野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法

摘要

本发明涉及一种野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，该方法是将复水后的野生齿肋赤藓整株浸泡在改良的农杆菌浸染液中，再经过甘露醇水洗涤及无菌水冲洗后，用无菌滤纸将植株体表面水分吸干；将转化后的外植体栽植于沙土中进行培养；培养的外植体在不同时间段进行组织化学染色及实时RT-PCR分析，GUS基因在齿肋赤藓植物体中有一定表达。本发明所述方法可以从野生齿肋赤藓外植体在1-15天内快速获得大批量的转基因植株，能够进行快速外源基因表达分析，同时为齿肋赤藓作为极具潜力的耐干旱机制研究提供研究方法依据。本发明所述方法简单、快速、积极有效，获得的转基因植株表达效果好。

说明书

技术领域

本发明涉及一种野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

苔藓植物具有其他普通陆生植物无法比拟的植株体耐干特性。近年来，其耐干机制以及复水时强大的细胞保护和修复机制已成为抗逆分子生物学研究的热点。齿肋赤藓广泛分布于新疆古尔班通古特沙漠中，能适应沙漠中水分迅速变化，是沙漠生物结皮中的优势种。齿肋赤藓在极端干燥状态下，呈休眠状态，似一层灰黑色的“壳”覆盖在沙漠表面，一旦遇到降水，可在30s内迅速“复原”呈现鲜活的绿色，并能够执行光合作用。齿肋赤藓具有强大的细胞保护及细胞修复机制，是不可多得的开展耐干机制研究的实验材料。

转基因技术是研究植物基因功能和规律非常有效的方法，特别是农杆菌浸染法在植物转化中被认为是最有效的转基因方法之一。外源基因导入植物细胞体内的表达方式主要分为稳定表达和瞬时表达两种形式，其中，瞬时表达引入细胞的外源DNA与宿主的染色体DNA不发生整合，但这些DNA一般能随载体进入细胞后12小时内可以表达，并能够稳定持续一定时间段。植物瞬时表达实验方法简单快速，表达量高且较为经济等优点，在基因功能分析和重组蛋白等方面有广泛的应用。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，该方法是将复水后的野生齿肋赤藓整株浸泡在改良的农杆菌浸染液中，再经过甘露醇水洗涤及无菌水冲洗后，用无菌滤纸将植株体表面水分吸干；将转化后的外植体栽植于沙土中进行培养；培养的外植体在不同时间段进行组织染色及实时RT-PCR分析，GUS基因在齿肋赤藓植物体中有一定表达。本发明所述方法可以从野生齿肋赤藓外植体在1-15天内快速获得大批量的转基因植株，能够进行快速外源基因表达分析，同时为齿肋赤藓作为极具潜力的耐干旱机制研究提供研究方法依据。本发明所述方法简单、快速、积极有效，获得的转基因植株表达效果好。

本发明所述的一种野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，其特征在于按下列步骤进行：

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌至OD值为0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2 MS+0-200μM AS+1-7%蔗糖+0.02% Tween20，pH=5.6调整菌液浓度至0.2-1.0；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

本发明所述的一种野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，该方法中所述的农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105是中国科学院新疆理化技术研究所的肖向文老师与2012年5月赠送，是一种实验室常用的农杆菌菌株。

本发明所述的一种野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，该方法采用LB培养基培养农杆菌，至菌液的OD值达到0.6；将所得到的菌液稀释50倍，再将新鲜的LB菌液摇菌至OD值为0.6，3000rpm离心收集菌体5min，在摇菌过程中的温度保持在28℃，二活后，菌液OD值达到0.6即达到实验需求的浓度；然后收集的菌体，用1/2 MS+0-200μM AS+1-7%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.2-1.0。在各种溶液浓度变化过程中，取一个变量，并且维持其他因素的最佳值保持不变，例如：当取AS浓度分别为0，5，75，100，125，150，200时，保持蔗糖浓度为3%，菌液OD值至0.8；当蔗糖浓度取1%，2%，3%，5%，7%时，保持AS浓度为100，菌液OD值至0.8；当调整菌液OD值至0.2，0.4，0.6，0.8，1.0时，保持AS浓度为100，蔗糖浓度为3%。

将得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，让菌液适应性的菌液环境，所得菌液用于侵染；将野生材料齿肋赤藓的植物苗浸泡在LB培养基培养农杆菌中进行处理，在处理植株苗过程中，需要将植株整株沉于溶液中，以便提高瞬时转化效率；所得的处理苗在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗，再将得到的转化苗用甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分；所述甘露醇的浓度为120 mM；本方法利用高渗液的甘露醇对植物进行洗涤，能够利用高渗压加快外源DNA随载体进入细胞的速度和效率；将得到的转化后的外植体栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d后，将一部分材料进行进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，实时RT-PCR分析GUS基因表达量测定，最终绘出柱状图；所得到染色的野生植物齿肋赤藓植株体，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色后，进行拍照。

