一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检测方法，属于水体粪便污染检测领域。一种同时检测水中猪、狗、鸡粪便污染的试剂盒，包括引物、dNTP、PCR buffer、Mg

说明书

技术领域

本发明涉及水体污染检测领域，更具体地说，涉及一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染 的PCR试剂盒及其检测方法。

背景技术

近年来，随着人口和经济的增长，水体污染情况日趋严重，其中粪便污染尤为突出。粪便 污染物进入水体后不仅会增加水体氮磷含量，造成水体富营养化，并且会带入粪便中可能存在 的致病菌，引发疾病的水体传播(Baldursson S and Karanis P.Waterborne transmission of  protozoan parasites:Review of worldwide outbreaks‐An update 2004‐2010.Water Research 2011； 45(20):6603‐6614.)。因此进行水体粪便污染防治已刻不容缓。

粪便污染的潜在污染源种类繁多，畜禽养殖业中的猪、鸡等常见物种的粪便排泄物，由于 缺乏适当的处理，常常被直接排放到环境中，造成水体粪便污染，另外，随着宠物(尤其是宠 物狗)的数量越来越多，其产生的粪便排泄物也成为了水体粪便污染的来源之一。在点源、面 源污染同时存在的情况下，缺乏对粪便污染来源的准确掌握和定位，使得治理工作职能停留在 “见污治污”阶段，在一定程度上增加了污染治理的成本。如何寻找和区分并快速、准确定位 水体中的粪便污染源，成为了解决问题的关键。

传统粪便污染检测方法通过检测水中粪便污染指示菌(如大肠杆菌、肠球菌等)来判断水 体粪便污染情况，耗时长且无法区分污染源。通过检测水体宿主特异性微生物或化学标志物， 可以达到粪便污染溯源的目的，但现存的一些微生物及化学标志物特异性不高，往往导致假阳 性结果的产生。粪便中存在大量来自脱落肠道细胞的线粒体DNA，由于不同物种的线粒体DNA 不同，其中特定片段中存在大量单核苷酸多态位点，使得线粒体DNA具有种属特异性，可以 通过检测受粪便污染水体中的线粒体DNA片段来达到粪便污染溯源的目的(Caldwell J,Payment  P and Villemur R(2011)Mitochondrial DNA as Source Tracking Markers of Fecal Contamination.)。

以PCR为基础的分子生物学技术的快速发展为水体粪便污染的检测提供了强有力的工具。 但目前常用的基于PCR手段的粪便污染溯源方法通常只能对污染源进行单独检测(Caldwell JM  and Levine JF.Domestic wastewater influent profiling using mitochondrial real‐time PCR for source  tracking animal contamination.Journal of microbiological methods 2009；77(1):17‐22.Schill WB  and Mathes MV.Real‐time PCR detection and quantification of mine potential sources of fecal  contamination by analysis of mitochondrial cytochrome b targets.Environmental science& technology 2008；42(14):5229‐5234.)。目前尚未公开能够区分多种污染源的检测方法。本发明 通过比对不同物种的线粒体DNA序列，找到了狗、猪、鸡特异性DNA片段，并针对不同片段 设计了特异性引物，且不同引物的扩增片段长度具有一定差距，使得在一个PCR反应体系中区 猪、狗、鸡三种粪便污染源成为可能。

发明内容

1、要解决的问题

目前检测水体粪便污染的PCR方法通常是对潜在污染源进行逐个排查，耗时久且成本高。 针对此问题，本发明提供了一种能够同时检测水体中狗、猪、鸡粪便污染的PCR试剂盒及其检 测方法，可以达到快速、准确排查或检测水体粪便污染源的目的。

