多巴胺-透明质酸结合物的组合。在进一步的方面 中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙姆与明胶和透 明质酸的组合。在进一步的方面中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇 功能端基的泊洛沙姆与明胶和低取代多巴胺-透明质酸结合物的组合。在进一步的方面 中，可逆温变凝胶可以为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙姆与透明质酸 和低取代多巴胺-透明质酸结合物的组合。在进一步的方面中，可逆温变凝胶可以为泊 洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙姆与明胶、透明质酸和低取代多巴胺-透明 质酸结合物的组合。

在一个方面中，泊洛沙姆水凝胶为泊洛沙姆F127或P123。

在一个方面中，可逆温变凝胶的含量按组合物重量计可以为0.05-50%、0.5-35%、 1-20%、5-15%或10-12%。

在一个方面中，当可逆温变凝胶为泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙 姆与上文所述的选自明胶、透明质酸和低取代多巴胺-透明质酸结合物的一种或多种的 组合时，两者的含量按组合物重量计可以分别为10-30%和0.05-2%、15-25%和0.08-1%、 18-20%和0.1-0.5%、或者20%和0.1%。在一个方面中，泊洛沙姆水凝胶与明胶、透明质 酸或低取代多巴胺-透明质酸结合物的含量按组合物重量计分别为10-30%和0.05-2%、 15-25%和0.08-1%、18-20%和0.1-0.5%、或者20%和0.1%。

在一个方面中，脂质选自磷脂、糖脂、甾醇、甘油酯和脂溶性维生素。在本发明 的组合物中，脂质的含量按组合物重量计可以为0.05-50%、0.7-30%、1-20%、1-10%或 2-5%。

在一个方面中，降血糖活性成分为胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、普兰林肽或其 组合。在进一步的方面中，胰岛素可选自下列的一种或多种：胰岛素类似物、人胰岛 素和动物胰岛素。艾塞那肽可选自下列的一种或多种：艾塞那肽-3、艾塞那肽-4、其C 端带有酰胺取代基或不带有取代基的艾塞那肽衍生物以及它们的可药用盐。

在一个方面中，降血糖活性成分的含量按组合物重量计为0.01-2.5%。

在一个方面中，水性分散介质可选自可注射用的纯水、氨基酸类缓冲溶液、多肽 类缓冲溶液和pH缓冲溶液。

在一个方面中，本发明的方法进一步包括固化所形成的脂质凝胶微米囊或纳米囊 的步骤，以获得含有降血糖活性成分的脂质体凝胶微米囊或纳米囊粉剂。在进一步的 方面中，固化步骤通过相分离方法、喷雾干燥方法或冷冻干燥方法进行。

在一个实施方式中，本发明提供了一种通过本发明的制备含有降血糖活性成分的 长效控释脂质体凝胶组合物的方法获得的含有降血糖活性成分的脂质体凝胶微米囊或 纳米囊粉剂。

附图说明

图1描述了含有降血糖活性成分胰岛素（图1a）或艾塞那肽（1b）囊泡型脂质凝 胶（VLG）的脱水干燥脂质囊泡的电子显微镜照片。

图2描述了胰岛素的体外释放速度。

图3描述了含有胰岛素的不同制剂在大鼠体内产生的血药浓度的变化。

图4描述了含有艾塞那肽的制剂在相同浓度的脂质下用相同浓度的可逆温变凝胶 保护时在大鼠体内产生的血药浓度的变化。

具体实施方式

下述具体实施方式更全面地阐述本发明及其多种附加的优势，以便本发明及本发 明的多种附加的优势都更加清晰。

本发明涉及含有降血糖活性成分的可注射长效控释脂质体凝胶组合物，所述长效 控释脂质体凝胶组合物在被给予人体后具有高生物利用度和最小的药物初始快速释 放。本发明的长效控释脂质体凝胶组合物由于其在室温时具有良好的流动性而可用于 皮下注射。

本发明所使用的降血糖活性成分可以是胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、普兰林肽 或其组合。

