一株含有人工锌指转录因子的里氏木霉重组菌株及其应用

摘要

一株含有人工锌指转录因子的里氏木霉重组菌株(Trichoderma reesei)及其应用，属于微生物生物技术领域。该菌株于2015年4月16日保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.10649。该菌株命名为里氏木霉U5，它是将人工锌指蛋白转录因子文库转入到出发菌株里氏木霉C30中，通过纤维素酶活性筛选得到的高产纤维素酶的菌株。在麸皮诱导条件下该菌株的纤维素酶活性比野生型里氏木霉C30提高了约35％，达到了8.4酶活单位每毫升，其中β葡萄糖苷酶和野生型C30相比提高了3.5倍，达到了8.8酶活单位每毫升。里氏木霉U5纤维素酶分泌活性的增加显示出了它在可再生能源领域的潜在应用价值，也为生物质高效降解提供了一株新的微生物资源。

说明书

技术领域

本发明涉及一株含有人工锌指转录因子的里氏木霉重组菌株及其应用，属 于微生物生物技术领域。

背景技术

近年来，随着现代社会经济的快速发展和人口的持续增长，人们对能源的需 求量与日俱增，可再生能源的开发引起国内外普遍关注。纤维素和半纤维素是 世界上最丰富的可再生资源，利用纤维素酶和半纤维素酶可以将其水解为葡萄 糖和木糖，并进一步发酵生产可再生生物能源(燃料乙醇和丁醇等)，同时也可 以生产多种生物基化学品。丝状真菌和分解纤维素的细菌能生成胞外纤维素酶， 丝状真菌纤维素酶主要由三类酶组分，纤维素外切酶、纤维素内切酶和β-葡萄 糖苷酶，这些酶通过协同作用来完成对底物纤维素的降解。自然界中纤维素酶 的来源十分广泛，其中丝状真菌是产纤维素酶重要的微生物之一，里氏木霉C30 是目前公认的分泌胞外蛋白能力最强，产纤维素酶系较全的工业菌株，其胞外 分泌蛋白浓度可高达100克每升。

尽管里氏木霉具有大量的胞外蛋白质分泌，但其产酶周期长、酶活低，导致 纤维素酶的生产成本过高，不能满足大规模经济生产可再生能源和生物基化学 品的需求。国内外研究工作者已经选育出多种纤维素酶高产菌株，但是在自然 环境中直接分离得到的产纤维素酶菌种，一般产酶性能较差，不能满足工业化 生产的需要。通过人工诱变、基因工程改造等方法改良菌种的遗传性状，选育 纤维素酶活力高、酶系组成全面的产酶菌株在纤维素酶工业化生产及应用中有 重要意义。

锌指蛋白是一类细胞内的转录因子，是指具有锌指结构的转录调控因子， 在真核生物的胚胎发育、细胞分化、增强抗逆性、基因的表达调控等方面有重 要作用。锌指结构既能与RNA和DNA结合，又能与DNA-RNA双链分子以及同类 蛋白结合，在转录和翻译水平上调节和控制基因表达，因此在人工转录因子的 构建中，锌指蛋白被认为是最有前途的DNA结合域。不同的蛋白结构对应不同 的功能，根据锌指蛋白保守结构域的差异，可以将其分为C2H2(Cys2His2)型、 C4(Cys4)型和C6(Cys6)型等3个类群。C2H2型锌指是经典型锌指，是目前 研究的最多、分布最广泛的锌指。因此，可以设计人工的DNA结合域和效应区， 创建所需要的人工转录因子(Artificial Transcription Factor,ATF)，同时 调控细胞内多个基因的表达。人工转录因子技术已经成功应用于多个领域，通 过此方法已经在提高蛋白的表达产量、提高细胞耐受溶剂、渗透压、温度、pH 值特性等方面取得了成功，在酿酒酵母和大肠杆菌菌株改造中都有成功应用(参 考Nature Biotechnology,2003,21:1208-1214；Applied Microbiology and  Biotechnology,2015,99(5):2441-9)，但在丝状真菌中的相关工作还没有报 道。