2、技术方案

本发明的目的通过以下技术方案实现

一种同时检测水中狗、猪、鸡粪便污染的PCR方法及试剂盒，包括引物、Taq酶、dNTP、 PCR buffer、Mg²⁺溶液和ddH₂0，其中引物包括：

引物1：5’‐CTGTGCTATGTCAGTATCTCCAG‐3’；

引物2：5’‐GGCTGATTAGTCATTAGTCCATCG‐3’；

引物3：5’‐CTACTCATACCCAGCAAGCC‐3’；

引物4：5’‐TAGGAATTAATAGGGCGGGTG‐3’；

引物5：5’‐CACATGTTATCTGCACCAGC‐3’；

引物6：5’‐GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG‐3’。

更进一步的，所述PCR buffer为10×PCR buffer，dNTP浓度为各2.5mmol/L，Taq酶浓度 为5U/ul，Mg²⁺溶液浓度为25mmol/L。。

采用上述PCR试剂盒的检测水体粪便污染的方法，具体步骤如下：提取待测水样DNA，以 待测水样DNA为模板，利用上述试剂盒中提供的引物1‐6、dNTP、PCR buffer、Mg²⁺溶液和ddH₂0 进行PCR扩增，PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯下观察条带存在情况，以此判断水体 粪便污染情况。

具体的，利用上述试剂盒检测水体粪便污染的方法为：

(1)提取水样DNA；

(2)以水样DNA为模板，利用试剂盒中提供的引物、dNTP、PCR buffer、Mg²⁺溶液和ddH₂0 进行PCR扩增，反应体系为：5ul的10×PCR buffer；5ul dNTP；0.25ul Taq酶；4ul Mg²⁺；3ul 的混合引物1‐6，其中每个引物的浓度均为10umol/L；4ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至50ul； 反应条件为95℃，预变性5min；95℃30s，59℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃ 保存；

(3)检测PCR扩增产物：将5ul PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，1×TAE作为电泳仪， EB染色，电泳条件为电压80V，电流400mA，时间25min。(4)电泳结束后在紫外灯下观察凝 胶；凝胶上出现的390bp、490bp、和783bp的条带，分别对应指示狗、猪、鸡粪便污染。

更进一步的，本试剂盒可检测到水体中单独存在或随机组合存在的狗、猪、鸡粪便污染， 最多可同时检测到以上三种粪便污染。

3、有益效果

相比于现有技术，本发明的优点在于可在一次PCR反应中同时检测狗、猪、鸡三种粪便污 染，可检测到水体中单独存在或随机组合存在的狗、猪、鸡粪便污染，对于粪便污染情况较复 杂的水体，可达到尽快排除或确定粪便污染源的目的，节约时间和成本。

本发明选取的污染标志物为不同动物的线粒体DNA，使得检测方法具有良好的特异性，电 泳检测时不同动物粪便对应的条带分离较清晰，能够准确判断不同条带的归属，降低了检测样 品的误判。

附图说明

图1：本发明对狗、猪、鸡粪便单独以及随机两种组合检测的电泳结果图。

图2：本发明对狗、猪、鸡混合粪便检测的电泳结果图。

图3：本发明的特异性检验电泳结果图。

图4：本发明的敏感性检验电泳结果图。

具体实施方式

实施例1：对狗、猪、鸡粪便单独或随机两种组合检测

同时检测水体中狗、猪、鸡粪便污染的PCR方法和试剂盒，包括引物、Taq酶、dNTP、PCR  buffer、Mg²⁺溶液和ddH₂0，其中引物包括：

引物1：5’‐CTGTGCTATGTCAGTATCTCCAG‐3’

引物2：5’‐GGCTGATTAGTCATTAGTCCATCG‐3’

引物3：5’‐CTACTCATACCCAGCAAGCC‐3’

引物4：5’‐TAGGAATTAATAGGGCGGGTG‐3’

引物5：5’‐CACATGTTATCTGCACCAGC‐3’

引物6：5’‐GTTAAGGGTACGAGTTTGTCG‐3’

上述PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司定制合成得到。

上述ddH₂O为灭菌双蒸水。Taq酶浓度为5U/ul。Mg²⁺溶液的浓度为25mmol/L，为MgCl₂溶液。dNTP的浓度为2.5mmol/L。PCR buffer为10×PCR缓冲液(购买于Takara，Code No. RR001A)

