内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法

摘要

本发明涉及一种有效评价内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法，包括以下步骤:人工饲料制备、试验对象准备、饲料混合、混药饲料包的制作、饲喂、试验统计等，本发明毒力测定方法克服了现有技术中的缺陷，采用稳定、一致性好的人工饲料混药饲喂，并模拟绿盲蝽的自然取食状态，最终达到客观正确的评价内吸性杀虫剂的杀灭效果的目的，有利于筛选出对绿盲蝽杀灭高效的杀虫剂，为指导大田绿盲蝽的防治提供技术支持。

说明书

技术领域

本发明属于农药杀虫剂领域，具体涉及一种有效评价内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法。

背景技术

绿盲蝽Apolygus lucorum (Meyer-Dür) 属半翅目(Hemiptera)盲蝽科(Miridae)后丽盲蝽属(Apolygus)，其寄主范围广泛，已报道有50余科200多种，包括棉花、枣、葡萄、樱桃、苹果、茶树等多种重要作物。近年来，由于农业产业结构的调整，果树和蔬菜种植面积的大幅度增加，为绿盲蝽提供了丰富的寄主植物和适宜的越冬场所，同时由于转Bt基因棉的大量种植，防治棉铃虫的杀虫药剂的使用量减少，导致刺吸性害虫数量急剧上升，而长期以来一直处于次要地位的绿盲蝽已成为棉田的主要害虫(Wu et al., 2008; Lu et al., 2010b)。

目前，喷施化学杀虫剂仍是控制绿盲蝽种群数量的主要手段，国内学者在杀虫剂的筛选和替代方面展开了很多工作，但大多数应用瓶膜法和点滴法筛选出了部分有效防治盲蝽的药剂，此两种方法均可评价触杀效果。例如，根据瓶膜法和点滴法测到的对绿盲蝽的毒力效果，有机磷和菊酯类杀虫剂均高于新烟碱类杀虫剂（Zhang et al.，2009；李国平等，2009；门兴元等，2010；李耀发等，2007）。因此，在实际应用中，一般都推荐了毒死蜱、马拉硫磷、联苯菊酯等触杀作用较强的药剂。但由于绿盲蝽成虫和若虫均有躲在棉花苞叶中刺吸为害的习性，导致害虫接触药剂不均一，增加了对其有效治理的难度。新烟碱类杀虫剂作用方式以内吸为主，如果内吸性杀虫剂对绿盲蝽防治效果好，盲蝽即使隐蔽在棉花苞叶内危害，取食后也将能被杀死。因此，亟待提出一种内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法，来客观正确的评价内吸性杀虫剂的效果，为指导大田绿盲蝽的防治提供技术支持。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法，可客观正确的评价内吸性杀虫剂的杀灭效果，可用于杀盲蝽药剂的筛选和复配，为指导大田绿盲蝽的防治提供技术支持。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

设计一种内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法，包括以下步骤:

（1）人工饲料制备

①以重量份计，先取蔗糖20～55份、50%蜂蜜水15～55 份、10%乙酸1～11份与70～90份水混合后加热煮沸，加热过程中加入啤酒酵母粉1～11份，再倒入混匀的鸡蛋200～355 份，不停的搅拌至成均匀一致的金黄色时为止；②再取卵黄200～450 份、黄豆粉10～45 份、小麦胚50～150份、利马豆粗粉100～250份与水850～950份均匀混合后，121°C、高压灭菌15～25min；③再取大豆卵磷脂10～45份、复合维生素10～25份、硫酸链霉素0.06～0. 30份、头孢类抗生素0.03～0.30份、37%福尔马林0.7～1.5 份、丙酸 0.7～1.5份、苯甲酸3.0～6.5份与无菌水650～670份均匀混合；④最后将步骤②灭菌后的混合料取出冷却到50°C时，分别加入步骤①和步骤③所得混合料，搅拌均匀后即成；

上述人工饲料的营养构成适合绿盲蝽的生长发育，且饲料饲养的稳定性、可重复性强，有利于保障绿盲蝽取食的一致性，以获得真实可靠的毒力检测数据；

（2）试验对象准备：

将绿盲蝽若虫用四季豆饲养至羽化成虫阶段，期间不接触任何药剂，作为试虫备用；

（3）饲料混合：

以丙酮为溶剂配制一定浓度的内吸性杀虫剂母液，再将内吸性杀虫剂母液稀释成系列等比或等差质量浓度梯度，分别取所得各个浓度的稀释液0.5～1mL均匀混入50～100g所述人工饲料中，密封4℃低温保存，作为试验组饲料备用；在相同质量的人工饲料中加入0.5～1mL丙酮，充分搅拌均匀，密封4℃低温保存，作为空白对照组饲料备用；

