写入式二维微流控液滴阵列化装置、用途及其使用方法

摘要

本发明涉及微量液体操控领域，特别涉及写入式二维微流控液滴阵列化装置、用途及其使用方法。该装置包括液滴输出装置、液滴附着装置。利用液滴输出装置输出油相间隔的水相液滴或水相间隔的油相液滴，流向液滴写入头，通过液滴写入头在液滴附着装置上的移动，利用液滴输出的固有时间间隔，按照移动的轨迹，形成液滴之间存在空间间隔的液滴阵列。液滴的阵列排布由液滴输出的频率以及运动的速度和轨迹直接决定。本发明可以作为液滴微流控的高密度阵列化存储系统，液滴传感器阵列和微光学透镜器件阵列，也可应用于需要对大量液滴进行动态监测的反应条件筛选，结晶生长条件筛选，数字PCR定量分析，菌种分离、细胞培养等应用。

说明书

技术领域

本发明涉及微流控芯片分析领域，特别涉及写入式二维微流控液滴阵列化装置、用途及其使用方法。

背景技术

微流控芯片分析以分析化学和分析生物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，把试样的采集、预处理、分离、反应、检测等部分集成在几平方厘米的面积内，从而快速、高效地实现试样的分离、分析及检测。自九十年代初提出微全分析系统以来，微流控芯片分析(Microfluidic Analysis)一直处于最活跃的发展前沿，代表着二十一世纪分析仪器微型化、集成化的发展方向。

液滴生成是微流控中一种非常重要的技术，广泛应用于生物界和材料界，通过两相液流之间通过一定角度互相挤压，使其中一相连续液流断裂形成液滴。使液滴的制备主要有2种方式：正交结构(T-junction)、流式聚焦(Flow-focusing)。T正交(T-junction)液滴生成依靠分散相(通常为水相)垂直地引入到不相溶的连续相(通常为油或气体)中，在两相的界面处分散相被连续相“切割”生成液滴。Thorsen等(T.Thorsen,R.W.Roberts,F.H.Arnold,Phys Rev Lett,2001,86:4163)首次使用正交结构芯片并以水为分散相、油为连续相制备液滴。不同于“T”型芯片的正交构型，流动聚焦是把3条流路聚焦于一个孔道中外围流路中注入连续相，而分散相从两条连续相中央的孔道引入外围两连续相流路，通过施加压力和黏滞力把中间的分散相切分为液滴。Anna等(S.L.Anna,N.Bontoux,H.A.Stone,Appl Phys Lett,2003,82:364)使用流式聚焦芯片首次对液-液体系液滴的生成进行了研究，并使用该构型的芯片制备了单分散和多分散的液滴乳液。

液滴阵列是液滴按一定规则排布在固定位置的一种形式，具有非常重要的研究意义和实际应用价值：(1)动态连续监测的需要，如晶体生长，细胞生长，组织发育。(2)大批量筛选和条件优化的需要，通过调节液滴组成和比例， 以及引入大批量试剂进行基于液滴的筛选，对于这些筛选反应的条件跟踪，需要一个空间定位的阵列化存储系统。(3)选择性提取的需要，对于大规模液滴筛选和反应优化实验，往往要求能够对优选条件进行提取分析，阵列化的液滴相对于无序存储的液滴有利于实现定位提取。(4)大批量检测的需要，在将液滴筛选分析与质谱，色谱，电泳等仪器联用的过程中，阵列化的液滴有利于实现自动化的大批量液滴检测分析。

将液滴做成阵列的形式，可以方便的对液滴进行无干扰的检测和定位。在阵列化的液滴序列中，液滴按阵列排列，可以很方便的定位某一个具体的液滴并对其做出检测与分析。

目前微流控生成液滴阵列的方法大致有如下几种。Ismagilov课题组报道了利用T型装置形成大批量液滴直接储存在芯片或管道中，进行阵列反应的监测(D.N.Adamson,D.Mustati,J.X.J.Zhang,B.Zheng,R.F.Ismagilov,Lab Chip 2006,6:1178)。该装置结合T型装置形成液滴可在芯片通道中存储几十至几百个液滴，用于蛋白结晶条件筛选等应用。David A.Weitz课题组在芯片内设计微坑阵列使液滴排布在微坑中形成阵列，液滴直接储存在芯片中做生物实验在线观察(C.H.J.Schmitz,A.C.Rowat,S.Koster,D.A.Weitz,Lab Chip 2009,9:44.)。该装置应用于分离和培养细胞。Hidenori Nagai课题组基于液滴分配技术，利用光刻和刻蚀方法制作了一个微坑亲水表面疏水的阵列，直接用微坑将液体隔离形成一个独立的反应单元(H.Nagai,Y.Murakami,Y.Mortita,K.Yokoyama,E.Tamiya,Anal.Chem.2001,73:1043)。(可用于快速形成均一的单液滴。Petra S.Dittrich课题组利用平移台针尖点液滴的方式，在定制的金属点阵MALDI质谱基板上逐一定位和点样，形成液滴阵列(S.K.Kuster,S.R.Fagerer,P.E.Verboket,K.Eyer,K.Jefimovs,R.Zenoboi,P.S.Dittrich,Anal.Chem.2013,85:1285)。该装置可应用于实现液滴微流控系统和MALDI-TOF质谱的联用，但是该系统为了实现一一对应的液滴点样，依赖复杂的三维平台和光学检测反馈系统，在毛细管口需要进行液滴流动的监测，在定位过程中需要反复启动和停止液流，避免点样过程中发生多个液滴交叉污染，点样的通量在几秒钟一个液滴。这与液滴连续生成的特点不匹配，通量大大低于现有液滴生成系统几百至几千个液滴每秒的速率。而且，这种方法可操控的液滴的体积较大，对更小体积(pL级)的液滴的操控，存在液流 控制和检测定位的困难。