在本发明中，胰岛素可以是选自下列的一种或多种，如胰岛素类似物(insulin  similitude)例如门冬胰岛素、门冬胰岛素30、地特胰岛素等；人胰岛素如诺和灵系列等； 和动物胰岛素等。这些胰岛素按作用时间的特点可分为：速效胰岛素类似物、短效胰 岛素、中效胰岛素、长效胰岛素(包括长效胰岛素类似物)和预混胰岛素(预混胰岛素类 似物)。

艾塞那肽可以是选自下列的一种或多种，如艾塞那肽-3、艾塞那肽-4，及其功能片 段、衍生物和可药用盐。

如本文所使用，术语“治疗有效量”是指与没有接受该量的相应受试者相比，产 生如下作用的任何量：改善疾病或病症的治疗、愈合、预防或缓解，或改善副作用、 或者降低疾病或病症的发展速度。在一个方面，本发明的含有降血糖活性成分例如胰 岛素或艾塞那肽的长效控释脂质体凝胶组合物含有按组合物重量计0.01-2.5%的降血糖 活性成分，例如0.02-2.0%，诸如0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、 0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、 2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%或2.5%。确定降血糖活性成分的治疗有效量在本领域 技术人员的能力范围之内。

在一个方面，本发明所使用的脂类，又称脂质(Lipid)，包括但不限于磷脂，如磷 脂酰胆碱、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、双磷脂酰甘油、鞘磷脂等， 优选磷脂酰胆碱；糖脂，如脑苷脂、神经节苷脂、Glucocerebroside等鞘糖脂与甘油糖 脂；固醇(或称甾醇)：如β-谷固醇、菜油甾醇(Campesterol)等；甘油酯，如月桂酸甘油 单酯、硬脂酸甘油单酯等甘油单酯和1-棕榈酸-2-油酸-甘油酯等甘油二酯；和脂溶性维 生素(如维生素A、D、E和K)等。它们都是对人体无害的物质，体内注射后将被缓慢地 吸收、降解和排出。在一个方面中，本发明通过囊泡型脂质凝胶（Vesicular lipid Gels, VLG）方法制备脂质体，所述方法例如包括用高浓度（例如按VLG组合物重量计 0.1%-30%、诸如0.1-20%）的活性成分水性溶液与(例如基本上等重量的)脂质进行高压 (例如100-10,000psi，诸如500、1,000、5,000、8,000或10,000psi)、高速(例如2,000-20,000 rpm，诸如5000、10,000或15,000rpm)匀化剪切至外观呈均一膏状的囊泡型脂质凝胶， 再将该囊泡型脂质凝胶用水性介质稀释，以获得脂质体。这种脂质体成分单一、粒径 较小且均匀，可以控制到纳米级【M.Brandl,U.Massing,Vesicular phospholipid gels,in: V.P.Torchilin,V.Weissig(Eds.),Liposomes,2nd ed.,Oxford Press,New York,2003,pp. 353-372】，因此保证了脂质体混悬液具有良好释放效果的同时又具有良好的物理稳定 性。在一个实施方式中，本发明的注射用长效控释脂质体凝胶组合物含有按组合物重 量计约0.5-50%、0.7-30%、1-20%、1-10%、或2-5%的脂质。在一个优选的实施方式中， 脂质是磷脂酰胆碱。在一个实施方式中，脂质可以是混合磷脂例如大豆卵磷脂SPC、纯 化磷脂例如二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、或其组合。

在一个方面，本发明所使用的可逆温变凝胶可以是泊洛沙姆水凝胶(Pluronic hybrid  hydrogels)，例如F127、P123等。该可逆温变凝胶在室温或以下温度为透明的水溶性 液体，当在37℃体温时则形成半固体凝胶以储存药物并缓慢释放。本发明所使用的可 逆温变凝胶还可以是含硫醇功能端基泊洛沙姆(thiol-terminated/thiol end-capped  Pluronic)(如1-硫醇泊洛沙姆)、明胶、透明质酸(Hyaluronic acid/HA)、低取代多巴胺- 透明质酸结合物(HA-dopamine conjugates L-DN-HA)等。本发明所使用的可逆温变凝胶 还可以是上述凝胶的任何组合。在一个方面，本发明的注射用长效控释脂质体凝胶组 合物含有按组合物重量计约0.05-50%、0.5-35%、1-20%、5-15%、10-12%的可逆温变 凝胶。在一个方面中，本发明的可逆温变凝胶为泊洛沙姆水凝胶例如F127与明胶的组 合。在一个方面，泊洛沙姆水凝胶与明胶的含量按组合物重量计分别为10-30%和 0.05-2%，优选分别为15-25%和0.08-1%，优选分别为18-20%和0.1-0.5%、优选分别 为20%和0.1%。在一个方面中，泊洛沙姆水凝胶与明胶的含量按组合物重量计分别为 20%和0.1%。不受限于理论，硫醇功能端基例如1-硫醇被用于调节相变温度。它们都 是对人体无害的物质，体内注射后将被缓慢地吸收、降解和排出。