（4）混药饲料包的制作：

用Parafilm膜制成5cm×5cm袋体，分别灌入试验组和对照组饲料，缝口制成对应的混药饲料包，备用；

（5）饲喂：

将各混药饲料包均匀拉伸到原来的2倍（利于绿盲蝽口针刺吸），放入对应的150～300mL杯体中，再选取羽化10d内的绿盲蝽成虫饥饿处理5h，随机的以每杯10头接入到所述杯体中，杯口用纱布覆盖，放在温度为25～27℃、相对湿度为75～85%、光照L/D=16h/8h的条件下，48h后观察试验组和对照组试虫死亡情况；

（6）试验统计：

拟合药剂毒力回归曲线，查找或计算出LC₅₀值（半数致死量）及95%置信限。可采用Polo统计软件进行统计计算。

对于上述的毒力测定方法，步骤(3)所述系列等比或等差质量浓度梯度为5～7个等比或等差质量浓度梯度。

对于上述的毒力测定方法，所述试验组饲料中的内吸性杀虫剂含量控制在杀死率10～90%范围内。

对于所述内吸性杀虫剂含量的控制，可先做预备试验：将内吸性杀虫剂配置一定浓度的丙酮溶液，按照步骤（3）加入人工饲料混匀，再选取羽化10d内的绿盲蝽成虫饥饿处理5h作为试虫，在人工饲料中接入试虫48h后，根据死亡情况，上调或下调杀虫剂浓度，使杀死试虫的比例占10～90%。

本发明的积极有益效果：

本发明毒力测定方法克服了现有技术中的缺陷，采用稳定、一致性好的人工饲料混药饲喂，并模拟绿盲蝽的自然取食状态，最终达到客观正确的评价内吸性杀虫剂的杀灭效果的目的，有利于筛选出对绿盲蝽杀灭高效的杀虫剂，为指导大田绿盲蝽的防治提供技术支持。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步说明本发明技术方案。以下各实施例中所用原料，如无特别说明，则均为市售。

实施例1

一种内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法，包括以下步骤:

（1）人工饲料制备:

原料：混匀鸡蛋（蛋清、蛋黄混合）300 份、蔗糖40份、啤酒酵母6份、50%蜂蜜水30 份、卵黄350份、小麦胚100份、利马豆粗粉200份、大豆粉30份、大豆卵磷脂30份、复合维生素20份、水1640份、硫酸链霉素0.15份、头孢类抗生素0.15份、10%乙酸6份、37%福尔马林1.2份、丙酸1.2份、苯甲酸5份，所述人工饲料的制备方法包括以下步骤：1）先将蔗糖、蜂蜜水、10%乙酸与80份水混合后加热煮沸，加热过程中加入啤酒酵母粉，再倒入混匀的鸡蛋，不停的搅拌，至混合料成金黄色且均匀一致时为止；2）将卵黄、黄豆粉、小麦胚、利马豆粗粉与水900份均匀混合后，121°C、高压灭菌20min；3）再将大豆卵磷脂、复合维生素、抗生素、其余防腐剂与无菌水660份均匀混 合 ；4）将步骤2） 灭菌后的混合料取出冷却到 50°C 时，分别加入步骤1）和步骤3）所得混合料，搅拌均匀后即成；

（2）试验对象准备:

将绿盲蝽若虫用四季豆饲养至羽化成虫阶段，期间不接触任何药剂，作为试虫备用；

（3）饲料混合：

以丙酮为溶剂配制一定浓度的杀虫剂母液，再将杀虫剂母液稀释成系列等比或等差质量浓度梯度（见表1），分别取所得各个浓度的稀释液1mL均匀混入100g所述人工饲料中，密封4℃低温保存，作为试验组饲料备用；在相同质量的人工饲料中加入1mL丙酮，充分搅拌均匀，密封4℃低温保存，作为空白对照组饲料备用；

表1 杀虫剂种类及质量浓度梯度设置

（4）混药饲料包的制作：

用Parafilm膜制成5cm×5cm袋体，分别灌入试验组和对照组饲料，缝口制成对应的混药饲料包，备用；

（5）饲喂：

将各混药饲料包均匀拉伸到原来的2倍，放入对应的250mL杯体中，再选取羽化10d内的绿盲蝽成虫饥饿处理5h，随机的以每杯10头接入到所述杯体中，杯口用纱布覆盖，放在温度为25～27℃、相对湿度为75～85%、光照L/D=16h/8h的条件下，48h后观察试验组和对照组试虫死亡情况(用镊子或其他硬物扰动成虫，若不能正常爬动则判断为死亡)，每个处理设3个重复；