目前，液滴阵列的各种生成技术，还没有一种简单快速、可直接定位、在线提取观测分析的通用装置和方法。大部分微液滴阵列都储存在芯片中，不可提取。毛细管点样法虽然可在线提取，但每个液滴都需要单独吸取转移操作，实际操作时间长，不够简单方便，通量不高。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种写入式二维微流控液滴阵列化装置、用途及其使用方法。该装置可以简单快速、成分可变可控可调可定位的在线提取观测分析，集合液滴快速形成、液滴成分可变、液滴在线定位提取，提高液滴阵列在阵列传感器、阵列微光学器件、生化、分析、检验检疫等应用领域中的实用性和可操作性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种写入式二维微流控液滴阵列化装置，包括液滴输出装置1、液滴附着装置2。

在本发明的一些具体实施方案中，微流控芯片生成流动的液滴序列；液滴序列流动进入液滴输出装置上加工或耦合的液滴写入头中；液滴写入头在液滴附着装置表面运动，流动的序列液滴按照液滴写入头的运动轨迹，在液滴附着装置上形成二维液滴阵列。生成的液滴阵列可以进行后续的液滴阵列反应、检测和提取分析等，在化学反应、检验检疫、生化分析、数字PCR扩增等方面具有广泛应用前景。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴输出装置包括至少一个液滴写入头3。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置还包括所述液滴写入头的移动控制装置4。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置还包括所述液滴附着装置的移动控制装置5。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴写入头，由所述液滴输出装置直接切割液滴输出出口制得，或在所述液滴输出装置的液滴输出通道耦合毛细管制得。

液滴写入头按照类型可以分为芯片通道直接加工和在芯片通道出口耦合毛细管两种。芯片通道直接加工的写入头的加工步骤如图2所示，微流控液滴芯片可以为T型通道或十字通道芯片。图2A所示，以十字通道构型的液滴生成芯片基础，我们首先垂直于液滴输出通道切割，得到通道出口在切面中间的开口；再平行于通道平面方向，将通道上层切薄，使液滴写入头运动时，在芯片一侧的液滴阵列不受影响；再通过屏幕在开口的右侧，靠近通道出口用切割刀再次以30°夹角切割，即得到液滴写入头。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴写入头3由所述液滴输出装置1沿其出口与所述液滴附着装置2的接触面成夹角切割制得。

按照这一芯片直接切割得到写入头的模式，我们可以将各种液滴生成芯片加工为带有液滴写入头的液滴输出装置。图2B所示，为十字通道夹流液滴生成芯片改造为液滴输出装置；图2C为基于十字通道的液滴的重新注入芯片改造为液滴输出装置；图2D为带有三个水相通道的T型通道微流控芯片改造为液滴输出装置，这一芯片可以实现三种溶液混合液滴的生成，进而可以对后续生成的二维液滴阵列中每个液滴的组分进行实时调控，实现高通量筛选。图2A-D中，芯片的切割斜口在芯片的左侧，芯片向液滴附着装置写入液滴时，芯片从左往右相对于液滴附着装置移动，流出的液滴在芯片的左侧的液滴附着装置2表面形成阵列。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置中所述液滴写入头3由所述液滴输出装置1沿其出口与所述液滴附着装置2的接触面成30°夹角切割制得。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置中所述液滴写入头3由所述液滴输出装置1沿其出口与所述液滴附着装置2的接触面成30°夹角切割两个端部制得。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴写入头3由所述液滴输出装置1耦合毛细管制得，所述毛细管的出口沿其与所述液滴附着装置2的接触面成30°夹角切割制得。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴写入头3由所述液滴输出装置1耦合毛细管制得，所述毛细管的出口 沿其与所述液滴附着装置2的接触面成30°夹角切割制得，切口的方向与所述液滴写入头的液滴生成方向相反。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴写入头3由所述液滴输出装置1连接毛细管制得，所述液滴写入头3设置有支架，所述支架的与液滴写入头并排沿于移动轨迹设置，设置顺序与移动轨迹方向相同。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴写入头3由所述液滴输出装置1连接毛细管制得，所述毛细管嵌套于圆形支管内，所述圆形支管与所述液滴附着装置2的接触面成夹角，所述圆形支管的倾斜方向与所述液滴写入头3的液滴生成方向相同。

在本发明的一些实施例中，圆形支管与表面保持75°的向右倾斜的夹角，接触液滴附着装置表面，毛细管伸出支管并接触液滴附着装置，其开口向左侧开放，利用倾斜角保证液滴的输出，使用时，控制支管从左往右运动。

具体的，液滴写入头3在液滴附着装置2上写入液滴时，较为简单的控制方法写入头与液滴附着装置2接触。当采用液滴输出装置1与液滴附着装置2接触的方式进行写入操作时，为了避免已经写入的液滴在液滴输出装置1移动时被液滴输出装置1本身所擦除，需要对液滴写入头3出口的输出口进行设计。本实施例提出但不仅限于以下四种设计。

图3A所示，在液滴写入头3的通道出口(通道尺寸为200μm×200μm)，我们在切割芯片斜口时，从开口的右侧壁与切面的交点处开始，往左以30°夹角切割。切割后的芯片，通道的右侧壁在写入头与表面接触时，距离表面的距离约为115μm。当进行液滴写入时，写入的液滴从斜口处脱离通道，同时由于斜口以右为开放空间，液滴不会被通道右侧擦除和打乱。

图3B所示，在液滴生成芯片的出口(通道尺寸为200μm×200μm)，耦合内径200μm，外径250μm的Teflon毛细管，长度为1cm，保证芯片与毛细管的接口处没有泄漏。液滴从芯片流入毛细管，在毛细管的出口处流出。对毛细管的出口采用30°左上方倾斜切割，斜口朝向左边。毛细管写入头使用时，从左往右运动，在毛细管的左侧液滴附着装置上形成液滴阵列。

