一种删除转基因水稻筛选标记基因的方法

摘要

本发明提供了一种删除转基因水稻标记基因的方法，属于植物基因工程领域。本发明利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑技术建立了一个在植株水平上高效率删除转基因水稻标记基因的方法。利用本发明的方法可以有效地删除整段标记基因，并且能够针对性地只删除标记基因的表达框，而不改变转基因水稻中其他成分的表达。因此利用本发明的方法可以高效率培育无筛选标记基因的转基因水稻，从而能完全消除人们对筛选标记基因的安全性疑虑。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种可以 删除转基因植物筛选标记基因的方法。

背景技术

在转基因植物中，导入植物体内的外源基因除了目的基因之外，还有筛选标记基 因及其他相关基因。目的基因是用来优化或赋予植物特定性状的基因；筛选标记基因则 能赋予转基因植株抗某种抗生素或除草剂等特性，在转基因过程中的使用可以大大提高 转基因植物筛选的效率。除了目的基因人们对转基因植物的担忧主要集中在筛选标记基 因上，尽管还没有确切的证据证实筛选标记基因确实存在安全隐患，但筛选标记基因的 安全性问题已受到世界各国政府和组织的重视，并已成为限制转基因植物产业化和商业 化发展的主要瓶颈。因此，如何删除筛选标记基因以提高转基因植物的安全性一直是基 因工程研究的热点之一。

长期以来，筛选标记基因及其产物是否会对环境或人类健康产生影响，引起了人 们广泛关注。为解决可能因选择标记引起的安全问题，一些科学家采用了较为安全的基 因作为选择标记，如6-磷酸甘露糖异构酶基因、木糖异构酶基因等。但这种替换策略仍 未能完全消除人们对筛选标记基因的安全性疑虑，从根本上讲，彻底删除转基因植物中 的筛选标记基因，培育无选择标记的转基因植物，才是解决选择标记安全性顾虑的最根 本策略。因此，无选择标记转基因植物的研究和培育已成为国际上植物基因工程领域的 一个趋势。目前，应用于水稻系统中的分子删除系统效率比较低，且需要在组织培养阶 段进行诱导处理，不利于规模化操作。

发明内容

鉴于此，本发明巧妙地、以本发明特有的方式利用CRISPR/Cas9系统介导的基因 组定点编辑技术建立了一个在植株水平上高效率删除转基因水稻筛选标记基因的方法。

原理介绍

CRISPR/Cas是广泛存在于细菌或古生菌中的一种获得性免疫系统。CRISPR位点 是位于细菌染色体上或质粒上的一段特异DNA序列，由一系列短的高度保守的正向重 复序列和与之长度相似的间隔序列间隔排列组成。Cas9基因是与CRISPR重复序列相连 的保守的CRISPR相关蛋白基因。基于CRISPR/Cas9系统的特异识别切割特点，目前应 用较为成功的是经过改造的来自产脓链球菌的CRISPR/Cas9系统。Jinek等首次实现了 基于CRISPR/Cas9系统诱发的DNA双链断裂，为CRISPR/Cas9的进一步应用提供了基 础。Cong等首次利用CRISPR/Cas9系统对人293T细胞的EMX1以及小鼠细胞的Th实 现了定点突变，目前CRISPR/Cas9技术已成功应用于大肠杆菌、肺炎双球菌、斑马鱼、 果蝇和小鼠中。最近，CRISPR/Cas9在植物中是应用也取得了重大突破，Li等利用 CRISPR/Cas9在拟南芥和烟草中也成功实现了基因组的定点突变，并发现突变效率与 gRNA的表达量有关；同时证明CRISPR/Cas9系统可同时对多基因或单基因的多个位点 进行定点编辑。Nekrasov等利用CRISPR/Cas9系统成功实现了烟草基因PDS的定点突 变，突变率为1.8％-2.4％。

CRISPR作为一种新的靶向基因修饰技术，目前已经应用于水稻、小麦、拟南芥等 基因的定点修饰研究中，但尚未有进行重要农作物目标农艺性状进行改良的研究。

考虑到CRISPR/Cas9技术特性，本发明巧妙地将其应用于转基因水稻筛选标记基因 的删除，实现了转基因水稻筛选标记基因的高效率删除。

具体而言，本发明提供了一种在植株水平上高效率删除转基因水稻筛选标记基因的 方法，利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑技术，建立无筛选标记基因的水稻 转基因体系，为培育具生物安全的转基因水稻新品种提供一个新途径，为安全、高效的 水稻转基因育种提供基础。本发明可以用于删除转基因水稻基因或其片段中的筛选标记 基因，下文中也可以将这样的基因或片段称为原载体。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

