蜜环菌菌剂的制备方法及该方法制成的蜜环菌菌剂

摘要

本发明涉及真菌菌剂制备领域，具体而言，涉及一种蜜环菌菌剂的制备方法及该方法制成的蜜环菌菌剂。蜜环菌菌剂的制备方法，包括将蜜环菌原菌的菌索段接入菌株保藏培养基中培养后常温放置，得到待活化菌种；将待活化菌种的尖端菌索转接至菌种活化培养基中进行活化；将活化后菌种扩繁；将扩繁后的固体菌种进行两次暗培养，得到二级液体菌种，并进行深层发酵培养。本发明提供的该方法可获得用于直接侵染枝条的蜜环菌菌剂，该菌剂接种到枝条后约30天即可用于人工种植猪苓或天麻，与现有技术相比，缩短了菌材的获取时间(不经过原种阶段)，进而使得蜜环菌菌材的产量得到保障，还可为医药业获取其药用成分提供充足的物质来源。

说明书

技术领域

本发明涉及真菌菌剂制备领域，具体而言，涉及一种蜜环菌菌 剂的制备方法及该方法制成的蜜环菌菌剂。

背景技术

蜜环菌Armillaria mellea(vahl.ex Fr.)Quel是一种药(食)用菌， 隶属于担子菌亚门(Basidomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞 菌目(Agaricales)，口蘑科(Tricholomataceae)，又名糖蕈、蜜色环菌、 蜜蘑、栎菌、小蜜环菌、蜜环蕈、青冈菌；该菌是仅有的几个具有 菌索的种类之一，在东北地区俗称“榛蘑”。当前，蜜环菌人工栽培 产量有限。

在相关技术中，蜜环菌菌索生长缓慢、形成菌球时间长、出菇 条件苛刻，进而使得蜜环菌菌材的产量不能得到保障。随着蜜环菌 菌材在作为药材(或食材)方面的需求不断增大，因此，提供一种 能够直接侵染枝条(以实现蜜环菌菌材制备)的蜜环菌菌剂是生产 中亟待解决的一个技术问题。

发明内容

本发明的目的在于一种蜜环菌菌剂的制备方法，以解决上述的 技术问题。

在本发明的实施例中提供了一种蜜环菌菌剂的制备方法，包括 以下步骤：

1)、将蜜环菌原菌的菌索段接入菌株保藏培养基中进行培养， 待所述菌索段的尖端长至所述菌株保藏培养基深度的1/2时，置于 22-25℃的温度下放置3天，得到待活化菌种；

其中，按照重量份数计，所述菌株保藏培养基的原料组份包括： 玉米粉提取液38-42份、蔗糖18-22份、麸皮28-32份、琼脂8-12 份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾0.5-1.5份；

2)、将所述待活化菌种的尖端菌索转接至菌种活化培养基中进 行活化，得到活化后菌种；

其中，按照重量份数计，所述菌种活化培养基的原料组份包括： 麦粒提取液38-42份、琼脂8-12份、葡萄糖18-22份、磷酸二氢钾 1-2份、硫酸镁2-4份；

3)、将所述活化后菌种接种到另一新的所述菌种活化培养基中 进行扩繁，得到扩繁后的固体菌种；

4)、利用麸皮液体培养基将所述扩繁后的固体菌种进行两次暗 培养，得到二级液体菌种；

其中，按照重量份数计，所述麸皮液体培养基包括：麸皮提取 液48-52份、葡萄糖18-22份、磷酸二氢钾1-2份、硫酸镁0.75份、 维生素0.01份；

5)、将所述二级液体菌种接入所述麸皮液体培养基中进行深层 发酵培养，得到能够直接侵染枝条的蜜环菌菌剂。

本发明提供的这种蜜环菌菌剂的制备方法，通过探索蜜环菌的 生长条件，依次将其原菌的菌索段(一般来源于与其伴生的猪苓或 天麻专用菌株)接种到菌株保藏培养基中，该培养基含有大量的玉 米粉提取液以及碳源等，可供菌株的营养所需。接种后，菌索段的 尖端会向着培养基的内部生长，待其伸入到培养基后，置于0-4℃ 的温度下保藏(半年内蜜环菌的种性不会发生明显变化)，使其处于 半休眠状态，以后使用时进行活化。