图3C所示，在液滴生成芯片的出口处(通道尺寸为200μm×200μm)，接一内径200μm，外径250μm，长度为10cm的Teflon毛细管，保证芯片与 毛细管的接口处没有泄漏。液滴从芯片流入毛细管，在毛细管的出口处流出。在毛细管的左侧固定一个支架作为支撑，使立柱与液滴附着装置接触时，毛细管与液滴附着装置保持微小距离，液滴从毛细管出口流出，毛细管从右往左运动时，液滴阵列在毛细管的右侧形成，液滴不会被毛细管擦除。

图3D所示，在液滴生成芯片的出口处(通道尺寸为200μm×200μm)，接一内径200μm，外径250μm，长度为10cm的平口Teflon毛细管，毛细管穿过外径为2mm，内径为300μm的圆形塑料支架，使用时，圆形支管与表面保持75°的向右倾斜的夹角，接触液滴附着装置表面，毛细管伸出支管并接触液滴附着装置，其开口向左侧开放，利用倾斜角保证液滴的输出，使用时，控制支管从左往右运动。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴附着装置2的表面经表面处理后装载矿物油。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴附着装置2的表面经硅烷化处理(硅烷化试剂为氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane))后装载矿物油。

在本发明的一些具体实施方案中，矿物油为低黏度饱和的环烷烃与链烷烃混合物。硅烷化后，在所述液滴附着装置2中装载矿物油，纯水液滴在所述液滴附着装置2表面矿物油相保护下，其接触角为82°，液滴在表面能够稳定附着。而未硅烷化的所述液滴附着装置2，纯水液滴的接触角为160°，液滴在表面不能稳定附着，在所述液滴附着装置2倾斜时，会发生滚动，无法形成稳定分布的液滴阵列。

本发明提出的液滴阵列化方法，为了实现稳定的液滴阵列定位，需要对液滴附着装置2的表面进行处理。如图4所示，液滴附着装置2首先经过清洗晾干，去除表面杂物。然后通过氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)进行硅烷化处理，使液滴附着装置2表面修饰带有氨基的硅烷单分子自组装层。硅烷化后，在液滴附着装置2中装载矿物油，纯水液滴在液滴附着装置2表面矿物油相保护下，其接触角<90°。而未硅烷化的液滴附着装置2，纯水液滴的接触角为160°，液滴在表面不能稳定附着，在液滴附着装置2倾斜时，会发生滚动，无法形成稳定分布的液滴阵列。

除了本实例中提出的氨基硅烷化方法，我们还可以采用其他硅烷化试剂和修饰方法处理表面，得到适度的亲水表面，用于实现稳定的液滴阵列化。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴输出装置1的移动控制装置4的运行轨迹为螺旋形或连续或非连续的曲线，直线及其组合。

本发明提出的液滴阵列化方法，为了实现高密度的有序液滴阵列，避免交叉污染和液滴的序列的混乱，可采取优选液滴阵列化路径设计为螺旋形液滴阵列和Z形矩阵液滴阵列。

对于螺旋形液滴阵列路径，液滴的排布轨迹我们借鉴了光驱的数据存储模式，由内到外呈螺旋状排列液滴形成阵列。如图5a所示，我们通过程序设计和平台搭建可以实现在液滴写入液滴附着装置时保持固定的螺旋间距和液滴间距。实际移动轨迹上液滴写入头按匀速行进。实际效果如图5b，采用了自动控制移动的转盘和平移台实现，液滴体积为7nL，液滴数量约为3600个，液滴呈螺旋状在小区域内大面积排布，分布均一。同等规模的液滴阵列，若使用常见的内径为200μm的Teflon毛细管储存，所需长度约为3.5m，耗材量巨大。此时毛细管内压降约为477kPa，实际实验中很难完成。

Z形矩阵液滴阵列采用分段式来回运行直线运动的方式实现。如图5c所示，液滴间距由写入头与液滴附着装置的相对速度决定，阵列间距由运行路线决定。在写入头与液滴附着装置保持匀速行进时，液滴间距均一。我们采用自动或手动控制液滴写入头来运行轨迹实现大规模的矩阵化液滴阵列。如图5d所示是采用手动实现的矩阵化液滴阵列应用实例。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置所述液滴附着装置2的移动控制装置5包括平移台和转动台。

根据本发明提出了的螺旋液滴阵列化路径设计，我们搭建了可自动写入等间距液滴的自动化控制平台系统。图6是螺旋化液滴阵列自动生成平台的示意图。该装置由平移台和转动台组成。转动台由细分步进电机驱动，将电脉冲信号转变为角位移。平移台则是通过螺杆等将步进电机的转动转化为平动，驱动芯片在液滴附着装置上运动。使用时，液滴写入头固定于滑台导轨，滑台导轨固定在平移台上，来实现实时水平调节，保证液滴写入头与平台接触。采用计算机程序控制平移台和转动台运行，产生螺旋的液滴阵列。

自动化螺旋液滴阵列写入控制系统在液滴阵列的排布上，为了实现空间的有效利用和高密度液滴存储，我们采取了光驱数据存储的恒定线速度CLV(Constant Linear Velocity)模式。这一模式可以保证在液滴写入频率保持恒定时，写入的液滴在液滴附着装置上间距相等，排列的螺线之间的线间距相等。这种排列方式最大限度的利用了液滴附着装置上的空间，同时方便后续开发基于光驱检测方法的液滴检测和定位提取装置。

本发明还提供了上述写入式二维微流控液滴阵列化装置用于单细胞培养、菌种分离、数字PCR定量分析、作为液滴微流控的阵列化存储系统或作为液滴微流控的阵列化筛选系统的用途。

本发明还提供了上述写入式二维微流控液滴阵列化装置的使用方法，所述液滴写入头3在所述液滴附着装置2表面运动，液滴按照所述液滴写入头3的运动轨迹，在所述液滴附着装置2表面形成二维液滴阵列。

在本发明的一些具体实施方案中，写入式二维微流控液滴阵列化装置的使用方法，所述液滴写入头3的移动控制装置4控制所述液滴输出装置1在所述液滴附着装置2表面运动，所述液滴附着装置2的移动控制装置5控制所述液滴附着装置2的运动。