在一个方面，本发明所使用的水性分散介质可选自可注射用的纯水、氨基酸类、 多肽及pH缓冲溶液。它们都是对人体无害的物质，体内注射后将被缓慢地吸收、降解 和排出。在一个方面，本发明的注射用长效控释脂质体凝胶组合物含有按组合物重量 计约40-90%的水性分散介质，例如50-80%、60-70%或65%的水性分散介质。

在一个方面，本发明提供了一种注射用长效控释脂质体凝胶组合物，其包含：治 疗有效量的降血糖活性成分；按组合物重量计1%-10%的脂质，优选磷脂酰胆碱；可逆 温变凝胶，所述可逆温变凝胶选自按组合物重量计18-20%的泊洛沙姆水凝胶和 0.1-0.5%的明胶的组合；和水性分散介质。

在一个实施方式中，本发明提供了一种制备含有降血糖活性成分的长效控释脂质 体凝胶组合物的方法，所述方法包括下列步骤：混合治疗有效量的降血糖活性成分、 脂质以及水性分散介质，从而制备所述降血糖活性成分装载或分散于其中的脂质小球 凝胶、脂质体悬浮液、W/O/W型乳液或均一混合物；和将所述脂质小球凝胶、脂质体 悬浮液、W/O/W型乳液或均一混合物加入至可逆温变凝胶的水性溶液中进行乳化，以 形成脂质体凝胶微米囊或纳米囊，其中所述可逆温变凝胶选自泊洛沙姆水凝胶、含硫 醇功能端基的泊洛沙姆、明胶、透明质酸、低取代多巴胺-透明质酸结合物和其任何组 合。

在一个方面，本发明提供了一种制备含有降血糖活性成分的长效控释脂质体凝胶 组合物的方法，所述方法包括下列步骤：混合按所述组合物的重量计0.01-2.5%的降血 糖活性成分、按组合物重量计0.05-50%的脂质、和水性分散介质；在20-40℃下制备脂 质小球凝胶、脂质体悬浮液、W/O/W型乳液或均一混合物，使其粒径范围为50纳米至 20微米；将所述脂质小球凝胶、脂质体悬浮液、W/O/W型乳液或均一混合物加入至按 组合物重量计0.05-50%的可逆温变凝胶的水性溶液，并在0-25℃下进行乳化，以形成脂 质体凝胶微米囊或纳米囊。在一个方面，通过囊泡型脂质凝胶（Vesicular lipid Gels, VLG）方法制备脂质小球凝胶、脂质体悬浮液、W/O/W型乳液或均一混合物，使其粒 径范围为50纳米至20微米。

所述可逆温变凝胶在室温或以下温度为水溶性液体，且当在37℃体温时则形成半 固体凝胶储存药物并缓慢释放，并且在一个方面可选自泊洛沙姆水凝胶、含硫醇功能 端基的泊洛沙姆、明胶、透明质酸、低取代多巴胺-透明质酸结合物和其任何组合。在 进一步的方面，可逆温变凝胶可选自泊洛沙姆水凝胶和/或含硫醇功能端基的泊洛沙姆 与选自下列的一种或多种的组合：明胶、透明质酸和低取代多巴胺-透明质酸结合物。

