柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明提供了柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP检测的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP，以待测样品总DNA为模板，应用上述的内外引物对在63～65℃恒温反应条件下，进行环介导恒温扩增反应60～80min，扩增完成后78～82℃反应5～10min中止反应，然后根据浑浊度或利用荧光染料染色通过颜色变化或电泳条带进行可视化判断，鉴定植株样品是否感染柑桔褪绿矮化相关病毒。本发明操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器，几十分钟就可完成对样品的检测，重复性好、准确性高、灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种环介导等温扩增分子检测方法，尤 其涉及一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

柑桔褪绿矮化病由柑桔褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic  dwarf-associated virus,CCDaV)引起，CCDaV属于菜豆金黄花叶病毒属 (Begomovirus)，为单链环状的DNA病毒，基因组为3.4-3.6kb，具有5个ORFs。 柑桔褪绿矮化病主要分布于土耳其，近年来我国相继在云南、四川等地发现了 柑橘褪绿矮化病，其发生呈不断扩大、加重的趋势，可通过杨梅粉虱 (Parabemisia myricae Kuwana)传播。CCDaV可侵染多种柑桔寄主，如葡萄柚、 柠檬、椪柑、酸橙及甜橙等，引起植株叶片变形、扭曲、花叶等症状，并造成 果实变小，产量降低。该病在土耳其被认为是威胁柑桔生产最严重病害之一， 且已经在土耳其造成了严重的损失，特别是在梅尔辛造成当地柑桔减产60～ 70％。

目前我国柑桔的种植面积和产量均居世界第一，柑桔已成为我国农民增收的 重要途径，也是我国一个重要的产业。柑桔褪绿矮化病已在我国时有发生，且日 趋严重，对柑桔产业是一个巨大的威胁，且该病目前尚无有效的药物可进行防治， 因此柑桔褪绿矮化病的防控对我国柑桔产业的发展具有十分重要的意义。

柑桔褪绿矮化病的检测，目前可用的方法有：常规PCR和实时荧光PCR。PCR 法具有快速、灵敏和准确的特点，作为一种强有力的检测工具已广泛应用于各种 病害的检验与诊断，实时荧光PCR的灵敏度高于常规PCR。PCR方法虽然能对 CCDaV进行有效的检测，但都需要专业的PCR仪、电泳仪等特殊仪器，使其在田 间和基层的应用受到很大的限制。因此建立一套快速、有效、简便的柑桔褪绿矮 化病的检测方法，对我国柑桔产业健康、稳定发展具有十分重要的意义。

2000年由Notomi等发明的环形介导逆转录等温扩增技术(LAMP)是一种新 的恒温核酸扩增方法，较传统的核酸扩增方法具有灵敏度高、特异性强、操作方 法简单、快速等优点，现已越来越多的应用于各种病毒的检测。其主要原理是通 过采用特异地识别靶序列上6个区域的4条引物(2条内引物-FIP/BIP，2条 外引物-F3/B3)及链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在等温条件下 (60-65℃左右)DNA开始合成。利用可以产生环状结构的引物和Bst DNA聚合酶 的链置换合成活性，靶序列两端引物结合处循环不断地产生环状单链结构。当一 个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链解离变成单链， 引物在恒温条件下不断引发新链的合成，靶基因因此得到高效扩增，最终的扩增 产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片 段混合物，电泳显现出不同大小条带组成的阶梯式图谱。该方法可加入荧光燃料 进行可视化判断也可根据浑浊度判断检测结果，反应也不需要特殊仪器，在烘箱 或水浴锅中就能完成反应，因此特别适合在田间和基层使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高的柑桔褪绿矮化相关病毒的 LAMP引物组。

一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组，由外引物对F3、B3和内 引物对FIP、BIP组成：

外引物对：

F3：5’-ACCAGGAGTGGAGGACAAT-3’；

B3：5’-CCTTACACCCCGGAGGAA-3’；

内引物对：

FIP：5’-ACCTGGGCCTCCTTCTTCTCTTGGGACAAGCCGTGTAACG-3’；

BIP：5’-AGAAGCCCAAGATTGCTGGGGACCTTTGCTCGACTTTCTCC-3’。

本发明的另一目的是提供一种具有高灵敏度、高特异性的柑桔褪绿矮化相 关病毒的LAMP检测试剂盒。

一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测试剂盒，含有前述的柑桔褪绿矮化 相关病毒的LAMP检测引物组、Bst buffer、MgCl₂、Betaine、dNTPs、Bst聚合酶。

本发明还提供了一种不需要专门的核酸扩增和检测仪器、操作简单方便、 特异性好、灵敏度高、检测快速的柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP检测方法。