（6）试验统计：

拟合药剂毒力回归曲线，查找或计算出LC₅₀值及95%置信限，各试验中均设对照处理，采用polo-pc ( Leora，1987 )软件进行分析；

（7）统计结果：

由表2可以看出，有机磷类杀虫剂对绿盲蝽成虫的毒力顺序为马拉硫磷、毒死蜱、辛硫磷、乙酰甲胺磷、乐果，LC₅₀值分别为0.108、0.173、0.745、0.758、4.425μg/mL，菊酯类杀虫剂对绿盲蝽毒力LC₅₀值分别为联苯菊酯、溴氰菊酯、三氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯，0.062、1.100、3.163、6.479μg/mL；新烟碱类杀虫剂的毒力啶虫脒、烯啶虫胺、吡虫啉、噻虫嗪，LC₅₀值分别为0.034、0.025、0.011、0.051μg/mL。根据LC₅₀值置信区间重叠是否，新烟碱类杀虫剂的LC₅₀值明显低于有机磷杀虫剂和菊酯类杀虫剂，倍数相差约10～100倍，说明新烟碱类杀虫剂的内吸性效果极好。

表2 实施例1试验统计结果

对比例1（瓶膜法）

一种内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法，包括以下步骤:

（1）人工饲料制备:

同实施例1。

（2）试验对象准备:

将绿盲蝽若虫用四季豆饲养至羽化成虫阶段，期间不接触任何药剂，作为试虫备用；

（3）利用丙酮作为有机溶剂配制一定浓度的母液，再按照表1将母液稀释成系列质量浓度梯度；用移液枪将待测质量浓度的药液0.5mL移入20mL闪烁瓶，空白对照为不含药液的0.5mL丙酮，将闪烁瓶平放在热狗机上旋转，室温下使有机溶剂丙酮挥发，在瓶内壁形成均匀一致的药膜。将两头羽化10天以内的绿盲蝽成虫放入具有药膜的闪烁瓶，并放入厚约3mm的新鲜四季豆1片作为食物，每个浓度测10头成虫，瓶口用棉塞塞住，放在温度为25～27℃、相对湿度为75～85%、光照L/D=16h/8h的条件下，24h后测定死亡率(用镊子或其他硬物扰动成虫，若不能正常爬动则判断为死亡)，每个处理设3个重复；

（4）试验统计：

拟合药剂毒力回归曲线，查找或计算出LC₅₀值及95%置信限；

（5）统计结果：

采用瓶膜法，由表3可以看出，有机磷类杀虫剂对绿盲蝽成虫的毒力顺序为毒死蜱>马拉硫磷、辛硫磷>乙酰甲安磷>乐果，LC₅₀值分别为1.803、3.486、4.659、20.06、27.602μg/mL，菊酯类杀虫剂对绿盲蝽成虫的毒力顺序为联苯菊酯>三氟氯氰菊酯>溴氰菊酯>高效氯氰菊酯，LC₅₀值分别为0.698、48.453、63.333、81.703μg/mL；新烟碱类杀虫剂的毒力烯啶虫胺、吡虫啉、噻虫嗪、啶虫脒， LC₅₀值分别为428.205、472.644、370.282、425.657μg/mL。根据LC₅₀值置信区间重叠是否，新烟碱类杀虫剂的LC₅₀值显著高于有机磷杀虫剂和菊酯类杀虫剂，说明新烟碱类杀虫剂的触杀效果差。

表3 对比例1试验统计结果

综上，将实施例1和对比例1进行对比，由瓶膜法毒力测定结果可以看出，与有机磷类、菊酯类杀虫剂相比，新烟碱类杀虫剂对绿盲蝽的触杀毒力较差。由实施例1毒力测定结果可以看出，与有机磷类、菊酯类杀虫剂相比，新烟碱类杀虫剂对绿盲蝽成虫的内吸作用好。

实施例2

一种内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法，包括以下步骤:

（1）人工饲料制备:

原料：混匀鸡蛋200份、蔗糖20份、啤酒酵母1份、50%蜂蜜水15份、卵黄200份、小麦胚50份、利马豆粗粉100份、大豆粉10份、大豆卵磷脂10份、复合维生素 10份、水1570份、硫酸链霉素0.06份、头孢类抗生素0.03份、10%乙酸1份、37%福尔马林0.7份、丙酸 0.7份、苯甲酸3.0份，所述人工饲料的制备方法包括以下步骤：1）先将蔗糖、蜂蜜水、10%乙酸与70份水混合后加热煮沸，加热过程中加入啤酒酵母粉，再倒入混匀的鸡蛋，不停的搅拌，至混合料成金黄色且均匀一致时为止；2）将卵黄、黄豆粉、小麦胚、利马豆粗粉与水 850份均匀混合后，121°C、高压灭菌15min；3）再将大豆卵磷脂、复合维生素、抗生素、其余防腐剂与无菌水 650份均匀混 合 ；4）将步骤2） 灭菌后的混合料取出冷却到 50°C 时，分别加入步骤1）和步骤3）所得混合料，搅拌均匀后即成；