在一个方面，本发明提供了一种制备含有降血糖活性成分例如胰岛素或艾塞那肽 的脂质体凝胶微米囊或纳米囊粉剂的方法，所述方法包括下列步骤：混合治疗有效量 的降血糖活性成分、按组合物重量计0.05-50%的脂质、和水性分散介质，从而制备所 述降血糖活性成分装载或分散于其中的脂质小球凝胶、脂质体悬浮液、W/O/W型乳液 或均一混合物；和将所述脂质小球凝胶、脂质体悬浮液、W/O/W型乳液或均一混合物 加入至按组合物重量计0.05-50%的可逆温变凝胶的水性溶液中进行乳化，以形成脂质 体凝胶微米囊或纳米囊；固化所形成的脂质体凝胶微米囊或纳米囊，以获得所述含有 降血糖活性成分例如胰岛素或艾塞那肽的脂质体凝胶微米囊或纳米囊粉剂。在一个方 面中，所述可逆温变凝胶选自泊洛沙姆水凝胶、含硫醇功能端基的泊洛沙姆、明胶、 透明质酸、低取代多巴胺-透明质酸结合物和其任何组合。在另一个方面中，所述固化 步骤是通过相分离方法、喷雾干燥方法或冷冻干燥方法进行。本发明的控释脂质体凝 胶微米囊或纳米囊表面致密从而具有控释释放的特性，并且该微囊的粒径范围为50纳 米至20微米。不意图受限于理论，降血糖活性成分例如胰岛素或艾塞那肽先从脂质体 中释放出来，再从凝胶中释放，通过两种屏障控制药物释放。

本发明的含有降血糖活性成分例如胰岛素或艾塞那肽的组合物可通过皮下注射给 药，但不是唯一的肠胃外给药途径。优选地，本发明的组合物通过肠胃外途径给药， 例如静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内给药途径等。在本发明的一个优选的给药方案中， 含降血糖活性成分例如胰岛素或艾塞那肽的组合物以分散注射液施用。

本发明的组合物或降血糖活性成分的有效量可以根据受试者的年龄、血糖的严重 程度以及糖尿病患者的情况进行适当调整。在一个实施方案中，本发明的组合物中降 血糖活性成分的剂量可以为0.01至100μg/kg/天，优选的是0.05至10μg/kg/天，所述剂量 可以单独剂量或多个剂量施用。

不受限于理论，在本发明的优选的一个方面中，本发明的注射用长效控释脂质体 凝胶组合物采用了选自泊洛沙姆水凝胶、含硫醇功能端基的泊洛沙姆、明胶、透明质 酸、低取代多巴胺-透明质酸结合物的可逆温变凝胶组合，其协同地降低了活性成分从 脂质体凝胶组合物的释放，并在室温具有良好的流动性，如下面的实施例所证实。

下述实施例详细地解释本发明。然而这些实施例仅为示例性的，不应被解释为对 本发明的范围的任何限制。除非特别说明，所有试剂和设备均可商购获得并且所有含 量均以重量计算。

实施例

实施例1.制备艾塞那肽或胰岛素囊泡型脂质凝胶（VLG）

按照表1的含量，称取艾塞那肽（购自辽宁科泰生物制药公司）或胰岛素（购自 Sigma Aldrich St.,Louis,MO）（如16mg，约0.1重量百分数），并溶于HCl水溶液(0.01M, 69.5%)。称取磷脂(如混合磷脂SPC，4.37g，约30重量份数(即重量百分数))加入该HCl 水溶液中，并于40℃水浴中水化1小时。然后采用剪切乳化仪以12,000rpm乳化5min。 最后形成乳白色半固体VLG。将其放入-20℃冰箱中保存以备用。或者，将VLG进行 冷冻干燥脱水成干燥脂质囊泡，如图1的电子显微镜照片所示。干燥脂质囊泡在添加 水性注射介质后即可形成脂质体囊泡混悬液。

表1：VLG的制备处方及其体外释放速度（体外释放可以模拟体内的释放效果，也可 以判断不同剂型的释放快慢）

实施例2.制备艾塞那肽或胰岛素脂质体混悬液

分别称取实施例1制备的含有艾塞那肽或胰岛素的VLG(1.4120g)，用8.558g水性介 质(PBS，pH＝7.4；或0.01M HCl，pH=4.01)稀释成约10ml的含艾塞那肽或胰岛素的脂 质体混悬液。