本专利通过人工设计和改造锌指蛋白，进而将其导入到丝状真菌里氏木霉 细胞内，通过人工转录因子在菌体内部随机整合和激活/抑制相应调控和产生纤 维素酶基因的表达，产生一个高库容量携带锌指蛋白转录因子的里氏木霉重组 菌株库，进而通过纤维素降解活性的筛选获得纤维素降解酶酶活提高的重组菌 株。

发明内容

本发明目的是提供一株含有人工锌指转录因子的里氏木霉重组菌株及其应 用，其基因组中含有本发明所用的核酸序列(附录序列1)，其翻译产物是一种 蛋白质(附录序列2)，可以行使转录调控功能来进行纤维素酶的高效诱导表达， 在生物质高效降解中具有重要的应用价值。

本发明提供一株含有人工锌指转录因子的里氏木霉重组菌株(Trichoderma  reesei),所述菌株的登记入册编号为CGMCC No.10649，保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年4月16日。

本发明同时提供一种技术路线，可以使里氏木霉菌株获得高产纤维素酶的性 状和功能，流程方法如下：

(1)构建丝状真菌表达载体pCB303，将人工锌指蛋白文库核酸序列连接至 表达载体中，人工锌指蛋白文库基因来源于文献报道的人工合成基因(Nature  Biotechnology,2003,21:1208-1214)。

(2)将所获得的文库集合通过农杆菌介导转化转移至丝状真菌里氏木霉中。 在纤维素为诱导物条件下通过液体摇瓶发酵实验，筛选出纤维素酶活性稳定提 高的菌株。

最终得到了一株含有人工锌指转录因子的里氏木霉重组菌株U5，并对遮住菌 株进行后续的各酶活分析测定和分子机制分析。里氏木霉U5在纤维素麸皮发酵 条件下，总滤纸酶活可以比出发菌株C30提高35％，达到8.4酶活单位每毫升， 其中β葡萄糖苷酶活性提高了3.5倍，达到8.8酶活单位每毫升。通过基因转 录水平分析确定了纤维素酶活性提高部分原因是β葡萄糖苷酶基因(bgl1)过 量表达所导致。

附图说明：

图1是本发明锌指蛋白文库质粒图谱(其中ZFP-Gal4代表锌指和Gal4激 活结构域融合蛋白)。

图2是本发明纤维素酶活性变化显著菌株纤维素酶的比较。

图3是本发明中里氏木霉U5和里氏木霉C30的纤维素酶组分活性对比。

图4是本发明中锌指蛋白U5重新转化里氏木霉C30的滤纸酶活验证结果 (其中ZFP-Gal4代表锌指和Gal4激活结构域融合蛋白)。

图5是突变体基因表达水平与对照菌株的比较分析。

具体实施方式

实验材料和试剂

菌株：出发菌株里氏木霉Trichoderma reesei C30，在美国典型菌种保藏 中心(ATCC)购买，登录号为ATCC 56765。

培养基：

PDA培养基(1升内含量)：土豆粉200克,葡萄糖20克，琼脂粉20克；

麦芽浸粉培养基(1升内含量)：麦芽粉30克,琼脂粉20克；

孟德尔盐培养基(1升内的含量)：

盐溶液：(NH₄)₂SO₄ 1.4克；KH₂PO₄ 2克；Urea 0.3克；CaCl₂ 0.3克；MgSO₄7H₂O  0.3克；微量元素溶液1毫升pH 4.8；

微量元素溶液：柠檬酸，5克；ZnSO₄·7H₂O，5克；Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O，1 克；CuSO₄·5H₂O，0.25克；MnSO₄·H₂O，50毫克；H₃BO₄，50毫克；NaMnO₄·2H₂O， 50毫克；加去离子水定容到100毫升；

孢子萌发培养基(1升)：蛋白胨1.0克；葡萄糖10克；

发酵培养基(1升)：蛋白胨1.0克；微晶纤维素10克；

诱导培养基(1升)：K₂HPO₄ 2.05克；KH₂PO₄ 1.45克；NaCl 0.15克； MgSO₄·7H₂O 0.5克；CaCl₂·2H₂O 0.067克；FeSO₄·7H₂O 0.0025克；(NH₄)₂SO₄ 0.5 克；葡萄糖2.0克；pH 5.3；