一种柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测方法，是以待测样品总DNA为模板， 应用上述的外引物对F3、B3和内引物对FIP、BIP在63～65℃恒温反应条件下， 进行环介导恒温扩增反应60～80min，扩增完成后78～82℃反应5～10min中 止反应，然后根据浑浊度或荧光染料染色或电泳条带，鉴定植株样品是否感染 柑桔褪绿矮化相关病毒。

扩增反应中，总体积25μL的反应体系含有18μL反应液A、5μL引物液B、 浓度为20～100ng/μL的DNA溶液2μL；其中18μL反应液A含有：2.5μL 10 ×Bst buffer、6μL 25mM的MgCl₂、2μL 4mM的Betaine、3.5μL 10mM的dNTPs、 1μL 8U/μL的Bst聚合酶、3μL水；所述5μL引物液B包括2μL 20μM的FIP、 2μL 20μM的BIP、0.5μL 10μM的F3、0.5μL 10μM的B3。

本发明的有益效果是：以待测样品总DNA为模板，建立了快速检测柑桔褪绿 矮化相关病毒的LAMP技术，操作简便、检测快速、不需要昂贵的核酸扩增仪器 和电泳仪，几十分钟就可完成对样品的检测，其主要优点有：

(1)本发明首次提供了柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测引物组、试剂盒和 方法，所述的引物特异性良好，对于柑桔褪绿矮化相关病毒能够实现特异性扩 增，而对于其它病毒不能特异性扩增。并且，所述引物具有良好的再现性、结 果稳定可靠。

(2)可快速、准确、大批量地检测柑桔褪绿矮化相关病毒，所需样品量少； 本发明方法敏感性极高，10-15分钟的短时间内DNA模板数量可增加至10⁹倍， 是一种反应快速，操作简便的快速检测技术，适应于检测对象的快速筛检。

(3)灵敏度高：实验证明本发明检测方法检测灵敏度比常规PCR高100倍，具 有与实时荧光PCR相等的检测灵敏度。

(4)本发明为田间和基层单位对柑桔褪绿矮化相关病毒的检测提供了一种高 效、快速、成本低、准确、灵敏的检测方法，填补柑桔褪绿矮化相关病毒现场 快速检测方法的空白。

附图说明

图1为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP浑浊度可视化检测结果示意图；1为感 染柑桔褪绿矮化相关病毒的样品，2为健康叶片对照，3为水对照。

图2为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP引物组的特异性检测图；其中1为感染 柑桔褪绿矮化相关病毒的样品，2-7分别为感染柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、 柑桔裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒和柑桔黄龙病菌的样品。

图3为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP扩增产物酶切鉴定图；M为50bp Ladder  DNA Marker；1、3为LAMP扩增产物；2为LAMP扩增产物经MboⅡ酶切后电泳。

图4为柑桔褪绿矮化相关病毒常规PCR(上排泳道)和LAMP(下排泳道)检 测灵敏度检测对比图；M为100bp Ladder DNA Marker；1-6依次为柑桔褪绿矮 化相关病毒样品稀释10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶检测结果。

图5为柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP灵敏度检测浑浊度观察图；1-6依次为 柑桔褪绿矮化相关病毒样品稀释10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍LAMP 检测结果。

图6为柑桔褪绿矮化相关病毒实时荧光PCR检测灵敏度检测图；1-6依次为 柑桔褪绿矮化相关病毒样品稀释10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍实 时荧光PCR检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明的实验材料：

本实验所用分别感染柑桔衰退病毒、柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病类病毒、 温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔黄龙病菌以及柑桔褪绿矮化相关病毒 的植株样品来源于西南大学柑桔研究所保存毒源。

主要试剂及生产者：

Betaine(Promega公司，美国)，Bst聚合酶(New England Biolabs，美国)， SYBR GREENI(鼎国公司，中国)，MboⅡ内切酶(New England Biolabs，美国), Ladder DNA Marker(Biomed公司，俄罗斯)，10×Bst buffer(New England  Biolabs，美国)。

实施例1柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测特异性验证

1、用于检测柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP引物组

根据柑桔褪绿矮化相关病毒的移动蛋白(movement protein,MP)基因序 列设计了环介导等温核酸扩增的4条特异性引物：外引物对F3、B3，内引物对 FIP、BIP，引物序列如下：

外引物对：

F3：5’-ACCAGGAGTGGAGGACAAT-3’；

B3：5’-CCTTACACCCCGGAGGAA-3’；

内引物对：

FIP：5’-ACCTGGGCCTCCTTCTTCTCTTGGGACAAGCCGTGTAACG-3’；

BIP：5’-AGAAGCCCAAGATTGCTGGGGACCTTTGCTCGACTTTCTCC-3’。

2、印迹浸提法提取总DNA

采用印迹浸提法提取样品的总DNA：取柑桔的叶和茎，用刀片横切样品茎和 叶柄，随即均匀地压印于硝酸纤维素膜(NCM)上，干燥后，剪下NCM上1cm²面积的印迹浸泡于50μL超纯水中，即得印迹浸提液，-20℃保存。