1)在水稻筛选标记基因所转入的原载体中标记基因编码框上游序列区选取第一靶 标片段，并且在标记基因编码框下游序列选取第二靶标片段，所述第一和第二靶标片段 的一条链均具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，其中(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁， N₂……N_X}，N₁，N₂……N_X中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中 N为碱基A、G、C、T中的任意一个；

2)按照所述第一和第二靶标片段的核酸排列顺序，构建用于水稻基因打靶的 CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包括具有所述靶标片段的向导RNA表达框以及 Cas9核酸酶表达框；

3)制备含有所述筛选标记基因的转基因水稻的愈伤组织，备用；

4)将步骤2)所获得的重组载体导入步骤3)中获得的愈伤组织中的水稻细胞，诱 导所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，对待 删除的标记基因编码框启动子上游及终止子下游的区域实现同时剪切，造成双链断裂。 同时触发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点造成缺失碱基，实现细胞内筛选 标记基因、上游启动子及下游终止子的片段缺失；

5)通过原生质体瞬时转化或农杆菌介导的稳定转化获得再生植株，通过基因组PCR 方法克隆再生植株中含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。

6)选择筛选标记基因编码框完全缺失的转基因植株。

在一种优选实现方式中，所述第一靶标片段中5’-(N)_X-NGG-3’结构的X的数值与所 述第二靶标片段中5’-(N)_X-NGG-3’结构的X的数值彼此不同，在另一种实现方式中，二 者彼此相同。

在一种优选实现方式中，X为19或20。

在一种优选实现方式中，用于水稻基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，为双靶点重 组载体。

在一种优选实现方式中，所述第一靶标片段位于驱动筛选标记基因表达的启动子的 上游，序列为5‘-GTGGACGAGATTAGATAGCC-3‘，原载体可以用于组装其它高效位点 特异性识别序列。

在一种优选实现方式中，所述第二靶标片段位于终止筛选标记基因表达的终止子的 下游，序列为5’-TAGCCCTGCAGGAAATTTAC-3‘，原载体可以用于组装其它高效位点 特异性识别序列。

在一种优选实现方式中，原载体中含有报告基因GUS，原载体可以用于组装具有特 定功能的基因。

在一种优选实现方式中，所述筛选标记基因指潮霉素基因、抗除草剂基因、木糖异 构酶基因、抗生素抗性基因等。

在一种优选实现方式中，所述具有特定功能的基因指抗虫基因、抗病基因、抗除草 剂基因、抗逆基因、抗衰老基因、品质功能改良基因以及由上述基因组成的融合或多价 基因。

在一种优选实现方式中，所述水稻是指籼稻和粳稻。

在上述方法的具体实现过程中，本发明利用载体pCAMBIA1300，获得带有筛选标 记基因的日本晴转基因植株。

另一方面，本发明还提供一种用于水稻基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述载 体含有骨架载体、靶标片段1和靶标片段2。

优选地，第一靶标片段的核苷酸序列为5’-GTGGACGAGATTAGATAGCC-3’， 第二靶标片段的核苷酸序列为5’-GTAAATTTCCTGCAGGGCTA-3’。所述第一靶标片 段位于筛选标记基因启动子的上游区域，第二靶标片段位于筛选标记基因终止子下游区 域；优选地，靶标片段靠近启动子或终止子区域，且为非水稻基因组序列或同源序列。

本发明将上述重组载体导入含有筛选标记基因的水稻细胞中，通过细胞再生若干水 稻植株。将重组载体导入水稻细胞的方法为PEG介导的水稻原生质体瞬时转化或农杆 菌介导的水稻愈伤组织稳定转化。并且，本发明通过基因组PCR方法克隆再生植株中 含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。通过测序鉴定筛选标记基因删除效果。 此外，为达到完全删除筛选标记基因效果，筛选标记基因编码框及启动子和终止子完全 缺失的植株。

技术效果

本发明建立了一个删除转基因水稻筛选标记基因的方法。本发明的方法对靶位点 的识别依赖于核酸之间碱基的互补配对，可对任何紧随NGG的20bp的靶点序列进行 编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很高；另本发明的方法可同时对同一基因的不同 位点或多个基因的位点进行定向编辑，使其运用更加灵活；此外本发明的方法操作简单 快捷，更适宜规模化、高通量操作。总之，本发明的方法作为一种新的基因定向编辑技 术，展现了广阔的发展潜力和应用前景。相对于其他筛选标记基因删除方法，本发明的 方法有以下优点：