共培养培养基(1升)：诱导培养基中葡萄糖浓度减半，即1.0g，另外添 加20g琼脂粉；

摇瓶筛选培养基(1升)：KH₂PO₄，1.4克；MgSO₄·7H₂O，0.3克；CaCl₂·2H₂O  0.4克；FeSO₄·7H₂O，10毫克；Urea 0.3克；微量元素1毫升，40克微晶纤 维素；30克酵母粉，20克麸皮。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子 克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试 剂盒和产品说明书进行。

实施例1：里氏木霉锌指蛋白文库构建

本发明涉及的人工锌指为Cys2His2型锌指，构建方法参考Nature  Biotechnology,2003,21:1208-1214，包含四个锌指结构域，由韩国ToolGen 公司提供。此锌指文库特征是具有来源于酿酒酵母保守的转录因子激活域Gal4， 和可变的C2H2型锌指结合结构域，库容量大约是10⁶个；双元表达载体骨架是 pCB303，该载体是由丝状真菌表达载体pAN7-1(参考Gene,1987,56:117-124) 和pCB301(参考Plant Molecular Biology,1999,40:711-717)改造而来，其 中包含有来自里氏木霉的pki启动子和trpC终止子，可将锌指蛋白文库核酸序 列插入到两酶切位点之间。本发明中的锌指蛋白文库DNA片段通过聚合酶链式 反应(PCR)从酵母锌指蛋白文库的pRS316-CYC-lib-Gal4载体上获得，并通过 Nco I和Xba I的酶切位点连入pCB303表达载体，组建并获得 pCB303-Lib-Gal-hph锌指文库，见附图1。该载体在细菌中的抗性选择标记是 卡那霉素(Kanamycin)，在真菌中选择标记是潮霉素(hygromycin)。

1.锌指蛋白与转录激活域DNA片段的获得

正向引物P1：5'-AACACAAATACACACACTAATCTAGAACTAG-3'

反向引物P2：5'–CATAACTAATTACATGACTCGAGGTCGACTTAC-3'

PCR反应条件如表1所示：

表1PCR反应条件

PCR反应体系如表2所示：

表2PCR反应体系

*该聚合酶于宝生物大连公司购买。

2.构建大肠杆菌Escherichia coli锌指蛋白文库

将上述步骤中的PCR产物和pCB303表达载体进行Nco I和Xba I双酶切， 回收后在16摄氏度下过夜进行连接反应，反应体系图表3。

表310微升连接反应体系

将锌指蛋白表达质粒文库pCB303-Lib-Gal-hph连接产物向E.coli DH5α 中转化,转化步骤参照《分子克隆实验指南》(第三版)。待培养12-16小时后， 收集卡那霉素抗性平板上的转化子。

3.构建根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens AGL-1锌指蛋白文库

混合后上步获得的转化子文库pCB303-Lib-Gal-hph接种于LB液体培养基中 过夜培养。提取质粒，再次使用电击法转化至根癌农杆菌感受态细胞AGL-1中， 转化操作方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。洗脱农杆菌并收集，最终 得到了含有锌指蛋白的根癌农杆菌文库。

实施例2：将锌指蛋白根癌农杆菌AGL-1文库转化至里氏木霉C30中

1.含有锌指蛋白的根癌农杆菌AGL-1文库按1％接种量接种于5毫升培养基中 (100微克每毫升维克每毫升卡那霉素)，28摄氏度，240转每分钟暗培养48小 时；5000转每分钟离心10分钟，收集农杆菌细胞，并悬浮于诱导培养基(IM) 中调整OD₆₆₀约为0.2，按照相同条件培养6-12小时。

2.将里氏木霉C30接种于PDA平板中，28摄氏度光照培养5-7天，用无菌水 洗下分生孢子，调整至终浓度大约10⁷孢子每毫升。

3.取100微升活化好的AGL-1和相同体积的C30孢子悬液混匀后，均匀涂布在 事先覆盖到共培养培养基(CM)的玻璃纸上，25摄氏度暗培养48小时，将玻璃 纸取下转移到含有潮霉素和(300微克每毫升头孢霉素)的基本培养基中，28摄氏 度进行培养3-7天，便会有转化子出现，及时挑取转移至新的基本培养基固体平 板中进行培养。