实施例3.艾塞那肽或胰岛素脂质体包封率和粒径的测定

采用高速离心法，在4℃以18,000rpm离心30min，将脂质体沉淀下来。采用10倍 量的乙醇来破乳稀释脂质体沉淀或脂质体混悬液，得澄清液体。用LC-MS测量沉淀中 艾塞那肽或胰岛素含量，计算包封率为：89.39±2.24%。用Beckman coulter Delsa^TM Nano  HC Particle Analyzer测量粒径为505±9.4nm。

实施例4.泊洛沙姆(Pluronic)F127及其与明胶、透明质酸或低取代多巴胺-透明质酸 结合物的混合物的凝胶液的制备

根据表2，称取F127或F127与明胶、透明质酸、低取代多巴胺-透明质酸结合物的 混合物，分别在4℃下缓慢搅拌24h，完全溶解于0.01M HCl(pH=4.01)或pH7.4的PBS， 制得泊洛沙姆(Pluronic)F127及其与明胶、透明质酸或低取代多巴胺-透明质酸结合物的 混合物的凝胶液(8.558g)。F127与明胶、透明质酸、低取代多巴胺-透明质酸结合物的 混合比例如表2所示。

实施例5：脂质体凝胶的制备

称取由实施例1制备的VLG(1.4120g)，加入到由实施例4根据表2制备的泊洛沙姆 (Pluronic)F127及其与明胶、透明质酸或低取代多巴胺-透明质酸结合物的混合物的凝胶 液(8.558g)中，按照实施例2的方法制备活性成分为胰岛素或艾塞那肽的脂质体凝胶混 悬液约10ml。活性成分胰岛素或艾塞那肽的含量可按照实施例1-2和4-5的步骤计算获 得。

将相同量的F127或F127与明胶、透明质酸、低取代多巴胺-透明质酸结合物的混合 物制备成溶解有相同含量的胰岛素或艾塞那肽水性介质(0.01M HCl(pH4.01)或pH7.4的 PBS溶液)凝胶液10ml，在4℃下缓慢搅拌24h，完全溶解，形成胰岛素或艾塞那肽凝胶 溶液，作为对照。

测定所获得的胰岛素或艾塞那肽凝胶溶液和脂质体凝胶在1h和48h时的体外释放 值。表2给出了以表1中配方Vmi-2获得的胰岛素溶出释放的百分数值。采用其它配方也 获得了相似的结果（数据未示出）。通过直接观察，所获得的脂质体凝胶混悬液在常 温下均具有良好的流动性。

表2：F127或F127与明胶(Gelatin，G)、透明质酸(Hyaluronan，Hy)、低取代多巴胺 (Dopamine)-透明质酸结合物(LDH)的混合物的量(克)与有效成分的溶出速度（其中克数 为可逆温变凝胶在10ml最终胰岛素或艾塞那肽凝胶溶液和脂质体凝胶混悬液中的克 数）。

表3给出了具有下列组成的胰岛素脂质体凝胶液的体内和体外经时变化：0.2wt% 的胰岛素、2wt%的DSPE、20wt%的F127、0.1wt%的明胶、77.7%的pH7.4的PBS溶 液。该胰岛素脂质体凝胶液在常温下流动性非常良好，而在30℃以上则转化为完全凝 胶状固体。采用15wt%、20wt%或25wt%的F127与0.05wt%或1wt%的明胶或者0.05 wt%、0.1wt%或1wt%的透明质酸或低取代多巴胺-透明质酸结合物获得相似的体外释 放、体内血浆浓度和流动性结果（数据未示出）。

表3：胰岛素脂质体凝胶液的体内和体外经时变化

以艾塞那肽作为活性成分获得了相似的结果。部分实验数据如下所示：

艾塞那肽De1处方：50mg(0.2%)艾塞那肽、PBS溶液16g(99.8%)的6小时溶出为 93%。

艾塞那肽De2处方：50mg(0.3%)艾塞那肽、SPC1g(6.2%)、PBS溶液15g(93.5%) 的48小时溶出为5.3%。

艾塞那肽De3处方：50mg(0.3%)艾塞那肽、SPC1g(6.2%)、F127凝胶3.2g(19.9%)、 PBS溶液11.8g(73.5%)的48小时溶出为2.5%。