①删除效果彻底，本发明采用特殊设计的重组载体，结合CRISPR/Cas9打靶技 术，实现了高效地定向删除筛选标记基因的表达框，包括筛选标记基因序列、启动筛选 标记基因表达的启动子，终止筛选标记基因表达的终止子，从而彻底敲除了筛选标记基 因的转录和表达。本申请的发明人采用其他重组载体也进行了类似实验，效果均远不如 本发明所采用的载体。

②针对性强，本发明只删除了筛选标记基因的表达框，而不改变转基因水稻中其 他成分，不影响转基因水稻的农艺性状。

③周期短，即在转基因当代就可去除筛选标记基因。

④使用安全，CRISPR/Cas9打靶重组载体引入的筛选标记基因，可通过传代进行 分离，而无需进行其他的删除技术进行删除。

⑤适用性广，能适合不同的水稻品种，如日本晴、9311等。此外，不仅适用于单 子植物，如水稻、小麦、大麦、玉米等，还适合于双子叶植物，如烟草，马铃薯、棉花、 番茄等。

现有的CRISPR/Cas9技术仅仅能够实现定点地对于某几个基因进行敲除，并不能 实现筛选标记基因的整体去除。而采用本发明的方法能够完整地切除整个筛选标记基因 片段，而不会造成其他有用基因的缺失。并且，本申请人发现，采用本发明的引物能够 使切除的效率更高，上下游片断保留更加完整，而采用其他引物则效率明显降低。

本发明可消除由于使用筛选标记基因可能对生态、环境、食品安全等带来危害的 风险。并且，利用该技术为培育具生物安全及食用安全的转基因水稻新品种提供一个新 途径，也为安全、高效的水稻转基因育种提供基础。

附图说明

下面结合附图来详细说明本发明的具体实施方案，进行说明。附图中：

图1为本发明的CRISPR/Cas9重组载体示意图。用OsU3启动子驱动靶标片段1和 sgRNA的表达，OsU6启动子驱动靶标片段2和sgRNA的表达。

图2为对本发明的CRISPR/Cas9重组载体酶切验证的结果示意图。其中，对重组载 体进行BsaI单酶切，大片段表示的是线性化的CRISPR/Cas9打靶载体，小片段包含靶 标序列1和序列2在内的片段。

图3为通过农杆菌介导的转基因水稻株系中删除筛选标记基因结果，PCR检测部分 结果图。其中，扩增出的500bp左右条带，表示PMI编码框被切除。而扩增出的3730bp 左右条带，表示PMI编码框未被切除。图中有2条500bp左右条带，说明已成功删除 转基因水稻植株中的筛选标记基因PMI。

图4为通过农杆菌介导的转基因水稻株系中删除筛选标记基因测序结果，其中WT 表示为转基因水稻株系中PMI编码框未被删除，“-”表示发生了删除突变的序列。测序 结果说明，该发明不仅已成功删除转基因水稻中的标记基因PMI，而且靶标序列也出现 不同程度的碱基缺失。

图5为删除标记基因前后水稻种子GUS染色图。A为删除标记基因前的转基因水 稻种子的GUS染色图；B为删除标记基因后的转基因水稻种子的GUS染色图。结果说 明，标记基因在删除前后，转基因水稻种子的胚和胚乳都有着色，且染色结果没有明显 的差异。说明本发明在成功删除标记基因后，并不改变转基因水稻中其他成分如报告基 因的表达。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用 于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的 药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

载体的构建

在本实施例中，利用载体pCAMBIA1300获得带有筛选标记的日本晴转基因植株。 并且以筛选标记基因PMI、报告基因GUS为例来进行说明。根据已获得的含有PMI标 记基因的转基因水稻中的PMI编码框的特性，选取合适的打靶位点，本发明选了靶标片 段1：5’-GTGGACGAGATTAGATAGCC-3’和5’-TAGCCCTGCAGGAAATTTAC-3’，分 别合成OsU3启动子，靶标序列1、SgRNA的编码框、OsU6启动子、靶标序列2、SgRNA 的编码框(上述各片段的合成均采用常规方法进行，这里不予以详细论述)并在该合成 片段上载有BsaI酶切位点(图1)。同时用限制性内切酶BsaI对CRISPR/Cas9打靶载体 质粒进行酶切，将合成片段和打靶载体质粒的大片段进行连接。通过抗性培养基筛选(构 建成功的载体只在Kana上生长，在Spec上不生长)、菌落PCR筛选重组子和酶切验证 (结果如图2所示)正确的，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序并将测序。 验证正确的克隆即为本发明所构建的CRISPR/Cas9重组载体。该重组载体含有靶标序列 1的向导RNA编码框、靶标序列2的向导RNA编码框，及Cas9核酸酶的编码框。提 取该重组载体质粒用于转化农杆菌EHA105。挑取阳性克隆用甘油保存在-80℃，并用于 水稻遗传转化。

