一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达方法及其应用

摘要

本发明涉及一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达方法及其应用。本发明通过同源重组技术，在受体的靶基因启动子之后，靶基因的基因序列之前，插入一个第二启动子及筛选标记基因，并通过筛选标记筛选获得阳性结果，从而实现原位激活基因的表达。本发明的表达方法可用于原位激活基因的过表达，从而应用于基因的功能研究领域。

说明书

技术领域

本发明涉及基因转录调控研究领域，具体涉及一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达方法及其应用。

背景技术

基因的表达调控受到多个层次的调控，包括转录水平和转录后水平，对于编码基因还包括翻译水平和翻译后水平的调控等等。

不同的基因在表达的时候也受到不同形式的调控。在研究基因功能时常通过功能缺失实验（loss of function）和功能获得实验（gain of function）两种方式来实现对基因功能的研究。其中功能缺失实验常用的方式有RNA干扰技术（RNAi Interference，RNAi）等技术实现对靶标基因表达的下调，而功能获得实验常用的方式利用表达载体表达基因的cDNA序列实现基因产物的过表达。

表达载体是一种可以在原核生物和真核生物细胞中外源表达蛋白或者RNA的一种环形双链DNA分子，被广泛应用于研究蛋白、RNA等生物大分子在细胞生命活动中的作用。按照应用的宿主不同可分成原核表达载体和真核表达载体。常见的原核表达载体有pET系列、pQE系统、pGEX系列、pMAL系列等多种。而真核表达载体则根据适用的物种不同分酵母表达载体，植物表达载体和真核哺乳动物载体等多种。

在目前的研究中，研究者通常将基因的cDNA序列克隆到表达载体中进行过表达，实现功能过表达。此种方式已用于外源过表达蛋白编码基因基因和外源表达microRNA等。虽然此种方式已发展成熟，但实际操作过程中经常会遇到很多问题，如不能反内源的应基因表达环境，表达产物不能实现正常定位等等。特别是近年来有关长非编RNA（long noncodingRNA，lncRNA）的研究让人们进一步意识到这种表达方式存在的不足。

长非编码RNA（long noncoding RNAs，lncRNAs）是一类存在于细胞中，长度大于200nt且不编码蛋白质产物或者编码不具有功能的蛋白质产物的RNA分子。已有的研究已发现了多种类型的lncRNAs，且lncRNAs可通过参与染色质重塑，染色质高级结构维持等多种方式参与基因表达调控，同时还可参与细胞核内亚核结构的形成等等。

人们发现用传统的表达载体进行lncRNAs的过表达时，过表达的RNA往往不能实现正确的亚细胞定位。这有可能是由于过表达cDNA序列时，过表达的RNA无需经过类似于内源基因的RNA加工（RNA processing）过程，如剪接（splicing）；同时表达成熟的lncRNA也与外源表达的蛋白质不同，其分子上可能不具有特殊的细胞内不同位置的定位信号等等。因此，一种类似内源表达的方式实现对靶基因的过表达对于研究lncRNA的功能具有十分重要的作用。

CCAT1-L是一条在结肠癌中高表达的长非编码RNA。原位杂交实验结果显示CCAT1-L分布在细胞核中，呈点状分布（如图Fig1A），并聚集在其转录位点附近（如图Fig1B）。功能获得实验对于研究CCAT1-L的生物学功能具有十分重要的作用。然而，利用传统的载体过表达lncRNAs的实验结果显示，利用外源载体过表达的CCAT1-L分布在整个细胞中,即在细胞核和细胞浆中都有分布（如图Fig1C）。这说明传统方式过表达的CCAT1-L无法模拟内源RNA的定位情况，即无法正确发挥该RNA的生物学功能。利用此种方式过表达CCAT1-L可能导致获得不正确甚至错误的实验结果。因此，一种可以模拟细胞内源CCAT1-L过表达的实验方法对于研究其功能具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用基因组编辑技术实现原位激活基因的表达系统及其应用，尤其是利用基因组编辑技术实现原位激活长非编码RNA基因的表达方法及其应用。