在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴写入头3的移动控制装置4的运行轨迹为螺旋形或Z形。

在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴附着装置2的移动控制装置5通过角位移和平面移动控制所述液滴附着装置2的运动。

在本发明的一些具体实施方案中，所述液滴附着装置2的表面经硅烷化处理后装载矿物油，纯水液滴在液滴附着装置2表面矿物油相保护下，其接触角<90°，液滴在表面能够稳定附着。而未硅烷化的液滴附着装置2，纯水液滴的接触角为160°，液滴在表面不能稳定附着，在液滴附着装置2倾斜时，会发生滚动，无法形成稳定分布的液滴阵列。

本发明提供了一种写入式二维微流控液滴阵列化装置，包括液滴输出装置1、液滴附着装置2。该写入式二维微流控液滴阵列化装置是一种以两相间隔的液滴序列在芯片上输出时，存在特定的输出频率为基础，使芯片的输出口对准液滴阵列液滴附着装置，沿着一定的轨迹运动，并按照输出的频率和轨迹线速度，自动形成二维液滴阵列。获得的大批量液滴阵列可以进行平面 扫描检测，也可以方便的对液滴进行提取和加样操作。本方法液滴生成简单快速，阵列平台可直接定位，液滴成分比例可控可调，是一种非常具有可操作性和实用性的简单快速阵列生成方法。该技术已被用于生物学细胞培养、药物筛选等研究，大大提高了工作效率和实验精度。

本发明是以液滴生成液滴为基础的液滴生成平台，利用两种不同流态间的挤压快速连续生成液滴，液滴流出导出通道后转入定位平台，液滴按一定方式停留在平台的固定位置，获得可在线提取和在线观测分析的大批量液滴阵列。液滴生成结构为T型和十字交叉型结构。

根据本发明，液滴间距和液滴体积大小可通过调节两相流速和通道内径来实现。而生成液滴的数量和密度可以通过设定螺旋阵列化控制系统的参数进行调节。通道内径在5微米-0.5毫米范围内。单液滴体积在1pL-500nL范围内。

根据本发明，液滴生成芯片出口与液滴写入平台(如培养基表面7)直接接触或悬浮于写入平台之上，即可实现液滴转入平台。无需实时控制芯片与平台间距，从而避免了因平台空间移动增加的写入时间，使写入过程更加高效、稳定。

根据本发明，为实现液滴组分变化和梯度变化，电脑操控进样液滴以不同种类和不同比例改变液滴内成分。

根据本发明，为实现液滴阵列化，用平移台控制液滴写入头水平移动，转动器控制写入平台圆周转动，形成螺旋状液滴等间距密集排列的阵列排布。

根据本发明的使用方法，写入平台可以利用表面改性调节表面接触角，有利于液滴的附着。接触角越小越容易附着，接触角变大可实现高密度液滴分布。

根据本发明的使用方法，通过控制培养皿的温度、湿度等参数，写入的液滴可以稳定保存7天以上。

本发明的主要优点在于：通过阵列化系统参数设定可以得到高密度阵列，利于观察分析。此外，还有无失真和扭曲的细菌成像、长时间活细胞培养(3天以上)及避免表面活性剂对细菌生长的影响等优点。

本发明的另一个优点是该装置的液滴写入平台(培养皿表面)液滴保存时间长，可以作为液滴高密度阵列化存储系统，可直接作为细胞分离、培养、 筛选等操作的场所。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示微流控多相间隔液滴的写入式二维阵列化装置及其使用方法流程；

图2示液滴写入头加工和构型设计示意图；

图3示液滴写入头写液滴时与液滴附着装置表面的间距控制示意图；

图4示本发明中液滴液滴附着装置表面处理方法的步骤示意图；

图5示液滴螺旋阵列化的等间距液滴阵列的实现和实验结果；

图6示液滴螺旋阵列化实现装置的基本构成示意图，其中1为液滴生成和写入芯片(即液滴输出装置)，2为液滴附着装置，3为液滴写入头的放大图，4为液滴写入头的平移控制装置，5为液滴附着装置的转动控制步进电机(即转动控制装置)，6为液滴输出装置的固定滑台导轨，7为螺旋轨迹排列的液滴，8为液滴输出装置的液滴相入导管，9为与液滴相不互溶的载液相输入导管；

图7示混合菌液进行单细胞分离培养的实例；

图8示对液滴阵列中指定液滴的定位和提取以进行后续操作；其中A图为毛细管提取的示意图；B图为毛细管提取时附着液滴依靠毛细作用力被毛细管吸入的动态显微照片。

具体实施方式

本发明公开了一种写入式二维微流控液滴阵列化装置、用途及其使用方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种微流控一维液滴从通道输出至二维平面阵列的装置, 包括：

a)微流控液滴输出装置1；

b)液滴附着装置2。

作为优选，该系统装置微流控液滴输出装置含有一个或一个以上的液滴写入头3，该液滴写入头以一定的频率连续流出不互溶相间隔的液滴序列，输出的液滴能够按其输出先后顺序，在液滴阵列附着装置上形成阵列。

作为优选，还包括液滴写入头的移动控制装置4。

作为优选，还包括液滴附着装置运动控制装置5。

作为优选，芯片所生成的液滴相和液滴间隔相为任何两种互不相溶的流体。

作为优选，液滴附着装置2采用与液滴不互溶的载液相覆盖装置表面，使液滴之间分隔，并防止液滴阵列的蒸发。

作为优选，从微流控芯片写入头3输出的液滴能够与液滴附着装置2快速接触并在液滴附着装置2上附着。

作为优选，微流控液滴输出装置1在输出液滴时，在液滴附着装置2的表面按照设定的轨迹连续运动，使输出的液滴能够在液滴附着装置2表面形成阵列。液滴生成通道出口与平台表面直接接触或相距低于液滴直径的高度。