粪便DNA提取试剂盒为QIAamp DNA Stool Mini Kit，用于提取不同粪便DNA。

采集新鲜的狗、猪、鸡粪便，分别用0.2克粪便提取DNA，另外随机将两种粪便混合后提 取DNA。分别以单独或混合粪便DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：5ul的10×PCR缓 冲液(PCR buffer,Takara)；5ul脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)；0.25ul Taq酶；4ul的25mmol/L Mg²⁺溶液；3ul浓度为10umol/L的混合引物；4ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至50ul；反应条件为 95℃，预变性5min；95℃30s，59℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保存。

PCR反应结束后，分别取5ul三种粪便DNA的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条 件为电压80V，电流400mA，时间25min。

电泳结束后，将凝胶放在紫外灯下观察，胶图如图1所示。分别以狗、猪、鸡粪便DNA 为模板的PCR产物中出现了长度为390bp、490bp、和783bp的条带，狗、猪混合粪便DNA的 PCR产物中出现了长度为390bp和490bp的条带，猪、鸡混合粪便DNA的PCR产物中出现了 长度为490bp和783bp的条带，狗、鸡混合粪便DNA的PCR产物中出现了长度为390bp和783bp 的条带，说明本发明中的混合引物及所用的PCR方法能够准确检测单个狗、猪、鸡粪便污染及 随机两种混合粪便污染。

实施例2：同时检测狗、猪、鸡粪便

分别称取0.05克狗、猪、鸡粪便，混合后提取DNA，以此混合DNA为模板进行PCR扩增， PCR反应体系为：5ul的10×PCR buffer；5ul dNTP；0.25ul Taq酶；4ul的25mmol/L Mg²⁺溶液； 3ul的混合引物1‐6，其中每个引物的浓度均为；4ul模板DNA；灭菌ddH₂O补足至50ul；反应 条件为95℃，预变性5min；95℃30s，59℃30s，72℃45s，40个循环；72℃7min，4℃保 存。

PCR反应结束后，分别取5ul三种粪便DNA的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳条 件为电压80V，电流400mA，时间25min。

电泳结束后，将凝胶放在紫外灯下观察，胶图如图2所示。在以ddH₂0为模板的阴性对照 中没有任何条带，混合粪便DNA为模板的PCR产物中出现了长度为390bp、490bp、和783bp 的条带，说明本发明中的试剂盒及所用的PCR方法能够同时检测狗、猪、鸡四种粪便污染。

实施例3：试剂盒特异性验证

利用人、牛、羊、鸭粪便DNA对本发明中试剂盒和PCR方法的特异性进行验证。采集新 鲜人、牛、羊、鸭粪便提取DNA，以这四种粪便DNA为模板进行PCR扩增，同时以狗、猪、 鸡混合粪便DNA为阳性对照，ddH₂0为阴性对照，PCR反应体系和条件同实施例2，凝胶电泳 条件同实施例2，结果如图3所示。阴性对照和人、牛、羊、鸭粪便DNA为模板的PCR产物 中均没有任何条带，阳性对照中出现了长度为390bp、490bp、和783bp的条带，说明本发明 中的试剂盒及所用的PCR方法特异性好，不会出现假阳性结果。

实施例4：试剂盒敏感性验证

分别称取0.2克狗、猪、鸡粪便提取DNA，利用NanoDrop 2000测得狗、猪、鸡粪便DNA 浓度分别为3148.6ng/ul、96.5ng/ul、35ng/ul。将上述DNA等体积混合后进行4倍稀释，即稀 释4¹、4²、4³、4⁴、4⁵、4⁶倍，然后以各稀释度的DNA溶液为模板，进行PCR扩增，PCR反应 体系和条件同实施例2，凝胶电泳条件同实施例2，结果如图4所示。稀释倍数为4¹‐4⁵的PCR 产物均出现了长度分别为390bp、490bp、783bp的阳性条带，稀释倍数大于4⁵时未出现条带， 说明本发明中的试剂盒及PCR方法对应狗、猪、鸡粪的检测限分别为0.145、0.094、0034ng/ul 粪便DNA。