实施例6.体外释放研究

取2ml艾塞那肽PBS(pH7.4)溶液或胰岛素水溶液(0.01M HCl，PH=4.01)（活性成 分胰岛素或艾塞那肽的含量以处方组成计算）、实施例2制备的艾塞那肽或胰岛素脂 质体混悬液、实施例5制备的艾塞那肽或胰岛素凝胶、或实施例5制备的胰岛素脂质 体凝胶，并放入截留M_W=1000kD的透析袋中。将透析袋两头密封后放入30ml0.01M PBS(pH=7.4)或0.01M HCl（pH=4.01）溶液中，在36℃水浴的摇床中以50rpm/min震 摇。分别以一定时间间隔取1ml释放介质，并补充1ml相同的溶液。取出样品用LC-MS 测定。测定的结果如表2和图2所示（SOL对应于Di0胰岛素凝胶溶液；20%PF127 对应于Di14胰岛素凝胶溶液；LIP对应于Di0胰岛素脂质体凝胶,20%PF127-LIP对应 于Di14胰岛素脂质体凝胶）。释放介质中药物浓度越低证明该制剂释放出来的药物累 积量越少，也说明释放越慢。

实施例7.UPLC-MS/MS分析

所有体外数据均用UPLC(Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography;Waters, Milford,MA)和MS/MS(MicroTOF-Q;Bruker Daltonics Inc,Billerica,MA)获得。C18柱： 柱温为40℃。流动相是0.1%的甲酸去离子水，流速为0.2ml/min。

实施例8.胰岛素的药代动力学测试

将15只大鼠（购自中文大学实验动物服务中心，品种为Sprague Dawley(SD)、雄 性，体重180±20g）随机分为3组，每组5只，禁食14h，自由饮水。称体重后，按 1IU/kg/天×10天的剂量对牛胰岛素组、脂质体组、和脂质体20%F127组进行皮下注射 给药，而胰岛素溶液组按1IU/kg/天×1天的剂量皮下注射给药。给药前眼眶取血为0 小时的数据，以一定间隔从眼眶取血至1%肝素钠淌洗后的离心管中，并以4,500rpm 离心4min，然后分离血浆。大鼠血浆中的牛胰岛素含量用牛胰岛素ELISA试剂盒测 定。血药浓度随时间的变化如图3所示。此处，胰岛素溶液组(SOL组)对应于表2中 Di0胰岛素凝胶溶液、脂质体组(LIP组)对应于表2中Di0胰岛素脂质体凝胶、而20% F127-LIP组对应于表2中Di14胰岛素脂质体凝胶。

实施例9.艾塞那肽的药代动力学测试

将15只大鼠（购自中文大学实验动物服务中心，品种为Sprague Dawley(SD)、雄 性，体重180±20g）随机分为3组，每组5只，禁食14h，自由饮水。各组为溶液组、 脂质体组和20%PF127脂质体组。称体重后，各组艾塞那肽按3mg/ml的剂量皮下注 射给药。给药前眼眶取血为0小时的数据，以一定时间间隔眼眶取血至1%肝素钠淌洗 后的离心管中，并以4,500rpm离心4min，然后分离血浆。大鼠血浆中的艾塞那肽含量 用牛胰岛素EIA Kit试剂盒测定。血药浓度随时间的变化如图4所示。图中艾塞那肽游 离溶液对应实施例5中的艾塞那肽De1处方，艾塞那肽脂质体溶液对应实施例5中的 艾塞那肽De2处方，艾塞那肽脂质体凝胶对应实施例5中的艾塞那肽De3处方。

如以上实施例所证实，本发明提供了一种新的药物传递系统，其不但能够保持胰 岛素或艾塞那肽在储存和体内释放时的稳定，而且在一次注射后能够在体内缓慢释放 艾塞那肽或胰岛素并维持可达2-7天或以上的有效期。这降低了每天需多次注射胰岛 素或降血糖药所带来的疼痛、不便和刺激性等副作用。将艾塞那肽或胰岛素脂质体包 封入温敏聚合物凝胶并通过皮下注射给药可以用来克服传统上每天多次给药带来的患 者依从性问题。