本发明首先公开了一种原位激活长非编码RNA基因的表达方法，为：通过同源重组技术，在受体的靶基因启动子之后，靶基因的基因序列之前，插入一个第二启动子及筛选标记基因，并通过筛选标记筛选获得阳性结果。

所述阳性结果为筛选获得的阳性细胞，可培养所述阳性细胞以原位激活所述长非编码RNA基因的表达。

所述原位激活长非编码RNA基因的表达，是指激活的长非编码RNA基因的表达与内源长非编码RNA基因的表达定位一致,可以更进一步的模拟内源长非编码RNA的功能。

所述靶基因即为待激活的长非编码RNA基因，具体的，如CCAT1-L。

进一步扩展的，所述长非编码RNA基因也可以为编码基因，靶基因即为待激活的编码基因。

具体的，本发明的原位激活长非编码RNA基因的表达方法包括下列步骤：

1）构建特异识别靶序列TALEN质粒；

2）设计并构建Donor质粒，所述Donor质粒的左右同源臂之间包括顺序串联的第二启动子及筛选标记基因；

3）将步骤1）和2）构建的TALEN质粒和Donor质粒转入受体细胞，通过同源重组对受体细胞进行基因组改造，培养受体细胞并根据筛选标记筛选获得阳性结果并验证。

步骤1）中，所述TALEN质粒所针对的靶位点位于靶基因的启动子与其基因起始序列之间。所述TALEN质粒不应破坏受体基因组中靶基因的启动子及其基因。

步骤2）中，所述Donor质粒对应的同源重组靶序列位于靶基因的启动子与其基因起始序列之间。所述Donor质粒能保证同源重组后，插入的启动子、筛选标记基因、及靶基因读框正确。

所述第二启动子可选自CMV启动子、EF1alpha启动子等。所述筛选标记基因可以为抗性基因和荧光蛋白标记基因。所述抗性基因如puromycin（嘌呤毒素）抗性基因或者blasticidin（杀稻瘟素）抗性基因等。所述荧光蛋白标记基因如EGFP、YFP荧光蛋白标记基因等。