在活化的过程中，优选利用菌种活化培养基，该培养基的组份 配比最适于菌种的生长，一般而言，仅需7-10天即可布满整个培养 基。得到活化后菌种后，为了保证所获菌材的质量，需要将其利用 优选的培养基(菌种活化培养基)进行扩繁，该培养基会使得活化 后的固体菌种的菌丝球生长状况非常好(萌发天数、满皿天数短、 菌索干重量大)。扩繁之后，将扩繁后的固体菌种利用液体培养基进 行培养，进而得到二级液体菌种；最后再通过深层发酵培养之后即 可获得能够直接侵染枝条的蜜环菌菌剂。通过实验测定，该蜜环菌 菌剂可直接侵染枝条，接种枝条约30天之后即可形成栽培用的菌 枝。

综上，通过本发明实施例提供的这种方法可获得用于直接侵染 枝条的蜜环菌菌剂，该菌剂接种到枝条后约30天即可用于人工种植 猪苓或天麻，与现有技术相比，缩短了菌材的获取时间(不经过原种 阶段)，进而使得蜜环菌菌材的产量得到保障，还可为医药业获取其 药用成分提供充足的物质来源。

可选的，在步骤2)中：具体包括：将所述待活化菌种常温放 置46-50小时后，挑选其菌索尖端的白色或淡黄色的生长点并转接 至活化培养基中培养7-10天，得到活化后菌种。

可选的，在步骤4)具体包括：将所述扩繁后的固体菌种接入 至所述麸皮液体培养基中，暗培养8-12天，得到一级液体菌种；

将所述一级液体菌种按照8-12％的接种量转接至另一新的麸皮 液体培养基继续暗培养，得到二级液体菌种。

可选的，在所述将所述扩繁后的固体菌种接入至所述麸皮液体 培养基中，暗培养8-12天，得到一级液体菌种的步骤中；

暗培养的温度为28-30℃、转速为140-160转/分钟。

可选的，在步骤5)中：在所述深层发酵培养的过程中，溶氧 量为48-52％、pH为7、温度为28-30℃、消泡剂体积浓度2‰。

可选的，在步骤5)中，所述深层发酵培养的时间为8-12天。

可选的，在步骤5)之后，还包括：将所述蜜环菌菌剂接种到 枝条上，培养28-32天，得到能够人工栽培的菌枝。

可选的，所述枝条选自桃树、山楂树、柳树、海棠树、樱桃树、 橡树、柿子树、榛树、杏树、榆树、小叶杨、山丁子树、桦树、苦 栎、板栗中的一种或多种。

上述的制备方法制成的蜜环菌菌剂。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方 案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作 简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施 方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提 下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例一提供的蜜环菌菌剂的制作方法的制备流 程示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发 明的技术方案进行清楚、完整的描述，基于本发明中的具体实施方 式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的 所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

实施例一

请参考图1，本发明提供的这种蜜环菌菌剂的制备方法，包括 以下步骤：

步骤101：将蜜环菌原菌的菌索段接入菌株保藏培养基中进行 培养，待所述菌索段的尖端长至所述菌株保藏培养基深度的1/2时， 置于22-25℃的温度下放置3天，得到待活化菌种；

步骤101为菌株保藏的阶段，在该步骤中，于菌株保藏培养基 中接入需要保藏的蜜环菌原菌的菌索段(优选源于相伴生的猪苓或 天麻专用菌株)。

另外，按照重量份数计，所述菌株保藏培养基的原料组份包括： 玉米粉提取液38-42份、蔗糖18-22份、麸皮28-32份、琼脂8-12 份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾0.5-1.5份。

