一种诱导辣椒疫霉菌产生毒性分泌蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种诱导辣椒疫霉菌产生毒性分泌蛋白的方法，将辣椒疫病病组织带回实验室，先用手术刀片刮掉病株茎基部表面，再用自来水冲洗干净，从病健交界处取0.5cm组织块置于V8培养基，25℃黑暗条件下培养3-4天，直到形成较大的菌落后，将菌碟转接到毒性蛋白液体诱导培养基中，振荡培养15-20天，用滤纸滤去菌丝体，滤液经8000rp，离心30min，上清液加入饱和硫酸铵，12000rpm离心30min，沉淀经透析处理，冻干后获得辣椒疫霉菌分泌的毒性蛋白，-70℃保存。上述方法可以诱导辣椒疫霉菌产生大量毒性分泌蛋白，填补了国内外辣椒疫霉菌致病机理研究中不能获得大量毒性分泌蛋白的空白，具有重大意义。

说明书

技术领域

    本发明涉及植物保护技术领域，具体地说是一种诱导辣椒疫霉菌产生毒性分泌蛋白的方法。

背景技术

辣椒疫病是一种世界范围内普遍发生的毁灭性真菌病害，其首先于1918年在美国新墨西哥州发现，引起辣椒疫病的辣椒疫霉菌Phytophthora capsici Leonian是Leon Leonian于1922年命名的，它属于植物病原卵菌。辣椒疫霉以卵孢子或厚垣孢子在土壤病残体中越冬，可以存活数月甚至更长时间，寄主范围广，主要侵染辣椒、番茄、茄子、黄瓜、南瓜等多种重要蔬菜作物。辣椒疫病露地和保护地均能发生，该病的流行致使辣椒损失严重，一般病株率为15–30％，严重时达80％以上。自1980年以来，辣椒疫病在我国蔬菜种植区域发病程度日趋加重，严重影响了蔬菜种植业的经济效益，给我国的蔬菜安全生产造成了巨大的经济损失。因此，辣椒疫霉菌受到各国植物病理学家和遗传学家的高度广泛关注。辣椒疫霉菌由于全基因测序已经完成，目前已成为分子生物学和遗传学的良好实验材料，疫霉菌-植物互作研究已成为卵菌病害研究的模式系统。

通过对疫霉菌分泌毒性相关蛋白的功能研究，可深入了解辣椒疫霉菌的致病机制、并以此为靶标寻找到辣椒中与该毒性蛋白相对应的抗性基因，上述研究为弄清植物与病原物之间的互作机制和抗病机制，预测病菌群体遗传变异、不同耕作条件下毒性蛋白变化、毒性蛋白诱导过敏反应的功能域和寄主相应抗病基因的抗性持久性提供基础。通过解析辣椒疫霉菌中编码的致病相关因子的分子机制，可以为寻找杀菌剂的新作用靶点，最终为有效控制疫病的爆发提出新的策略。但是目前的研究表明，诱导辣椒疫霉菌分泌产生大量毒性蛋白的方法缺失限制了我们对其致病机理的深入研究。

发明内容

为满足辣椒疫霉菌在固体培养条件下无法大量产生毒性分泌蛋白的实际情况，本发明提供一种能够诱导辣椒疫霉病菌产生毒性分泌蛋白的方法。

本发明的诱导辣椒疫霉菌产生毒性分泌蛋白的步骤如下：

⑴ 将辣椒疫病病株茎基部表面先用手术刀片刮掉病株茎基部表面，再用自来水冲洗干净，等自然风干后从病健交界处取0.4-0.6 cm组织块置于V8培养基，置于25℃黑暗条件下培养3-4天，再接种到V8培养基上，置于 28℃黑暗条件下培养3-4天，直到形成较大的菌落；

⑵ 形成较大的菌落后，将20块直径为5 mm菌碟转接到150 mL毒性蛋白液体诱导培养基中，于25℃，150 rpm振荡培养15-20天，毒性分泌蛋白液体诱导培养基主要成分：酵母提取物 0.4-0.8 g，KH₂PO₄ 0.5-0.7 g，MgSO₄.7H₂O 0.15-0.3 g，VB1 0.001-0.002 g，葡萄糖20-30 g，天冬酰胺 1g，β-谷甾醇 0.01-0.02 g, 定容到1000ml；

⑶ 用Whatman滤纸过滤，滤液经8000rpm离心30min，上清液加入100%饱和硫酸铵溶液至硫酸铵终浓度为33%，于12000 rpm离心30min，沉淀经透析带1KD处理，冻干后获得辣椒疫霉菌毒性分泌蛋白提取物，-70℃保存。