进一步的，所述Donor质粒的左右同源臂之间，筛选标记基因之后，还顺序插入有终止序列及可诱导的启动子。该设计可实现靶基因可诱导地过表达。

具体的，所述终止序列可为BGH和SV40两种终止序列。该设计可完全终止第二启动子驱动的转录。所述可诱导的启动子可为Ptight启动子。

当插入可诱导启动子时，可培养所述阳性细胞并诱导所述长非编码RNA基因的表达。

如本发明具体实施例列举的，所述Donor质粒的左右同源臂之间包括顺序串联的CMV启动子、puromycin抗性基因和EGFP荧光蛋白标记基因。

进一步优选的，所述puromycin抗性基因和EGFP荧光蛋白标记基因之间还插入有T2A序列。

为进一步实现靶基因可诱导的过表达，所述左右同源臂之间，EGFP荧光蛋白标记基因之后还顺序插入有BGH和SV40两种终止序列以及Ptight启动子。

步骤3）中，对阳性结果的验证方法可以选自qPCR、Northernblot、RNA荧光原位杂交实验、以及RNA/DNA双荧光原位杂交实验。

本发明所述的原位激活长非编码RNA基因的表达方法，也可作为一种过表达长非编码RNA基因，以模拟内源RNA的正确定位情况，以研究RNA功能的实验方法。

本发明所述的表达方法可用于原位激活长非编码RNA基因的过表达，从而应用于LncRNA的功能研究领域。所述长非编码RNA基因的过表达能实现正确的亚细胞定位。

本发明所述的表达方法同样可扩增应用于原位激活编码基因的过表达，从而应用于编码基因的功能研究领域。

本发明的有益效果：本发明在国际上首次实现靶基因的原位激活，为过表达包括长非编码RNA在内的基因和研究其功能提供了新的方法和思路。

附图说明

图1A:野生型RNA荧光原位杂交结果

图1B：野生型内源CCAT1-L RNA/DNA双荧光原位杂交结果

图1C:传统质粒过表达CCAT1-L原位杂交结果

图2A:实施例1构建的Donor质粒结构示意图

图2B：实施例1基因组编辑PCR验证结果

图2C：实施例1过表达RNA RT-qPCR验证结果。WT代表野生型，1-4代表各突变型。

图2D：实施例1Northernblot验证试验结果

图2E:实施例1RNA荧光原位杂交实验（RNA FISH）验证结果

图2F:实施例1RNA/DNA双荧光原位杂交实验（RNA/DNA double FISH）验证结果

图3A:实施例2构建的Donor质粒结构示意图

图3B：实施例2基因组编辑PCR验证结果

图3C：实施例2过表达RNA RT-qPCR验证结果。WT代表野生型，1-4代表各突变型。

具体实施方式

本发明的原位激活长非编码RNA基因的表达方法，主要通过同源重组技术，在受体的靶基因启动子之后，靶基因的基因序列之前，插入一个第二启动子及筛选标记基因，从而实现长非编码RNA基因的原位过表达。

本发明具体以长非编码RNA CCAT1-L为例，采用所述的表达方法，实现了CCAT1-L在结肠癌细胞中的原位过表达。

具体的，试验方法包括下列步骤：

1）构建TALEN质粒。

所述TALEN质粒所针对的靶位点位于待激活的长非编码RNA基因的启动子与其基因起始序列之间。

具体的，左右TALEN质粒识别序列分别为TCATCATTACCAGCTGCCGT和ACGCTCACGATTCACAGAAA。

2）设计并构建Donor质粒，所述Donor质粒的左右同源臂之间包括顺序串联的第二启

动子和筛选标记基因。

所述筛选标记基因可以为抗性基因和荧光蛋白标记基因。所述抗性基因如puromycin（嘌呤毒素）抗性基因或者blasticidin（杀稻瘟素）抗性基因等。所述荧光蛋白标记基因如EGFP、YFP荧光蛋白标记基因等。

如本发明一个实施例具体列举的，所述Donor质粒的左右同源臂之间包括顺序串联的CMV启动子、puromycin抗性基因和EGFP荧光蛋白标记基因。

进一步优选的，所述puromycin抗性基因和EGFP荧光蛋白标记基因之间还插入有T2A序列。

具体的，所述Donor质粒的序列如SEQ ID NO:29所示。

如本发明另一具体实施例列举的，所述Donor质粒的左右同源臂之间包括顺序串联的CMV启动子、puromycin抗性基因和EGFP荧光蛋白标记基因、BGH终止序列、SV40终止序列以及Ptight启动子。

更佳的，所述puromycin抗性基因和EGFP荧光蛋白标记基因之间还插入有T2A序列。

具体的，所述Donor质粒的序列如SEQ ID NO:30所示。

3）将步骤1）和2）构建的TALEN质粒和Donor质粒转入受体细胞，通过同源重组对受体细胞进行基因组改造，培养受体细胞，筛选获得阳性结果并验证。

具体的，实施例采用了结肠癌细胞作为受体细胞。

对于插入可诱导启动子的情况，进行过表达验证时，需要诱导表达。具体的，对于ptight启动子，可利用可诱导系统（Tet-On系统、Tet-Off系统）对靶基因进行表达调控。

本发明具体实施采用了qPCR、Northernblot验证了基因组的改造，采用RNA荧光原位杂交实验、以及RNA/DNA双荧光原位杂交实验验证了原位过表达。

采用上述方法获得阳性细胞，可用于原位过表达CCAT1-L，所述过表达的CCAT1-L能正确定位于细胞核上。从而可用于对CCAT1-L的功能研究。所述长非编码RNA基因的

