一种拜城油鸡腿肌中高肌内脂肪含量的遗传标记的制备方法及应用

摘要

本发明公开了一种拜城油鸡腿肌中高肌内脂肪含量的遗传标记的制备方法及应用，本发明选取120日龄拜城油鸡白羽60只，公母各半，检测H-FABP第二外显子多态性和腿肌中肌内脂肪IMF的含量，并分析两者之间的关系。本发明经过实验可知，本发明所述方法制备的遗传标记选择腿肌中IMF含量高的拜城油鸡。

说明书

技术领域

本发明属于禽类遗传标记技术领域，涉及一种拜城油鸡腿肌中高肌内脂肪含量的遗传标记的制备方法及应用，具体地说，涉及一种拜城油鸡(白羽)腿肌中高肌内脂肪含量的遗传标记的制备方法及应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对肉品质量和口味也有更严格的要求，鸡肉作为餐桌上的主要肉类，鸡肉的品质越来越成为人们关注的焦点。对于鸡肉肉质好坏的衡量标准大多源自于人们的口感，目前还没有一种统一的标准。经过分析，鸡肉中的高肌内脂肪IMF被认为是一种影响鸡肉肉质性状和改善肉的鲜嫩度方面的主要指标，当高肌内脂肪含量达到3.5％以上，就能获得良好的肉质风味。

随着分子生物的发展，人们尝试通过遗传标记能够在高肌内脂肪含量选择中得到应用，遗传标记Genetic Marker指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。

目前需要一种准确、可靠地遗传标记用于拜城油鸡腿肌中高肌内脂肪含量选择中。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种拜城油鸡腿肌中高肌内脂肪含量的遗传标记的制备方法及应用。其具体技术方案为：

一种拜城油鸡腿肌中高肌内脂肪含量的遗传标记制备方法，包括以下步骤：

I.聚丙烯酰胺凝胶的制备

用12％的聚丙烯酰胺凝胶分离待测片段。根据玻璃板规格的不同，分别配制7ml、10ml的胶，配方为：

II.样品的制备

1、设计引物，样品片段长度一般因在150-300bp之间；

2、PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶检测；

3、样品稀释：根据琼脂糖凝胶检测结果，如果PCR产物很浓，则将PCR产物稀释3倍；若PCR产物浓度较弱，则不稀释；

4、取1μl稀释好的PCR产物，加入9ul变性缓冲液中，混匀；

5、变性缓冲液：溴酚蓝5mg，0.5M EDTA.Na2 pH8.0 400μl，甲酰胺9.6ml，混匀；

III.变性

1、开启PCR仪，将程序设置为98℃11min；

2、将混有甲酰胺的样品放入PCR仪中，开始变性；

3、准备冰盒；

4、当变性10min时，打开PCR仪，迅速将样品插入冰中，保持10min；

IV.上样电泳

1、电泳前，所用的胶，电泳缓冲液都要先预冷；

2、取样品3μl，依次点到事先制好并且制冷的聚丙烯酰胺凝胶中；点样时注意标准品不要点到胶的最边上两个孔，以免由于制胶不均匀或其他原因造成的标准品分型不好，起不到指示作用；

3、将电泳槽放到4℃冰箱中，连上电泳仪，250V跑10min，50V 16h；

4、电泳条件因待分离片段的不同而不同，因此若以上条件不能够将不同的基因型分开，则尝试其他的条件；

V.染色

1)固定：把胶卸下，做好起始记号，放入80ml固定液中在摇床上固定10min；

2)染色：60ml染色液+60μl甲醛，染色6min，蒸馏水洗涤一次；

3)显色：60ml显色液+120μl甲醛，放到摇床上显色至条带清晰。倒掉显色液，加蒸馏停止显色。

本发明所述遗传标记在拜城油鸡腿肌中高肌内脂肪含量选择中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明经过实验可知，本发明所述方法制备的遗传标记选择腿肌中IMF含量高的拜城油鸡(白羽)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

本发明选取120日龄拜城油鸡(白羽)60只，公母各半，检测H-FABP第二外显子多态性和腿肌中肌内脂肪(IMF)的含量，并分析两者之间的关系。

PCR引物

5′-CGACAAGGCGACGGTGAA-3′(forward)

5′-TGGGGCAGGAAGGAGTTT-3′(reverse)