（2）试验对象准备:

将绿盲蝽若虫用四季豆饲养至羽化成虫阶段，期间不接触任何药剂，作为试虫备用；

（3）饲料混合：

以丙酮为溶剂配制一定浓度的内吸性杀虫剂母液，再将内吸性杀虫剂母液稀释成系列等比或等差质量浓度梯度，分别取所得各个浓度的稀释液0.5mL均匀混入50g所述人工饲料中，密封4℃低温保存，作为试验组饲料备用；在相同质量的人工饲料中加入0.5mL丙酮，充分搅拌均匀，密封4℃低温保存，作为空白对照组饲料备用；

（4）混药饲料包的制作：

用Parafilm膜制成5cm×5cm袋体，分别灌入试验组和对照组饲料，缝口制成对应的混药饲料包，备用；

（5）饲喂：

将各混药饲料包均匀拉伸到原来的2倍，放入对应的300mL杯体中，再选取羽化10d内的绿盲蝽成虫饥饿处理5h，随机的以每杯10头接入到所述杯体中，杯口用纱布覆盖，放在温度为25～27℃、相对湿度为75～85%、光照L/D=16h/8h的条件下，48h后观察试验组和对照组试虫死亡情况(用镊子或其他硬物扰动成虫，若不能正常爬动则判断为死亡)，每个处理设3个重复；

（6）试验统计：

拟合药剂毒力回归曲线，查找或计算出LC₅₀值及95%置信限，各试验中均设对照处理，采用polo-pc ( Leora，1987 )软件进行分析。

实施例3

一种内吸性杀虫剂对绿盲蝽的毒力测定方法，包括以下步骤:

（1）人工饲料制备:

原料：混匀鸡蛋355份、蔗糖55份、啤酒酵母11份、50%蜂蜜水55 份、卵黄450份、小麦胚150份、利马豆粗粉250份、大豆粉45份、大豆卵磷脂45份、复合维生素25份、水1710份、硫酸链霉素0. 30份、头孢类抗生素0.30份、10%乙酸11份、37%福尔马林1.5份、丙酸1.5份、苯甲酸6.5份，所述人工饲料的制备方法包括以下步骤：1）先将蔗糖、蜂蜜水、10%乙酸与90份水混合后加热煮沸，加热过程中加入啤酒酵母粉，再倒入混匀的鸡蛋，不停的搅拌，至混合料成金黄色且均匀一致时为止；2）将卵黄、黄豆粉、小麦胚、利马豆粗粉与水950份均匀混合后，121°C、高压灭菌25min；3）再将大豆卵磷脂、复合维生素、抗生素、其余防腐剂与无菌水670份均匀混 合 ；4）将步骤2） 灭菌后的混合料取出冷却到 50°C 时，分别加入步骤1）和步骤3）所得混合料，搅拌均匀后即成；

（2）试验对象准备:

将绿盲蝽若虫用四季豆饲养至羽化成虫阶段，期间不接触任何药剂，作为试虫备用；

（3）饲料混合：

以丙酮为溶剂配制一定浓度的内吸性杀虫剂母液，再将内吸性杀虫剂母液稀释成系列等比或等差质量浓度梯度，分别取所得各个浓度的稀释液0.75mL均匀混入75g所述人工饲料中，密封4℃低温保存，作为试验组饲料备用；在相同质量的人工饲料中加入0.75mL丙酮，充分搅拌均匀，密封4℃低温保存，作为空白对照组饲料备用；

（4）混药饲料包的制作：

用Parafilm膜制成5cm×5cm袋体，分别灌入试验组和对照组饲料，缝口制成对应的混药饲料包，备用；

（5）饲喂：

将各混药饲料包均匀拉伸到原来的2倍，放入对应的150mL杯体中，再选取羽化10d内的绿盲蝽成虫饥饿处理5h，随机的以每杯10头接入到所述杯体中，杯口用纱布覆盖，放在温度为25～27℃、相对湿度为75～85%、光照L/D=16h/8h的条件下，48h后观察试验组和对照组试虫死亡情况(用镊子或其他硬物扰动成虫，若不能正常爬动则判断为死亡)，每个处理设3个重复；

（6）试验统计：

拟合药剂毒力回归曲线，查找或计算出LC₅₀值及95%置信限，各试验中均设对照处理，采用polo-pc ( Leora，1987 )软件进行分析。