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术，这些技术在现有文献中已有完善说明。

实施例1CCAT1过表达细胞系的获得和鉴定

1.实验材料

1）试剂

引物合成自上海博尚生物有限公司；EcoRⅠ和NotⅠ购自NEB公司；pLKO.1L来自addgene网站；TALEN组装试剂盒购自上海斯丹赛生物技术有限公司。

2）细胞株和载体

结肠癌细胞HCT116培养在加入了10%胎牛血清（Gbico），1‰双抗的DMEM培养基（Gibco）中贴壁培养。

2.实验方法

2.1TALEN质粒的构建

TALEN质粒的构建按照TALEN组装试剂盒（购自上海斯丹赛生物技术有限公司）说明书进行，左右TALEN质粒识别序列分别为TCATCATTACCAGCTGCCGT和ACGCTCACGATTCACAGAAA。所得TALEN质粒进行sanger测序验证。

2.2Donor质粒的构建

为实现靶基因的过表达，需在靶基因的5’端插入一个启动子（如CMV启动子、EF1alpha）；同时,在基因组中插入抗性基因（如puromycin（嘌呤毒素）抗性基因或者blasticidin（杀稻瘟素）抗性基因等）和荧光蛋白标记（如GFP）可以为后续的克隆筛选提供很大的帮助。

因此，将顺序串联CMV启动子和puromycin抗性基因和GFP的片段插入到靶基因的启动子后面，基因编码区前面。为了产生独立且具有功能的puromycin蛋白，可在puromycin和EGFP之间插入T2A序列，该序列在翻译后可以被细胞中的酶识别并切割。（示意图如图2A）。

使用以下引物1和引物2以及引物3和引物4从HCT116细胞基因组中分别进行PCR扩增Donor质粒的左右同源臂，然后在pCR II质粒（购自Invitrogen）使用Hind III和KpnI插入左同源臂，用Xho I和BamH I插入右同源臂。然后使用引物5和引物6从pTALETF_v2(NI)（购自上海斯丹赛生物技术有限公司）中扩增CMV promoter，用引物7和引物8从pLKO.1-TRC（购自Addgene）中扩增puro基因,用引物9和引物10从pTALETF_v2(NI)中扩增T2A-EGFP片段。上述扩增所用条件均为常规。将得到的片段进行overlapping后使用KpnI和BamH I插入到带有左右同源臂的pCR II质粒中，即获得所需Donor质粒。所得Donor质粒的序列如SEQ ID NO:29所示。

表1PCR引物

实验中扩增同源臂等各种片段使用PCR体系如下：

LongAmp(NEB)1μl；5×buffer4μl；Forward Primer1μl；Reverse Primer1μl；Template10ng；RNase-free water补至20μl

PCR程序如下：95℃，2min；95℃，15sec，55℃，30s，72℃，1min，30循环；72℃，3min。

实验中overlapping使用PCR体系如下：

LongAmp(NEB)1μl；5×buffer4μl；片段11μl；片段21μl；RNase-free water补至20μl。

PCR程序如下：95℃，2min；95℃，15sec，55℃，30s，72℃，2min，10循环；中止反应，然后向其中加入相应的引物后再进行20个循环的PCR。

其中引物5和引物6获得的CMV片段（片段A）与用引物7和引物8获得的puromycin（片段B）进行overlapping时加入引物5和引物8,可得到CMV和puromycin的融合片段（片段C）。片段C与用引物9和引物10扩增T2A-EGFP片段（片段D）进行overlapping的时候使用引物5和引物10。

2.3利用TALEN质粒和Donor质粒进行基因组改造

将得到的序列正确的左右TALEN质粒和Donor质粒按照1:1:4的比例混合入100ul核转试剂(Lonza）中，用混用质粒的核转试剂重悬二百万HCT116细胞，使用核转仪(Lonza）X-005程序进行核转。转染24h后加入1ug/ml puro抗生素进行克隆筛选。克隆筛选期间，每3-4天更换含抗生素培养基一次，直至培养皿中绝大多数细胞为GFP阳性细胞后进行单克隆挑选。

胰酶消化细胞，计数并按照1个/100ul培养基浓度重悬细胞，按照100ul每孔将细胞悬液分别加入到96孔板的不同孔中，正常培养1-2周，直至细胞增殖为单个可见克隆后消化并扩增细胞至6cm培养皿中