4.在固体培养基上培养5-6代后，用接种针将其中转化子挑取含有潮霉素抗性 培养皿中，待一周之后，将生长状态良好，并具有孢子产生的转化子保存至20％ 甘油中，-80摄氏度保存。这一步的目的是验证转化子的遗传稳定性。

实施例3：含有锌指蛋白的里氏木霉转化子纤维素活性筛选

通过PCR和抗性筛选鉴定得到里氏木霉转化子，转化子通过纤维素液体摇 瓶法进行筛选纤维素酶活性提高的突变体。在100毫升锥形瓶中加入摇瓶筛选 培养基50毫升，分别接入活化7天产生孢子的里氏木霉转化子约10⁸每毫升， 在150转每分钟，28摄氏度摇床中培养并吸取培养液，测定纤维素滤纸酶活活 性，将野生型里氏木霉C30做对照，进行酶活比较。

将初筛得到的纤维素酶活性变化明显的菌株进一步进行液体酶活发酵比较， 进一步的进行验证。

实施例4：纤维素酶活性提高的菌株鉴定和验证

进行纤维素底物发酵产酶之后，发现了几株纤维素酶活性变化显著的菌株， 即U3,U4,U5,U6，将上述转化子菌株进行发酵产酶比较，见附图2。最终确 定U5的活性最优，在纤维素麸皮发酵条件下，总滤纸酶活可以比出发菌株提高 35％左右，达到8.4酶活单位每毫升，其中β葡萄糖苷酶活性提高了3.5倍， 达到8.8酶活单位每毫升，见附图3。同时也对单独组分的酶活性进行了研究。 内切葡聚糖酶的表达量在U5突变体中达到了11.16酶活单位每毫升，野生型C30 的内切葡聚糖酶酶活是9.41酶活单位每毫升，在U5突变体中内切葡聚糖苷酶 活提高了约18％；木聚糖酶酶活在U5突变体和野生型C30中分别是1055和975.4 酶活单位，差别不显著；胞外蛋白的分泌和木聚糖酶酶活趋势类似，在U5突变 体和里氏木霉C30中胞外分泌蛋白分别是11.54毫克每毫升，11.37毫克每毫升， 差别不显著。提取里氏木霉U5的基因组，用锌指蛋白核酸序列鉴定引物分析菌 株内锌指蛋白核酸序列。锌指蛋白鉴定引物如下：

正向引物P3：5'CGACACCAACGATCTTATATCCAG 3'

反向引物P4：5'TGTGAGACCATGAGCTATTATTGC 3'

PCR反应条件和体系同表1，2相同。最终获得了里氏木霉U5内部的人工锌 指蛋白，命名为ZFP-U5，测序结果见附说明附录序列1。

通过分析，本发明里氏木霉菌株U5基因组中所含有的锌指蛋白序列是C2H2 四锌指结构，此锌指序列的蛋白质编码见附录序列2。

同时为了验证纤维素酶提高的原因确实是转入的锌指蛋白所导致。将获得的 锌指蛋白ZFP-U5的核酸序列进行Nco I和Xba I酶切，与真菌表达载体pCB303 连接，重新重复上述的转化步骤，进行重新转化验证，结果见附图4。转化后结 果表明，随机挑取的具有U5锌指蛋白序列15个菌株的纤维素酶活较野生型里 氏木霉都有显著的提高，进一步说明锌指序列的有效性。

最终通过测定一些纤维素酶组分基因在突变体中和野生型菌株中的相对转 录量，其中包括纤维素外切酶基因cbh1，β葡萄糖苷酶基因bgl1，调控里氏木 霉纤维素酶基因表达的正调控因子xyr1和调控葡萄糖苷酶基因转录表达的转录 因子bglR。通过基因转录和酶活活性测定结果发现，滤纸酶活总活性的提高和 其中β葡萄糖苷酶基因(bgl1)的转录提高和该酶的酶活性提高正相关，cbh1 基因转录也出现上调，但不够明显。基因转录结果见附图5。

附录：

序列1里氏木霉U5中的人工锌指蛋白核酸序列：

序列2里氏木霉U5中的人工锌指蛋白蛋白质序列：