⑷ 将蛋白提取物用200μL去离子水溶解后，在成株期烟草叶片上进行接种实验，验证获得蛋白的特性。

所述的V8培养基为V8蔬菜汁150 mL，CaCO₃ 0.2 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL。

本发明解决了辣椒疫霉菌在固体培养条件下不产生大量毒性分泌蛋白的问题，通过对液体培养基配方调整，加入微量无机盐及氨基酸，从而诱导辣椒疫霉菌产生大量毒性分泌蛋白。通过对毒性蛋白的分离和提纯，可以深入研究辣椒疫霉菌与寄主之间在蛋白质水平上的相互作用，揭示两者在激发子信号识别和传导过程中的相关调控机理，对疫霉菌致病机理的研究具有重要意义。

具体实施方式

将分离的辣椒疫霉菌在V8固体培养基上培养，然后将菌碟转入毒性分泌蛋白液体诱导培养基中培养，最后分离和提纯辣椒疫霉菌毒性分泌蛋白，蛋白提取物在烟草叶片上接种，调查坏死斑。

实施例1:

将辣椒疫病病株茎基部表面先用手术刀片刮掉病株茎基部表面，再用自来水冲洗干净，等自然风干后从病健交界处取0. 5 cm组织块置于V8培养基，置于25℃黑暗条件下培养4天，15%(终浓度)固体V8培养基主要由以下几部分组成：V8蔬菜汁（购于金宝汤公司，美国）150 mL，CaCO₃ 0.2 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL；将分离获得的辣椒疫霉菌弱致病菌株FZ-1（自己分离）再接种到V8培养基上，置于 25℃黑暗条件下培养4天，直到形成较大的菌落；将20块直径为5 mm菌碟转接到150 mL毒性蛋白液体诱导培养基中，于25℃，150 rpm振荡培养18天，毒性分泌蛋白液体诱导培养基主要成分：酵母提取物 0.6 g，KH₂PO₄ 0.6 g，MgSO4.7H₂O 0.25 g，VB1 0.001 g，葡萄糖25 g，天冬酰胺 1g，?-谷甾醇 0.01 g, 定容到1000ml；用Whatman滤纸过滤，滤液经8000rpm离心30min，上清液加入100%饱和硫酸铵溶液（硫酸铵终浓度为33%），于12000 rpm离心30min，沉淀经透析带1KD处理，冻干后获得辣椒疫霉菌毒性分泌蛋白提取物，-70℃保存。

实施例2:

    将辣椒疫病病株茎基部表面先用手术刀片刮掉病株茎基部表面，再用自来水冲洗干净，等自然风干后从病健交界处取0. 5 cm组织块置于V8培养基，置于25℃黑暗条件下培养3天，将分离获得的辣椒疫霉菌强致病菌株ND-2，XM-3接种到15%固体V8培养基（V8蔬菜汁150 mL，CaCO₃ 0.2 g，琼脂20 g和蒸馏水1000 mL）上，置于 25℃黑暗条件下培养3天，直到形成较大的菌落；将20块直径为5 mm菌碟转接到150 mL毒性蛋白液体诱导培养基中，于25℃，150 rpm振荡培养20天，毒性分泌蛋白液体诱导培养基主要成分：酵母提取物 0.8 g，KH₂PO₄ 0.7 g，MgSO4.7H₂O0.3 g，VB10.002 g，葡萄糖30 g，天冬酰胺 1g，?-谷甾醇0.02 g, 定容到1000ml；用Whatman滤纸过滤，滤液经8000rpm离心30min，上清液加入100%饱和硫酸铵溶液（硫酸铵终浓度为33%），于12000 rpm离心30min，沉淀经透析带1KD处理，冻干后获得辣椒疫霉菌毒性分泌蛋白提取物，-70℃保存。

将上述实施例1和2所提纯并保存的毒性分泌蛋白接种到本氏烟草叶片上，接种3天后调查坏死斑大小，结果表明坏死斑由内至外，依次形成灰白斑、水渍圈和褐斑圈的感病症状，而且菌株致病性越强，诱导蛋白致病性也越强。坏死斑大小见下表:

上述结果表明，通过本方法诱导不同致病性的辣椒疫霉菌产生的毒性分泌蛋白，对本氏烟草有致病作用，这对辣椒疫霉菌毒性分泌蛋白与寄主互作研究具有重要推动作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。