2.4基因组编辑的验证

利用基因组抽提试剂盒（购自天根生化科技有限公司）抽提单克隆细胞基因组。

以100ng基因组为模板，分别用引物11和引物12扩增野生型基因片段，用引物13和引物14扩增突变型基因片段。

因为引物11和引物12分别在TALEN识别位点的两侧，可以扩增出未经插入的野生型基因组片段，而引物13在基因组中，和引物14在Donor质粒上，只有Donor质粒整合到TALEN的识别和切割位点后，引物13和引物14才会扩增出产物，即突变型基因片段。当一个细胞中只能用引物11和引物12扩增出产物表示该细胞未经插入Donor质粒，只能用引物13和引物14扩增出产物表示该细胞的两个等位基因完全整合了Donor质粒。当使用两种引物都可以扩增出产物表示该细胞中只有一个等位基因整合了Donor质粒。为实现过表达lncRNA,只需单个等位基因整合Donor质粒即可，即获得两种引物都可以扩增出产物的阳性细胞。

阳性结果如图2B所示。其中，WT泳道对应野生型，1号与2号泳道对应突变型。

表2基因组编辑鉴定引物

2.5过表达RNA的验证

2.5.1qPCR验证

RNA抽提

将3.5cm培养皿贴壁生长的HCT116细胞用PBS洗两次后，加入1mLTRIzol试剂，反复吹打直至细胞全部裂解。之后加入0.2mL氯仿，离心后RNA处于上层水相，并将其转移到RNase-free的1.5mLEP管中，加入等体积的异丙醇混匀后离心，RNA将形成片状沉淀于管底。75%乙醇漂洗两次后，室温晾干，加入适量的RNase-free水溶解。

RT-qPCR验证

对于提取到的total RNA，首先用DNaseⅠ在37℃处理30min后，利用Takara反转试剂盒将其反转为cDNA。体系如下：

RNA1μg；5×buffer4μl；Oligo dT1μl；Random primer1μl；Enzyme1μl；RNase-free water补至20μl。37℃，15min；85℃，5sec。

取0.5μl作为每孔的模板，使用如下引物（表3）进行RT-qPCR检测。以β-actin为内参，标准差来源于三个重复实验的结果。

表3PCR引物

得到的阳性克隆中，相对于野生型HCT116而言，CCAT1-L具有20-40倍过表达效果，实验结果如图2C所示。

2.5.3Northernblot验证

2.5.3.1探针制备

以HCT116cDNA为模板，采用表4所示序列19和引物20扩增CCAT1-L的探针序列；以pEGFP-C1质粒（Clontech）为模板，使用表4所示序列21和引物22扩增GFP的探针序列。利用TA-克隆试剂盒（Invitrogen）将得到的片段分别正向插入到pCR-II质粒当中，获得pCR-II-CCAT1-L质粒和pCR-II-GFP质粒，分别作为制备CCAT1和GFP探针的模板。

表4扩增探针区域引物

然后，用M13引物从获得的含有探针序列的pCR-II载体上扩增探针模板，进行体外转录实验，分别获得地高辛（Dig）标记的识别与基因转录方向相同转录本的AS（antisense）RNA探针和识别与基因转录相反转录本的S（sense）RNA探针，转录体系如下：

Template1μg；10×Transcription Buffer2μl；0.1MDTT2μl；10×DigRNA labelingmix2μl；RiboGuard0.5μl；Enzyme2μl；RNase-free water补至20μl；37℃水浴3个小时，4M LiCl回收，分装后，-80℃冻存。

