马氏珠母贝微卫星引物的批量开发及选育系和珍珠囊的标记分析

摘要

通过构建马氏珠母贝珍珠囊转录组文库结合高通量测序技术，共得到了102，762个Unigene序列。对这些序列进行比对拼接处理，最后获得99127个无冗余的EST序列。筛选EST-SSR标记，从EST数据库中搜索到含有微卫星的序列6034个，占整个EST序列数据库的6.1％。利用Primer3软件进行引物批量设计，一共发现了6595个微卫星位点，其中可以用来设计引物的位点有4487个，占总位点的68.0％。完美型微卫星6368个，占总位点的96.6％，混合型227个，占总位点的3.4％。在完美型中，单碱基重复1166个，双碱基重复460个，三碱基重复2000个，四碱基重复2242个，五碱基重复330个，六碱基重复170个。其中三碱基重复和四碱基重复是主要的类型，分别占总SSRs的30.3％和40％。引物扩增比例平均为82.3％，多态位点比例平均为60.6％。利用EST序列数据，合成并初步筛选了1400对，其中效果较好324对。选用多态性良好的引物50对，对黄壳色选育系、基础群体及快速生长系各30个个体进行PCR扩增，分析其遗传多样性参数，结果表明：选用的50个微卫星位点均呈现出多态性，共检测到200个等位基因。每个座位的等位基因数在2.8个之间，平均等位基因数4个，其中位点4-PM164检测出的等位基因最多达8个。平均多态信息含量为0.413，为中度多态位点。批量多态性EST-SSR标记的开发，为马氏珠母贝及相关种群分子遗传学研究、种质鉴定和野生资源保护等研究提供可靠的工具。
　　筛选10对扩增条带数目适中的微卫星引物分析了金黄壳色系F3和基础群体的遗传多样性。结果表明：在10个多态位点中共检测出40个等位基因，平均每个位点产生4个，每个位点的等位基因数从2-6不等；金黄壳色系F3和基础群体的平均有效等位基因数分别为2.2862和2.2646，平均表观杂合度分别为0.4119和0.4403，平均期望杂合度分别为0.5333和0.5464，平均多态信息含量分别为0.4722和0.4655；两个群体的平均遗传分化系数为0.0389，属于轻度偏中度分化水平。研究表明，经过3代连续选择后，选系仍然具有较高的遗传多样性。
　　选用不同家系分别作为供体贝和受体贝进行插核育珠，插核时取供体贝外套膜组织，插核后2月时取受体贝珍珠囊、闭壳肌。采用10对多态性良好的微卫星引物，分别对供体和受体进行PCR扩增，以鉴别珍珠囊细胞的来源，结果表明，大部分个体的珍珠囊是与受体闭壳肌条带一致，只有引物2-PM162、4-PM358和1-PM38在少部分的珍珠囊(约1/5左右)可检测到供体的特异性条带。显然，受体细胞在珍珠囊中占优势，换句话说珍珠囊细胞是由供体和受体共同组成的。通过二月期取材的30个珍珠囊的切片观察，也表明在珍珠囊周边的结缔组织细胞混合状态含量不均匀。由于供体小片的细胞数量与受体参与的细胞数量相比是很少的，因此，微卫星引物扩增时，数量占优的受体模板会抑制供体模板的作用，从而产生了大多数珍珠囊的供体特征带不能显示。本文采用两个不同家系的DNA混合模板进行PCR扩增试验验证，发现当一个家系的DNA含量是另一个家系的5倍以上时可产生完全抑制作用。据此推测，在成熟珍珠囊的细胞组成中，受体的细胞数量一般为供体的5倍以上。