3、LAMP扩增

在反应管中加入18μL反应液A和5μL引物液B，再加入2μL前述提取的 印迹浸提液，建立体积为25μL的扩增反应体系。64℃进行反应(水浴或者烘 箱)，反应时间为60min；然后80℃反应5min。18μL反应液A含有：2.5μ L 10×Bst buffer、6μL 25mM的MgCl₂、2μL 4mM的Betaine(甜菜碱)、 3.5μL 10mM的dNTPs、1μL 8U/μL的Bst聚合酶、3μL水；所述5μL引 物液B包括2μL 20μM的FIP、2μL 20μM的BIP、0.5μL 10μM的F3、0.5 μL 10μM的B3。

4、结果观察与验证

对前述扩增产物进行结果分析，可用肉眼观察浑浊度，结果如图1所示， 表现CCDaV典型症状的样品1中的反应液变浑浊，表明检测到了柑桔褪绿矮化 相关病毒；健康叶片的负对照样品2和水对照样品3中的反应液仍澄清，表明 未检测到柑桔褪绿矮化相关病毒。

或在扩增产物中加入1μL 100倍稀释的显色液荧光染料SYBR GREEN I， 可见表现CCDaV典型症状的样品1的扩增产物颜色由无色变为黄绿色，表明检 测到了柑桔褪绿矮化相关病毒；健康叶片的负对照样品2和水对照样品3中的 扩增产物中加入SYBR GREEN I后，离心管中的颜色仍为SYBR GREEN I的红棕色， 未发生颜色变化，表明未检测到柑桔褪绿矮化相关病毒。

5、特异性鉴定

按照前述“2印迹浸提法提取总DNA”的方法分别提取感染了柑桔衰退病毒、 柑桔鳞皮病毒、柑桔裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔 黄龙病菌以及柑桔褪绿矮化相关病毒的柑桔叶片的印迹浸提液，使用前述建立 的LAMP体系对获得的印迹浸提液进行检测，结果表明，只有柑桔褪绿矮化相关 病毒样品反应液变浑浊(如图2所示)或加入荧光燃料后由无色变为黄绿色， 说明检测到了柑桔褪绿矮化相关病毒；其余病毒反应液仍澄清或加入荧光燃料 为红棕色；说明该检测方法对柑桔褪绿矮化相关病毒检测具有特异性。

6、酶切鉴定

用BioEdit软件对柑桔褪绿矮化相关病毒LAMP扩增产物片段进行分析，筛 选出MboⅡ限制性内切酶对产物进行酶切分析，酶切产物理论值为81、108和 127bp。建立20μL的酶切体系，酶切体系为：1μL MboⅡ(10U/μL)、2μL 10X H Buffer、2μL LAMP扩增产物、15μL水。37℃反应3h，用3％的琼脂 糖凝胶进行电泳，经EB染色后用凝胶成像系统观察。结果如图3所示，柑桔褪 绿矮化相关病毒LAMP扩增产物经MboⅡ酶切后出现了与理论值相同大小的81、 108和127bp的条带，证明柑桔褪绿矮化相关病毒样品LAMP体系扩增出的确实 为柑桔褪绿矮化相关病毒目的条带。

实施例2柑桔褪绿矮化相关病毒的LAMP检测灵敏度检测

对图1中感染柑桔黄脉病的样品1的印迹浸提液模板进行10倍梯度稀释至 10⁵倍，分别采用常规PCR、实时荧光PCR和实施例1中的LAMP方法进行扩增检 测。常规PCR得到444bp的特异性扩增片段，电泳结果如图4中上排泳道所示， 样品1稀释到10³倍时常规PCR无法进行检测；当样品1稀释到10⁵倍时LAMP方 法仍可检测出CCDaV，电泳结果如图4中下排泳道所示。LAMP检测结果浑浊度 如图5所示，与电泳结果一致。当样品1稀释到10⁵倍时实时荧光PCR仍可检测 出CCDaV,检测结果如图6所示。由此可见LAMP检测的灵敏度是常规PCR的100 倍，与实时荧光PCR检测的灵敏度相同。柑桔褪绿矮化相关病毒的常规PCR所 用引物为：上游引物：5’-GTTCTGTGTTTCGACCCGTT-3’；下游引物：5’ -GGGATTCGCATGGATAGCTCATCCAA-3’。实时荧光PCR所用引物为：上游引物：5’ -GTGTTGAAGGGTTCTCATTTTTGTC-3’；下游引物：5-CTACTTGATTTAGCCGCGCTTAG-3’。