基于微卫星标记Epinmoyzh的云纹石斑鱼检测引物和方法

摘要

本发明公开了一种基于微卫星标记Epinmoyzh的云纹石斑鱼遗传变异检测方法。首先提取云纹石斑鱼血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用云纹石斑鱼DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对云纹石斑鱼不同地理群或云纹石斑鱼群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得云纹石斑鱼的遗传多态性图谱。本发明可快捷的获得云纹石斑鱼遗传标记Epinmoyzh的遗传变异图谱，方法简便，所得结果可直观地检测出云纹石斑鱼每个个体的基因型；应用于不同地理群或云纹石斑鱼群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。

说明书

技术领域

    本发明属于云纹石斑鱼（Epinephelus moara）DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测云纹石斑鱼微卫星标记Epinmoyzh的技术方法，具体是云纹石斑鱼微卫星标记Epinmoyzh的检测方法。

背景技术

云纹石斑鱼（Epinephelus moara）属鲈形目、鮨科、石斑鱼属，俗称草斑、油斑，分布于北太平洋西部，我国产于东海和南海。它肉味鲜美，口感爽滑，蛋白质含量高，营养丰富，深受广大消费者青睐。云纹石斑鱼生长快、适应性强、经济价值高、适应于池塘、网箱和室内工厂化养殖。但云纹石斑鱼自然资源量少，难以满足人们的需求。2010年，中国水产科学研究院黄海水产研究所、福建省水产研究所与烟台市莱州明波水产公司联合攻关，首次在我国北方获得规模化繁育成功，为北方开展石斑鱼养殖奠定了坚实的基础。云纹石斑鱼已成为我国目前最具发展潜力的海水养殖新品种之一。云纹石斑鱼作为一种新兴的养殖品种，遗传学研究相对薄弱，还没有微卫星标记开发的报道。虽然同工酶标记、RAPD标记及AFLP标记技术也可以用于研究云纹石斑鱼的遗传结构及其遗传多样性，然而由于这些标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低， RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星标记检测效率高，结果稳定。但由于缺乏云纹石斑鱼微卫星标记，限制了其分子遗传学研究的发展，所以迫切需要获取微卫星标记以进行云纹石斑鱼遗传多样性、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。

发明内容

    本发明的目的是提供一种高多态性的云纹石斑鱼DNA分子遗传标记技术，即云纹石斑鱼微卫星标记Epinmoyzh的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。

本发明主要是利用云纹石斑鱼DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测云纹石斑鱼每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物（微卫星标记Epinmoyzh）对云纹石斑鱼的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从云纹石斑鱼DNA序列中获取了一个微卫星标记，命名为Epinmoyzh，该微卫星标记Epinmoyzh可用于云纹石斑鱼遗传多样性分析和系谱认证。

本发明是按照以下操作技术方案完成的：首先提取云纹石斑鱼血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用云纹石斑鱼基因组DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对云纹石斑鱼不同地理群或云纹石斑鱼群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得云纹石斑鱼的遗传多态性图谱。

    提取云纹石斑鱼基因组DNA，将其稀释为100ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。

含有微卫星序列的DNA序列为：

tacaatgatc atactgcacg ggcaatggaa ttcagtaagc attttagcta

cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaga acacacacac

taaaattttt aacgttaagt tgctagattt cccaggagac cagctgaaac

tgaatgcatt tgttgattac ggc

其中微卫星核心序列为：cacacacacacacacacacacacacacacacacacacaga acacacacac

Epinmoyzh微卫星引物序列为：

正链5’-TACAATGATCATACTGCACGG-3’，

负链5’-GCCGTAATCAACAAATGCATTC-3’，使用该引物时的退火温度为52℃。

微卫星核心序列和引物序列是本发明的核心，在云纹石斑鱼遗传多样性检测中呈现多态性。

PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng云纹石斑鱼基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg²⁺ 1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述的引物各10pmol；加ddH₂O至25μl。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：94℃变性2min；94℃30sec，52℃45sec，72℃40sec,该反应进行35个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。

PCR产物的检测步骤：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到云纹石斑鱼微卫星标记Epinmoyzh的多态性图谱。

本发明的有益效果是可快捷的获得云纹石斑鱼的Epinmoyzh微卫星标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出云纹石斑鱼每个个体的基因型；而应用于不同地理群或云纹石斑鱼群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。

附图说明

图1是本发明微卫星标记Epinmoyzh对云纹石斑鱼20个个体的检测图谱 (编号1—20是云纹石斑鱼的20个个体)。

具体实施方式

    下面通过实施例详细叙述本发明在云纹石斑鱼Epinmoyzh微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取云纹石斑鱼血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用云纹石斑鱼DNA序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对云纹石斑鱼不同地理群或云纹石斑鱼群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得云纹石斑鱼的遗传多态性图谱。

1、云纹石斑鱼基因组DNA的提取：将100μl云纹石斑鱼血液加入Eppendorf管中，再加入细胞裂解液 500μl和20mg/ml的蛋白酶K 5μl，轻轻摇匀，37℃过夜。然后在裂解好的样品中加入600μl酚氯︰仿︰异戊醇（25︰24︰1）混合液，晃动20min后12000rpm 离心10min，取上清液。再加入酚︰氯仿︰异戊醇混合液，重复上述操作3次。再取上清液，加入2倍体积冷却的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，12000rpm 离心10min，弃去上清液，保留DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤该沉淀2次，待乙醇挥发完全后，以TE 缓冲液溶解DNA，并稀释为100ng/μl，4℃保存。

2、微卫星引物的设计：在云纹石斑鱼DNA序列基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的根源。本发明的微卫星区核心序列两端的特异性引物序列为：正链5’- TACAATGATCATACTGCACGG -3’，负链5’- GCCGTAATCAACAAATGCATTC -3’，使用该引物时的退火温度为52℃。

3、PCR扩增：首先加样，加样量如下：云纹石斑鱼基因组DNA(100ng／L)，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg²⁺ (25mmo1／L)，1.5μl；Taq酶  (5u／μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmo／L)，1μl；引物(各10pmol／μl)，1μl；加灭菌水至25μl。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为：94℃变性2min；94℃30sec，52℃45sec， 72℃40sec，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

4、PCR产物的检测：将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电泳仪功率为15W，电泳时间为1.5小时左右。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到云纹石斑鱼在Epinmoyzh微卫星核心序列的多态性图谱，如图1所示。图1结果表明，云纹石斑鱼的20个个体共扩增出7个等位基因，说明微卫星标记Epinmoyzh具有较高的多态性，适合进行云纹石斑鱼遗传多样性和遗传结构分析、个体识别和系谱认证等方面的研究和应用。

<110> 烟台大学

<120> 基于微卫星标记Epinmoyzh的云纹石斑鱼检测引物和方法

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<210> 1

<211> 173

<212> DNA

<213> 云纹石斑鱼（Epinephelus moara）

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<222> (51)...(100)

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   tacaatgatc atactgcacg ggcaatggaa ttcagtaagc attttagcta cacacacaca    1

  cacacacaca cacacacaca cacacacaga acacacacac taaaattttt aacgttaagt    61

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