2.4.3.2Northernblot验证

制备浓度为1.5%的Agarose胶，10μg来源于HCT116和TALEN阳性细胞克隆的totalRNA用于Northernblot检测。120V电泳2个小时后，使用Bio-Rad转膜装置，20V恒压电转过夜，将RNA转移到尼龙膜上，随后，1800J紫外交联，68℃预杂交2个小时后，分别加入CCAT1和GFP探针杂交过夜。杂交结束后，分别在室温使用2×SSC+0.1%SDS条件洗涤两次，每次5min，在68℃使用0.2×SSC+0.1%SDS条件洗涤两次，每次30min后，使用blockingbuffer（封闭缓冲液）室温封闭30min，加入Anti-Digoxigenin,FabFragment室温孵育30min，随后用washingbuffer（洗涤缓冲液）洗两次，每次15min。最后与底物CDP-STAR孵育5min后，显影。结果如图2D所示，在获得的阳性克隆中，使用GFP探针可以检测到外源的GFP-CCAT1-L的融合转录本（图2D左），使用CCAT1-L探针可检测到除内源CCAT1-L外的GFP-CCAT1-L的融合转录本（图2D右），且分子量远远大于内源CCAT1-L。说明利用该系统成功实现了过表达长非编码RNA CCAT1-L。

2.5.4RNA荧光原位杂交实验（RNA FISH）验证

1）种植过表达CCAT1-L RNA的HCT116细胞于载玻片上，24小时后用1x PBS漂洗2-3次，然后用固定液(3.6%PFA+10%乙酸(in1x PBS))固定15分钟，1x PBS漂洗3次，每次5min；再用0.5%TritonX-100+2mM VRC处理，放冰上5分钟，1x PBS洗3次，每次5min；加75%乙醇，4℃过夜；

2）探针杂交分别加CCAT1-L探针和GFP探针到10ul杂交buffer中，100℃变性10分钟后放冰上大于2分钟；去除75%乙醇后用50%formamide+2XSSC室温处理细胞10分钟；加探针到细胞上，50℃杂交过夜；

3）抗体孵育用0.1X SSC+0.1%SDS+50%formamide漂洗两次，50℃避光处理20分钟；2XSSC+50%formamide洗两遍，室温避光处理20分钟；加入sheep anti-Dig抗体，100ul/well，室温孵育1h；2XSSC+8%formamide漂洗3次，加入donkey anti-sheep二抗，室温避光孵育1h；用2XSSC+8%formamide室温漂洗2次，每次10分钟（避光）；DAPI染色1分钟；2XSSC+8%formamide室温漂洗3次，每次10分钟（避光）；封片，荧光显微镜拍照或4度保存。

实验结果如图2E所示，使用CCAT1-L探针（上）和GFP探针（下）分别做RNA原位杂交实验时都能检测到过表达的CCAT1-L-GFP融合转录本定位在细胞核内，呈点状分布，类似于内源的CCAT1-L的定位（如图1A）。

2.5.5RNA/DNA双荧光原位杂交实验（RNA/DNA double FISH）验证

RNA荧光原位杂交步骤如前，在荧光显微镜下拍照。

RNA荧光原位杂交拍照后的样品取下，先用2X SSC+0.1%NP40+50%formamide漂洗两次(42℃)，然后用含有RNase A的2X SSC+50%formamide37℃处理60分钟。处理后的样品2XSSC+70%formamide80℃变性5分钟，用预冷的75%,95%,100%乙醇分别处理5分钟后加入CCAT1-L基因对应区域的DNA探针（Empire Genomics）。37℃探针孵育过夜。

用2XSSC+50%formamide37℃漂洗2次，每次10分钟（避光）；1XSSC室温漂洗1次，五分钟；4XSSC室温漂洗1次，五分钟；DAPI染色1分钟；4XSSC室温漂洗2次，每次五分钟；封片，荧光显微镜拍照或4度保存。

实验结果如图2F所示，RNA原位杂交结果显示过表达产生的CCAT1-L-GFP的融合RNA在细胞核中在细胞中呈一个点状（图2F左），DNA原位杂交实验显示CCAT1-L基因在细胞中有两个等位基因（图2F中），融合的CCAT1-L-GFP与其中一个CCAT1-L基因共定位，即过表达产生的CCAT1-L-GFP像内源CCAT1-L一样定位于其转录位点附近（如图1B）。