1)PCR反应体系：

2)PCR反应程序：

SSCP实验步骤

I.聚丙烯酰胺凝胶的制备

一般情况下，用12％的聚丙烯酰胺凝胶分离待测片段。根据玻璃板规格的不同(1.0、1.5两种)，分别配制7ml、10ml的胶，配方如表1：

表1

II.样品的制备

1、设计引物，样品片段长度一般因在150-300bp之间。

2、PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶检测。

3、样品稀释。根据琼脂糖凝胶检测结果，如果PCR产物很浓(与marker一样亮)，则将PCR产物稀释3倍；若PCR产物浓度较弱，则可以不稀释。

4、取1μl稀释好的PCR产物，加入9ul变性缓冲液中，混匀。

5、变性缓冲液：溴酚蓝5mg，0.5M EDTA.Na2(pH8.0)400μl，甲酰胺9.6ml，混匀。

III.变性

1、开启PCR仪，将程序设置为98℃11min

2、将混有甲酰胺的样品放入PCR仪中，开始变性

3、准备冰盒

4、当变性10min时，打开PCR仪，迅速将样品插入冰中，保持10min

IV.上样电泳

1、电泳前，所用的胶，电泳缓冲液(1×TBE)都要先预冷。

2、取样品3μl，依次点到事先制好并且制冷的聚丙烯酰胺凝胶中。点样时注意标准品不要点到胶的最边上两个孔，以免由于制胶不均匀或其他原因造成的标准品分型不好，起不到指示作用。

3、将电泳槽放到4℃冰箱中，连上电泳仪，250V跑10min，50V 16h

4、注：电泳条件因待分离片段的不同而不同，因此若以上条件不能够将不同的基因型分开，则可以尝试其他的条件。

V.染色

1)固定。把胶卸下，做好起始记号，放入约80ml固定液(50ml无水乙醇，2.5ml冰乙酸，定容到500ml，冷藏)中在摇床上固定10min。

2)染色。60ml染色液(0.75gAgNO3，溶入500ml水中，避光保存)+60μl甲醛，染色6min。蒸馏水洗涤一次。

3)显色。60ml显色液(7.5g NaOH，溶于500ml水)+120μl甲醛，放到摇床上显色至条带清晰。倒掉显色液，加蒸馏停止显色。

一.T载体克隆测序

1.PCR扩增

1)PCR反应体系：

2)PCR反应程序：

3)1％agrose gel电泳，确定有特异扩增后，再扩增2个50μl体系的PCR，进行PCR产物回收。

2.PCR产物回收

1)加入4倍体积的BufferCP到1.5ml离心管；

2)剧烈震荡，短暂离心；

3)把吸附柱放在收集管里；

4)把步骤3的混合物转入吸附柱(每次750μl，一次转不完，等离心后，倒掉废液，再把剩余混合物转入吸附柱离心)；

5)13000g离心1min，弃滤液；

6)加入700μl洗脱液，13000g离心1min，弃滤液；

7)加入500μl洗脱液，13000g离心1min，弃滤液；

8)13000g离心2min，甩吸附柱上的乙醇；

9)把吸附柱转到一个新的1.5ml离心管，在吸附柱中心加入30μl ddH₂O，室温放置1min；13000g离心2min，滤液即是回收的DNA；

10)PCR产物连接T载体。

3.PCR产物连接和转化

1)按如下配制连接体系：

2)轻轻摇匀，短暂离心。

3)室温放置5min。

4)连接产物直接转化。

5)取出化学感受态细胞DH5α放于冰水混合物中解冻。

6)加入连接产物，冰上放置30min。

7)将管放于42℃水浴恰好90s，不可摇动。

8)快速将管移到冰浴上2min，室温放置5min。

9)每管加800μl没有抗生素的LB液体培养基，37℃振荡45min复苏。

10)8000rpm离心1min，将上清液去掉800μl，重悬后均匀涂布到Amp抗性平板上。

11)平板放置于室温吹干，倒置于37℃培养箱，培养12-16h长出菌落。

12)进行PCR菌落鉴定和测序。

三IMF含量测定

1.样品冻干：取适量样品，剪掉脂肪组织，置小铝盒中于冻干机中，冻大概3天。

2.操作步骤：称取冻干样0.2-0.3g左右，准确至0.0002g。用滤纸包好，并用铅笔注明编号，称重。将滤纸包放入抽提管中，在抽提管中加入无水乙醚60-100mL，60-75℃水浴加热，使乙醚回流，控制回流速度为每小时约10次，直至抽提管流出的乙醚挥发后不留下油迹为抽提终点，约需要8h左右。抽提完毕后取出滤纸包，105℃烘箱中烘干1h，干燥器中冷却30min，称重，再烘干30min，同样冷却称重，两次质量之差小于0.001g为恒重。

3.结果计算：粗脂肪(％)＝(W1-W2)÷W0×100

4.式中：W1-105℃烘干抽提前脂肪包重，g；

5.W2-105℃烘干抽提后脂肪包重，g；

6.W0-试样重，g；

结果如表2所示：

表2基因型和基因型频率

G939A突变位点产生AA型，G956A突变位点产生BB型

AA型IMF含量高于AB型，显著高于BB型，因此G939A可以作为遗传标记选择腿肌中IMF含量高的拜城油鸡(白羽)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。