本发明所述的野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，该方法的流程为：农杆菌的培养——瞬时转化——组织染色——脱色——定性和定量分析转化效率；

实验原理：β-D-葡糖醛酸酶(GUS基因编码)是从大肠杆菌K-12菌株分离出的一种酸性水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解；其中组织化学法是催化的底物是X-gluc，产物为蓝色化合物，该方法可观察到外源基因在特定器官，组织，甚至单个细胞内的表达情况。

本发明所述的野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，该方法中将得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d。其中，7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色。

本发明的本发明所述的一种野生极端耐干旱植物齿肋赤藓外源基因瞬时转化方法，该方法适用于各种转基因植物的快速瞬时转化。对于植物瞬时表达实验方法具有简单快速，表达量高且较为经济等优点。用该方法所得到的瞬时转化植株体可以满足植株在基因功能分析和重组蛋白等方面的应用。为进一步研究野生极端耐干旱植物齿肋赤藓的分子机制奠定了良好的基础。

附图说明

图1为本发明染色图，其中a为相同菌液浓度、不同浸染时间野生材料齿肋赤藓的染色效果；b为相同浸染时间、不同菌液浓度野生材料齿肋赤藓的染色效果；

图2为本发明染色对比图，其中a为未导入外源GUS基因的野生材料齿肋赤藓，即对照组CK，b为导入外源GUS基因的野生材料齿肋赤藓图；c为浸染10min， 转化苗在土壤中栽培一天，AS浓度为100，蔗糖浓度为3%，菌液浓度OD值分别为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0；d为浸染30min，转化苗在土壤中栽培一天，AS浓度为100，蔗糖浓度为3%，菌液浓度OD值分别为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0；e为转化苗在土壤中栽培三天，AS浓度为100，菌液浓度OD值为0.8，蔗糖浓度分别为1%，2%，3%，5%，7%；f为转化苗在土壤中栽培三天， 蔗糖浓度为3%，菌液浓度OD值为0.8， AS浓度为分别为0,50,75,100,125,150,200；

图3为本发明半定量RT-PCR检测导入外源GUS基因在野生材料齿肋赤藓中的表达量图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明：本实施例在本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明所保护的范围不限于下述实施例。

本实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；

本实验中，显微镜型号为：舜宇OD500C；农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105是中国科学院新疆理化技术研究所的肖向文老师与2012年5月赠送，是一种实验室常用的农杆菌菌株；

实施例1

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+0μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.8；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d，其中7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例2

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+50μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.2；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d，其中7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例3

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+75μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.6；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为110 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d，其中7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例4

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+100μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.8；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d，其中7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例5

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+125μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至1.0；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d，其中7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例6

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+150μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.8；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d，其中7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例7

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+200μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.4；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d，其中7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例8

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+100μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.2；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d；

7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例9

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+100μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.4；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d；

7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例10

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+100μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至0.6；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d；

7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。

实施例11

农杆菌培养：

a、采用液体LB培养基培养农杆菌：将农杆菌加入到液体LB培养基中至菌液OD值达到0.6 ；

b、将步骤a中所得到的菌液再用液体LB培养基稀释50倍，再将稀释后的菌液摇菌OD值至0.6，温度保持在28℃，3000rpm离心收集菌体5min；

c、将步骤b中收集的菌体，用1/2MS+100μM AS+3%蔗糖+0.02%Tween20，pH=5.6调整菌液OD值至1.0；

d、将步骤c得到的菌液，用温度24℃，转速为120 rpm的摇床摇菌2 h后，所得菌液用于侵染；

瞬时转化：

e、将野生材料齿肋赤藓植物苗浸泡在步骤d得到菌液中，在温度24℃，转速为100-120 rpm的摇床上分别培养1，2，4，6 h，得到转化苗；

f、将步骤e得到的转化苗，用120 mM的甘露醇水洗涤2-3次，用无菌水冲洗后，再用无菌滤纸将苗吸干水分，然后栽种到土壤中，培养1d，2d，3d，4d，5d，7d，15d；

7d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第7天时，取样，进行组织染色；15d的栽培时间是指转化苗在土壤中生长到第15天时，取样，进行组织染色；

组织染色：

g、将步骤f栽培后的转化苗一部分材料进行组织染色，检测其基因的表达；另一部分留作分子材料，RT-PCR分析GUS基因表达量，最终绘出柱状图；

脱色：

h、将步骤g得到的染色的转化苗，用浓度为95%的无水乙醇进行脱色即可。