上述各片段中

OsU3启动子的序列为:

AAGGGATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTT AAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCAT AGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAA CACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGATGTGAAGAAGTAAGATAAACTGTAGGAGA AAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCC GGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTAT CCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCA

OsU6启动子的序列为:

GGATCATGAACCAACGGCCTGGCTGTATTTGGTGGTTGTGTAGGGAGATGGG GAGAAGAAAAGCCCGATTCTCTTCGCTGTGATGGGCTGGATGCATGCGGGGGAGC GGGAGGCCCAAGTACGTGCACGGTGAGCGGCCCACAGGGCGAGTGTGAGCGCGA GAGGCGGGAGGAACAGTTTAGTACCACATTGCCCAGCTAACTCGAACGCGACCAA CTTATAAACCCGCGCGCTGTCGCTTGTGTG

SgRNA的序列为:

gttttagagctatgctgaaaagcatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctt ttttttagtagtagcatctgacggtgaagggggcggccgcgg

农杆菌介导的水稻遗传转化：

(1)PMI抗性愈伤的获得：以已获得带有PMI筛选标记的日本晴转基因种子为材料。 选取不带病斑、胚发育良好的含有PMI标记基因的转基因水稻种子去颖壳，消毒后的种 子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于含有PMI筛选剂的诱 导培养基上。每皿均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至 长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)转基因植株的获得：利用农杆菌介导的遗传转化方法，将构建好CRISPR/Cas9打 靶的重组载体转化至含有PMI标记基因的转基因水稻愈伤中，具体转化过程参考了文献 Duan等人在“An Efficient and High-throughput Protocol for Agrobacterium-mediated  Transformation based on Phosphomannose Isomerase Positive Selection in Japonica Rice (Oryza sativa L.).Plant Cell Reports(2012)”中公开的方法。其中，使用到的筛选剂为潮 霉素，为CRISPR/Cas9打靶的重组载体中包含的潮霉素基因的编码产物。

在转化时，由于采用了本发明所构建的重组载体以及特定的靶标片段，能够诱导 靶标片段1、2的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，对待 删除的标记基因编码框启动子上游及终止子下游的区域实现同时剪切，造成双链断裂。 同时触发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点造成缺失碱基，实现细胞内筛选 标记基因、上游启动子及下游终止子的片段缺失。

标记基因删除效果鉴定：

(1)PCR扩增检测：利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司生产)，提取 所获42棵再生植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶 (NEB公司生产)，PCR扩增包含靶标区域的序列，部分结果如图3所示。其中PCR扩 增所用的引物为：

gc CHECK FP:5’-GAGGTAGATACGGTAACAAGG-3’

gc CHECK RP:5’-CGCCTTGAGCGACACGAATT-3’

(2)测序检测：以gc CHECK FP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标 区域的序列缺失情况。测序结果表明，在所测42棵植株中，18棵植株带有不同大小片 段的缺失。其中两个等位PMI表达框都出现缺失的再生株系为2株，同时出现删除等位 标记基因效率为4.9％。图4中显示的是转基因水稻中含有的PMI编码框及靶标序列位 置，及2株等位PMI编码框删除的示意图。

(3)GUS染色检测：待删除标记基因的转基因水稻已转化了pCAMBIA1300载体， 其含有GUS基因，所以在转基因水稻基因组中已插入了GUS基因。经GUS化学组织 染色后，种子的胚乳和胚组织显示蓝色。本发明在成功删除转基因水稻的标记基因后， 同样对所得植株进行了GUS染色。结果显示，所得植株的种子的胚乳和胚组织显示蓝 色，和删除标记基因前的组织GUS染色水平没有明显的差异。因此说明，本发明在删 除标记基因的同时，不会影响其他成分的表达。本发明采用pCAMBIA1300载体进行标 记基因删除，效率非常高。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发 明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。