作为优选，液滴附着装置2可以通过表面改性的方法以及添加合适的表面活性剂的办法，使阵列化的液滴在液滴附着装置2表面上保持一定的接触角并能够形成阵列。

作为优选，液滴附着装置2按一定速度转动，液滴写入头3在液滴附着装置2上逐渐向远离转动中心或接近转动中心的方向运动，使液滴形成有序的螺旋阵列。

作为优选，液滴阵列轨迹，包括但是不限于一种Z形液滴阵列，其特点液滴写入头在静止的液滴附着装置上按往复的Z形直线运动，得到有序的Z形液滴阵列。

作为优选，液滴二维阵列的轨迹由芯片在液滴附着装置2表面的运动轨迹决定。

作为优选，液滴在轨迹上的间距由芯片液滴输出的频率和芯片在轨迹上的运动速度决定。

作为优选，为了保证液滴阵列的有序性，液滴平面阵列化所沿的运动轨迹为不存在交叉的曲线或直线组成，以保证新写入的液滴在形成阵列时，不会对之前写入的液滴产生干扰。

本发明还提供了上述装置的使用方法，其使用步骤包括：

c)使流动的液滴序列通过在液滴附着装置2上按轨迹移动的微流控液滴写入头；

d)液滴写入头3输出的液滴在液滴附着装置2上附着，按照移动轨迹形成二维液滴阵列；

e)对阵列化的液滴进行后续操作，如孵育、反应、检测和提取分析。

本发明突破现有液滴阵列的不足，提供了一种集合液滴快速形成、液滴成分可变、液滴在线定位提取的方法，将提高微流控液滴阵列在生物、化学、临床诊断、检验检疫等领域中的实用性和可操作性。此外，利用生成的大规模液滴阵列，我们还可以应用于制备液滴传感器阵列，以及通过附着液滴或液滴固化以后，制备微透镜阵列。

本发明实现一种简单快速、成分可变可控可调可定位的在线提取观测分析的螺旋形高密度阵列化的接触式写入液滴的系统装置，是一种非常具有可操作性和实用性的简单快速阵列生成方法。

本发明是以微流控生成液滴为基础的液滴生成平台，利用两种不互溶流体相的微通道汇流快速连续生成液滴，液滴生成结构为T型和十字交叉型结构。液滴流出输出通道后转入液滴写入头，并在移动控制装置的控制下，液滴按一定方式写入与液滴写入头接触的液滴附着装置，获得可在线提取和在线观测分析的大批量液滴阵列。

根据本发明，液滴间距和液滴体积大小可通过调节两相流速和通道内径来实现。而生成液滴的数量和密度可以通过设定螺旋阵列化控制系统的参数进行调节。通道内径在5微米-0.5毫米范围内。单液滴体积在1pL-500nL范围内。

根据本发明，液滴生成芯片出口与液滴写入平台(如培养基表面7)直接接触或悬浮于液滴附着装置表面之上，即可实现液滴转入平台。无需实时调节液滴写入头与液滴附着装置表面的间隙，从而避免了因平台空间移动增加的写入时间，使写入过程更加高效、稳定。

根据本发明，为实现液滴组分变化和梯度变化，通过多组分汇流形成液滴，并通过程序操控各组分的流速动态变化，以不同组分种类和不同组分比例改变液滴内成分。

根据本发明，为实现液滴阵列化，用平移台控制微通道芯片水平移动，转动器控制写入平台圆周转动，形成螺旋状液滴等间距密集排列的阵列排布。

根据本发明的使用方法，写入平台可以利用表面改性调节表面接触角，有利于液滴的附着。接触角越小越容易附着，接触角变大可实现高密度液滴分布。

根据本发明的使用方法，通过控制培养皿的温度、湿度等参数，写入的液滴可以稳定保存7～10天以上。

本发明的主要优点在于：通过阵列化系统参数设定可以得到高密度阵列，利于观察分析。此外，还有无失真和扭曲的细菌成像、长时间活细胞培养(3天以上)及避免表面活性剂对细菌生长的影响等突出优点。

本发明的另一个优点是该装置的液滴写入平台(培养皿表面)液滴保存时间长，可以作为液滴高密度阵列化存储系统，可直接作为细胞分离、培养、筛选等操作的场所。

本发明提供的写入式二维微流控液滴阵列化装置、用途及其使用方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明，如无特殊说明，所采用的液滴输出芯片均为聚二甲氧基硅烷通过软光刻方法制备的微流控芯片，所采用的液滴附着装置均为90mm透明聚苯乙烯培养皿。

实施例1

本发明的具体操作流程如图1所示。首先微流控芯片生成流动的液滴序列；液滴序列流动进入芯片上加工或耦合的写入头中；写入头在液滴附着装置表面运动，流动的序列液滴按照写入头的运动轨迹，在液滴附着装置上形成二维液滴阵列。生成的液滴阵列可以进行后续的液滴阵列反应、检测和提取分析等，在化学反应、检验检疫、生化分析、数字PCR扩增等方面具有广泛应用前景。

为了实现本发明所述的简捷快速的液滴写入，首先我们提出了液滴写入 头设计和加工方法。液滴写入头按照类型可以分为芯片通道直接加工和在芯片通道出口耦合毛细管两种。芯片通道直接加工的写入头的加工步骤如图2所示，微流控液滴芯片可以为T型通道或十字通道芯片。图2A所示，以十字通道构型的液滴生成芯片基础，液滴输出通道的内径为200μm×200μm，我们首先在距离十字通道交叉口5mm处垂直于液滴输出通道切割，得到输出通道出口在切面中间的开口；再平行于通道平面方向，将微通道平面上层切薄，仅剩余200微米左右的PDMS膜，使液滴写入头运动时，在芯片一侧的液滴阵列不受影响；再通过屏幕在开口的右侧，靠近通道出口用切割刀再次以30度夹角切割通道左侧PDMS，即得到液滴写入头。