实施例2可诱导CCAT1-L过表达细胞系的获得和鉴定

1.实验材料

1）试剂

同实施例1。

2）细胞株和载体

同实施例1。

2.实验方法

2.1TALEN质粒的构建

CCAT1-L可诱导过表达细胞系的获得实验中使用实施例1中使用的TALEN质粒。

2.2Donor质粒的构建

为实现靶基因的可诱导过表达，需在靶基因的5’端插入一个可诱导的启动子（如ptight启动子），并利用可诱导系统（Tet-On系统、Tet-Off系统）对靶基因进行调控。

因此，在顺序串联CMV启动子和puromycin抗性基因和GFP的片段后同时插入BGH和SV40两种终止序列,以完全终止CMV启动子驱动的转录。然后在终止序列后插入Ptight启动子（示意图如图3A）。

为得到含有BGH和SV40的序列，使用引物31和引物32从pcDNA3.0(Invitrogen)上扩增BGH序列，使用引物33和引物34从pEGFP-C1(Clontech)上扩增SV40序列，将得到的BGH和SV40序列进行overlapping PCR后使用EcoR I和BamH I双酶切后连入pCR-II（Invitrogen）质粒中，得到pCR-II-BGH-SV40质粒。使用EcoR I和BamH I内切酶从pCR-II-BGH-SV40质粒，中切下BGH和SV40的融合片段，将片段插入到EcoR I和BamH I酶切的实例1的Donor质粒中，得到含有两个终止序列的Donor质粒（Donor2）。

使用引物23和引物24从HCT116细胞基因组中扩增右同源臂，片段在BamH I和XhoI双酶切后插入到BamH I和XhoI双酶切后去除原有右同源臂的Donor2质粒中，实现在Donor2质粒中引入Not I和EcoR V酶切位点。使用BamH I和Not I酶切得到的载体，插入Bgl II和Not I酶切后的Ptight启动子以获得目的Donor质粒3。获得Donor质粒的序列如SEQ IDNO:30所示。

表5PCR引物

2.3利用TALEN质粒和Donor质粒进行基因组改造和基因组编辑的验证

使用实施例1中同样的方法进行对HCT116细胞的基因组改造工作，获得单克隆，并使用同样的引物进行基因组编辑的验证。

使用引物25和引物26扩增插入型基因组片段，引物27和引物28扩增内源基因组片段。验证结果如图3B所示，因为引物27和引物28分别在TALEN识别位点的两侧，可以扩增出未经插入的野生型基因组片段，而引物25在基因组中，和引物26在Donor质粒上，只有Donor质粒整合到TALEN的识别和切割位点后，引物25和引物26才会扩增出产物，及突变型基因片段。当一个细胞中只能用引物27和引物28扩增出产物表示该细胞未经插入Donor质粒，只能用引物25和引物26扩增出产物表示该细胞的两个等位基因完全整合了Donor质粒。当使用两种引物都可以扩增出产物表示该细胞中只有一个等位基因整合了Donor质粒。为实现过表达lncRNA,只需单个等位基因整合Donor质粒即可，即获得实验两种引物都可以扩增出产物的细胞。

表6基因组编辑鉴定引物

2.5可诱导过表达RNA的验证

为实现CCAT1-L的可诱导表达，需要在获得的阳性克隆中转入编码rtTA蛋白的质粒。为获得该质粒使用引物35和引物36从pLVX-Tight-Puro(Clontech)上扩增rtTA编码区并使用Bgl II和EcoR I酶切后插入到Bgl II和EcoR I后的pcDNA3质粒中获得pcDNA3-rtTA质粒。

在获得的阳性克隆中转染入pcDNA3-rtTA质粒同时加入终浓度1μg/ml的doxycycline(强力霉素)处理细胞,处理细胞24h后收集细胞总RNA（如实例1）。使用实例1中相同的方式进行RT实验，然后使用实例1中相同的引物进行RT-qPCR验证。

结果如图3C所示，在未经过诱导的阳性克隆中CCAT1-L的表达量很低（标记为1,2,3,4），当使用强力霉素诱导基因表达后，CCAT1-L的表达量显著升高了（即对应的1+Dox,2+Dox,3+Dox,4+Dox）。即成功实现了CCAT1-L的可诱导CCAT1过表达。

表7rtTA构建引物