按照这一芯片直接切割得到写入头的模式，我们可以将各种液滴生成和输出芯片加工为液滴写入头。图2B所示，为十字通道夹流液滴生成芯片改造为液滴写入头；图2C为基于十字通道的液滴的重新注入芯片改造为液滴写入头；图2D为带有三个水相通道的T型通道微流控芯片改造为液滴写入头，这一芯片可以实现三种溶液混合液滴的生成，进而可以对后续生成的二维液滴阵列中每个液滴的组分进行实时调控，实现高通量筛选。图2A-D中，芯片的切割斜口在芯片的左侧，芯片向液滴附着装置写入液滴时，芯片从左往右相对于液滴附着装置移动，流出的液滴在芯片的左侧的液滴附着装置表面形成阵列。

实施例2

液滴写入头在液滴附着装置上写入液滴时，较为简单的控制方法写入头与液滴附着装置接触。当采用芯片与液滴附着装置接触的方式进行写入操作时，为了避免已经写入的液滴在芯片移动时被芯片本身所擦除，需要对写入头液滴出口的微结构进行设计。本实施例提出但不仅限于以下四种设计。

图3A所示，在液滴写入头的通道出口(通道尺寸为200μm×200μm)，我们在切割芯片斜口时，从开口的右侧壁与切面的交点处开始，往左以30度夹角切割。切割后的芯片，通道的右侧壁在写入头与表面接触时，距离表面的距离约为115μm。当进行液滴写入时，写入的液滴从斜口处脱离通道，同时由于斜口以右为开放空间，液滴不会被通道右侧擦除和打乱。

图3B所示，在液滴生成芯片的出口(通道尺寸为200μm×200μm)，耦 合内径200μm，外径250μm的Teflon毛细管，长度为1cm，保证芯片与毛细管的接口处没有泄漏。液滴从芯片流入毛细管，在毛细管的出口处流出。对毛细管的出口采用30度左上方倾斜切割，斜口朝向左边。毛细管写入头使用时，从左往右运动，在毛细管的左侧液滴附着装置上形成液滴阵列。

图3C所示，在液滴生成芯片的出口处(通道尺寸为200μm×200μm)，接一内径200μm，外径250μm，长度为10cm的Teflon毛细管，保证芯片与毛细管的接口处没有泄漏。液滴从芯片流入毛细管，在毛细管的出口处流出。在毛细管的左侧固定一个支架作为支撑，使立柱与液滴附着装置接触时，毛细管与液滴附着装置保持微小距离，液滴从毛细管出口流出，毛细管从右往左运动时，液滴阵列在毛细管的左侧形成，液滴不会被毛细管擦除。

图3D所示，在液滴生成芯片的出口处(通道尺寸为200μm×200μm)，接一内径200μm，外径250μm，长度为10cm的平口Teflon毛细管，毛细管穿过外径为2mm，内径为300μm的圆形塑料支管，使用时，圆形支管与表面保持75度的向右倾斜的夹角，接触液滴附着装置表面，毛细管伸出支管并接触液滴附着装置，其开口向左侧开放，利用倾斜角保证液滴的输出，使用时，控制支管从左往右运动。

实施例3

本发明提出的液滴阵列化方法，为了实现稳定的液滴阵列定位，需要对液滴附着装置的表面进行处理，本实施例以常见的90mm聚苯乙烯培养皿作为液滴附着装置为例，举例介绍表面处理的过程和必要性。如图4所示，90mm聚苯乙烯培养皿首先经过乙醇清洗晾干，去除表面杂物。然后通过氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)进行硅烷化处理，使培养皿内表面修饰带有氨基的硅烷单分子自组装层。硅烷化后，在培养皿中装载矿物油，培养皿即可用于液滴写入。

我们在此培养皿中用10微升移液器滴加2微升的液滴，纯水液滴在液滴附着装置表面矿物油相保护下，其接触角为82度，其照片如图4B所示。图5B显示在写入螺旋液滴阵列时液滴的阵列化效果，这一表面接触角的培养皿可实现写入液滴的即时固定化，液滴在表面牢固附着，不容易发生漂移。

在对照试验一中，我们直接在未经过硅烷化处理的培养皿中装载矿物油， 2微升纯水液滴的接触角为160度，其照片如图4D所示，液滴在表面不能稳定附着，在液滴附着装置倾斜时，会发生滚动，无法用于形成稳定分布的液滴阵列。图5e为在未经处理的培养皿表面写入螺旋液滴阵列后，倾斜培养皿，液滴在培养皿表面滚动而产生混乱的照片。

在另一对照试验中，我们直接在经过等离子体清洗，但是未经过硅烷化处理的培养皿中装载矿物油，用移液器滴加2微升纯水液滴，测试接触角为20度，其照片如图4C所示，液滴在表面铺展，形状不规则，容易与邻近液滴发生融合，无法用于形成稳定液滴阵列。

除了本实例中提出的氨基硅烷化方法，我们还可以采用其他硅烷化试剂和修饰方法处理表面，得到适度的亲水表面，用于实现稳定的液滴阵列化。

实施例4

本发明提出的液滴阵列化方法，为了实现高密度的有序液滴阵列，避免交叉污染和液滴的序列的混乱，可采取优选液滴阵列化路径设计为螺旋形液滴阵列，Z形矩阵液滴阵列等轨迹构型。

对于螺旋形液滴阵列路径，液滴的排布轨迹我们借鉴了光驱的数据存储模式，由内到外呈螺旋状排列液滴形成阵列。如图5a所示，我们通过程序设计和平台搭建可以实现在液滴写入液滴附着装置时保持固定的螺旋间距和液滴间距。实际移动轨迹上液滴写入头按匀速行进。实际效果如图5b，采用了自动控制移动的转盘和平移台实现，液滴体积为7nL，液滴数量约为3600个，液滴呈螺旋状在小区域内大面积排布，分布均一。同等规模的液滴阵列，若使用常见的内径为200μm的Teflon毛细管储存，所需长度约为3.5m，耗材量巨大。此时毛细管内计算压降可达到>400kPa，实际实验中液滴流动的阻力巨大，液滴提取不方便，且相邻液滴间极易发生融合和交叉污染。

Z形矩阵液滴阵列采用Z型来回运动的方式实现。如图5c所示，液滴间距由写入头与液滴附着装置的相对速度决定，阵列间距由运行路线决定。在写入头与液滴附着装置保持匀速行进时，液滴间距均一。我们采用自动或手动控制液滴写入头来运行轨迹实现大规模的矩阵化液滴阵列。如图5d所示是采用手动实现的矩阵化液滴阵列应用实例。

实施例5

根据本发明提出了的螺旋液滴阵列化路径设计，我们搭建了可自动写入等间距液滴的自动化控制平台系统。图6是螺旋化液滴阵列自动生成平台的示意图。该装置由平移台和转动台组成。转动台由细分步进电机驱动，将电脉冲信号转变为角位移。平移台则是通过螺杆等将步进电机的转动转化为平动，驱动芯片在液滴附着装置上运动。使用时，液滴写入头固定于滑台导轨，滑台导轨固定在平移台上，来实现实时水平调节，保证液滴写入头与平台接触。采用计算机程序控制平移台和转动台运行，产生螺旋的液滴阵列。

自动化螺旋液滴阵列写入控制系统在液滴阵列的排布上，为了实现空间的有效利用和高密度液滴存储，我们采取了光驱数据存储的恒定线速度CLV(Constant Linear Velocity)模式。这一模式可以保证在液滴写入频率保持恒定时，写入的液滴在液滴附着装置上间距相等，排列的螺线之间的线间距相等。这种排列方式最大限度的利用了液滴附着装置上的空间，同时方便后续开发基于光驱读写模式的液滴检测和定位提取装置。

实施例6

应用螺旋化液滴阵列的一个实施例，用于实现混合菌群的分离和大规模单细胞纯化培养。所采用的样品为两种荧光标记的大肠杆菌的混合样品，实验结果如图7所示。在本实施例中，选取表达红色荧光蛋白的大肠杆菌RP437和绿色荧光蛋白的大肠杆菌RP1616的混合液作为分离样品。将两种大肠杆菌在适宜条件(LB培养基、37度、200rpm)下培养至OD 600等于1.0，取出后等比例混合，然后用LB培养基稀释10000倍，作为液滴生成中的水相。同时，选择液体石蜡作为液滴生成中的油相。水相和油相分别置于注射器中，用Teflon连接管(300微米内径，600微米外径)与芯片进样口相连。注射器使用微量注射泵驱动，油相与水相以一定流速比进样，在芯片内形成油相包裹的含有单个细胞的液滴。在本实施例中，通道高度为200μm，出口处通道为200μm宽，十字通道夹流区通道为90μm宽。水相流速3μL/min，油相流速10μL/min。使用液滴自动化螺旋阵列生成平台把生成的液滴序列写入到覆盖有液体石蜡的硅烷化处理的聚苯乙烯表面皿上。完成螺旋阵列化液滴后，把表面皿置于37度培养24h。培养过程中使用荧光倒置显微镜，分别在明场、 红色荧光和绿色荧光观测条件下对液滴内细菌生长情况进行观测，从而获取单细胞在液滴内的生长曲线。培养结束后使用荧光倒置显微镜进行多通道扫描拍照，获取整个液滴阵列中细菌的生长情况信息。

在第20小时，培养皿表面的单细胞液滴大部分已经生长，液滴阵列绿色荧光和红色荧光叠加后的整体荧光显微合成照片如图7A所示，局部荧光液滴放大图如图7B所示。在这一液滴阵列中，每个液滴的微生物生长状况可以进行实时观察和记录。图7C为单个液滴培养时，单个绿色荧光标记大肠杆菌RP1616在显微镜明场(BF)和绿色荧光(GFP)两个光路下，0-12小时动态成像的照片，部分图为液滴的局部放大图。图7D为混合样品写入后，得到的单个红色荧光标记大肠杆菌在内的液滴，在红色荧光通道0-12小时动态细菌生长荧光成像的照片，部分图为液滴的局部放大图。

图7E为单个绿色荧光蛋白标记大肠杆菌在7纳升液滴内20小时内的生长情况在荧光通道的细胞荧光信号随时间变化的曲线。以上结果表明，采用本发明提出的液滴阵列化技术，可实现大面积高通量的液滴阵列制备。制备的液滴可实现单细胞的生长，生长状况良好，与常规溶液培养的趋势吻合。

实施例7

本发明提出的液滴阵列化技术，可以得到开放式可提取液滴阵列。液滴表面被油相覆盖，使我们既能保证液滴长期稳定不蒸发，又能够对液滴进行快速的定位检测和提取。图8为采用中空毛细管实现液滴提取的应用实例。被提取液滴直径约300μm,体积为7nL。采用的毛细管长5cm,内径75μm，外径150μm，毛细管内壁亲水。使用时，将毛细管定位到液滴上方，并逐渐靠近液滴，与液滴接触，液滴内的溶液由于毛细作用，被吸入毛细管。约3s，即可实现整个液滴的吸取。吸取液滴以后的毛细管可以进行后续的放大培养和测试。

实施例8

应用大规模液滴阵列的又一实施例，用于实现数字PCR核酸体外扩增绝对定量分析。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外DNA扩增技术，自发明以来已被广泛应用在生物及医疗领域。数字PCR(digital  PCR，dPCR)原理是将样品分隔至成千上万个微液滴中，每一个微液滴中只包含一个或没有模板核酸分子，然后同时进行PCR循环扩增。扩增结束以后，直接统计阳性液滴和阴性液滴的数量，根据泊松分布统计原理(Poisson statistics)计算原始样品中的核酸分子拷贝数。

在本实施例中，选择大肠杆菌8739作为待测菌株，其LacZ作为目标基因。本实施例中采用的芯片构型为十字通道构型，如图2A和图6所示。通道高度为100μm，各进样通道和出口通道宽度为100μm。水相进样口两个交汇于一处。油相进样口一个，位于水相交汇口之后，用于分割水相生成液滴。水相总流速3μL/min，油相流速10μL/min。PCR混合试剂：2倍PCR Master Mix和0.5μM PCR引物。

选择培养后的大肠杆菌8739菌液，离心并用pH为7的磷酸盐缓冲液重悬后，将OD 600调节至1.0，再稀释100倍，作为水相一；取PCR Master Mix 25μL、10mg/mL的BSA溶液5μL、纯水15μL和0.5μM的引物溶液2.5μL，混合后作为水相二；选择液体石蜡作为油相。水相一、二和油相分别置于注射器中，通过Teflon连接管(300微米内径，600微米外径)与芯片进样口相连，并使用微量注射泵驱动。液滴生成平台把生成的液滴写入覆盖有油层的培养皿里。阵列生成结束后，取出阵列液滴板，置于PCR仪中。程序设置为95度DNA变性15秒，65度引物退火及DNA延伸50秒，进行30个循环后，DNA总延伸步骤在72度下进行5分钟。PCR结束后置于4度保存。使用荧光显微镜对整个阵列进行多通道扫描，获得每个液滴的位置信息和荧光强度，通过设定绿色荧光阈值，对扩增阳性和扩增阴性的液滴分别计数，再根据阳性液滴的个数，和所有液滴的总体积，利用泊松分布原理推算出样品中的细菌个数。

实施例9

应用大规模液滴阵列的又一实施例，用于实现微生物-抗生素浓度响应曲线的获取，以及微生物最小抑菌浓度的测定。在本实施例中，采用的芯片构型为三水相汇流T型交叉液滴生成构型，构型如图2D所示。通道高度为100μm，各进样通道和出口通道宽度为100μm。水相进样口三个交汇于一处。油相进样口一个，位于水相交汇口之后用于分割水相生成液滴。三水相汇流后 的总流速3μL/min，油相流速10μL/min。

选取表达红色荧光蛋白的大肠杆菌RP437作为待测菌株，噻孢霉素作为待测抗生素。刮取平板上的RP437菌落到LB培养基中，并稀释至OD 600＝0.15，作为水相一。选择LB培养基作为水相二，0.3μg/mL噻孢霉素的LB培养基溶液作为水相三，液体石蜡作为油相。三种水相和一种油相分别置于注射器中，并通过Teflon连接管(300微米内径，600微米外径)与芯片对应的进样口相连。注射器由微量注射泵驱动，通过更改微量注射泵的设置可以使其流速线性变化。实验过程中水相一的流速保持1μL/min不变，从而保证每个液滴菌量一致；水相二的流速从2μL/min到0线型减少，而水相三的流速从0到2μL/min线型增加，这样在保证水相总流速固定不变，即液滴尺寸不变的条件下，液滴内抗生素含量由0至0.2μg/mL线型增加。液滴生成平台把生成的液滴写入覆盖有油层的培养皿里。完成螺旋阵列化液滴后，把培养皿置于37度培养24h，取出后使用荧光倒置显微镜对整个阵列进行多通道扫描，获得每个液滴的位置信息及其荧光强度。将每个液滴的荧光强度按照其抗生素浓度进行公式拟合计算。可以获得RP437对噻孢霉素的最小抑菌浓度为0.081μg/mL。同时，使用传统的梯度稀释法进行相同测试，需重复进行15次溶液配制，最终获得该抑菌浓度为0.0625μg/mL至0.125μg/mL。与传统方法相比，本实施例的操作更为简便，在一次实验中，即测试了数千个不同的浓度条件，所获得的大批量数据能够精确拟合出抑菌曲线，同时避免了细菌个体差异对实验结果的干扰。

实施例10

应用大规模液滴阵列的又一实例，实施药物协同作用对细菌抑制能力实验。在本实施例中，采用的芯片构型为三水相汇流T型交叉液滴生成构型，构型如图2D所示。通道高度为100μm，各进样通道和出口通道宽度为100μm。水相进样口三个交汇于一处。油相进样口一个，位于水相交汇口之后用于分割水相生成液滴。水相流速3μL/min，油相流速10μL/min。

选取表达红色荧光蛋白的大肠杆菌RP437作为待测菌株，多粘菌素E和利福平作为待测抗生素。刮取平板上的RP437菌落到LB培养基中，并稀释至OD 600＝0.15，作为水相一。选择LB培养基作为水相二，抗生素的LB培 养基溶液(其中利福平浓度为12μg/mL，多粘菌素E的浓度为90μg/mL)作为水相三，液体石蜡作为油相。三种水相和一种油相分别置于注射器中，并通过Teflon连接管(300微米内径，600微米外径)与芯片对应的进样口相连。注射器由微量注射泵驱动，通过更改微量注射泵的设置可以使其流速线性变化。实验过程中水相一的流速保持1μL/min不变，从而保证每个液滴菌量一致；水相二的流速从2μL/min到0线型减少，而水相三的流速从0到2μL/min线型增加，这样在保证水相总流速固定不变，即液滴尺寸不变的条件下，液滴内利福平和多粘菌素E的含量分别由0至8μg/mL和0至60μg/mL线型增加。液滴生成平台把生成的液滴写入覆盖有油层的培养皿里。完成螺旋阵列化液滴后，把培养皿置于37度培养24h，取出后使用荧光倒置显微镜对整个阵列进行多通道扫描，获得每个液滴的位置信息及其荧光强度。将每个液滴的荧光强度按照其抗生素浓度进行公式拟合计算。可以发现在两种抗生素共同作用是，利福平浓度为5.25μg/mL，同时多粘菌素E浓度为35μg/mL，即可对RP437有最好的抑制效果。而这两种抗生素分别作用时，需要利福平浓度为35μg/mL，或者多粘菌素E浓度为40μg/mL，才能完全抑制RP437的生长。该应用实例由此反应了这两种抗生素对RP437生长抑制协同作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。