更具体的，原料组份包括：玉米粉提取液40份、蔗糖20份、 麸皮30份、琼脂10份、硫酸镁0.5份、磷酸二氢钾1份；在具体 操作的过程中，每份为1克，并且各组份混匀后，定容至1升，趁 热灌入试管，培养基液柱高约占试管长度的1/2-2/3，121℃、0.1Mpa 下直立灭菌30min后备用。

步骤102：将所述待活化菌种的尖端菌索转接至菌种活化培养 基中进行活化，得到活化后菌种；

具体的，在步骤102中，由于在菌株保藏的过程中，菌株的菌 索是向培养基内部生长的，因此，在取其尖端菌索进行活化时，需 要将试管的底部打碎，并在无菌条件下取出分叉多的尖端菌索，转 接到菌种活化培养基平板中进行活化。

其中，按照重量份数计，所述菌种活化培养基的原料组份包括： 麦粒提取液38-42份、琼脂8-12份、葡萄糖18-22份、磷酸二氢钾 1-2份、硫酸镁2-4份；更具体的，其原料组份包括：麦粒提取液 40份、琼脂10份、葡萄糖20份、磷酸二氢钾1.5份、硫酸镁3份； 在具体操作的过程中，每份为1克，且各组份混合之后定容至1升， 装入三角瓶封口后在121℃、0.101Mpa下灭菌30min，趁热倒平板， 每个平板中的培养基体积约为30ml。

步骤103：将所述活化后菌种接种到另一新的所述菌种活化培 养基中进行扩繁，得到扩繁后的固体菌种；

在步骤103中，扩繁的过程是至关重要的，如果培养基组份配 比选择不当，则对活化后菌种的生态状况的影响是非常大的；在本 实施例中，优选的，扩繁的过程中采用麦粒浸出液培养基(组份与 菌种活化培养基一致)。为了该培养基的培养效果，在本实施例中， 采用了其他5种不同配方的培养基在相同的培养条件下与该麦粒浸 出液培养基进行了对比：

1、CPDA综合：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、磷酸二 氢钾3g、硫酸镁1.5g、VB1微量；2、GPY:葡萄糖20g、蛋白胨 5g、酵母膏10g、琼脂15g；3、MEA:麦芽浸膏30g、大豆蛋白胨 3g、琼脂15g；4、GPC半固体：葡萄糖20g、蛋白胨5g、玉米粉 10g(取浸出液)、琼脂15g；5、麸皮培养基：麸皮50g、葡萄糖20g、 磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.75g、琼脂15g。

上述5种培养基按照既定的组份混合溶解后均定容到1升后进 行灭菌处理，再进行接种活化后菌种的实验：将活化后的大小相同 的菌株块接种上述6种(包括麦粒浸出液培养基)不同配方的培养 基中部，每种配方3次重复。置于25℃培养箱中进行黑暗恒温培养， 测量菌种块在不同培养基中的萌发时间、菌索干重等情况；其不同 配方的菌丝球生长状况如表1所示：

表1 不同配方的菌丝球生长状况

通过表1可以看出，综合萌发天数、满皿天数以及菌索干重等 多个指数，采用麦粒浸出液培养基，其培养效果明显优于其他5种 培养基；因此，在本实施例中采用该培养基进行菌种的扩繁操作。

步骤104：利用麸皮液体培养基将所述扩繁后的固体菌种进行 两次暗培养，得到二级液体菌种；

在该步骤中，液体培养基组份如果选择不当，则会使得所获菌 液的质量和浓度明显下降；因此，在本实施例中，选用麸皮液体培 养基；并且，按照重量份数计，所述麸皮液体培养基包括：麸皮提 取液48-52份、葡萄糖18-22份、磷酸二氢钾1-2份、硫酸镁0.75 份、维生素0.01份。

更具体的，该液体培养基组份包括麸皮提取液50份、葡萄糖 20份、磷酸二氢钾1.5份、硫酸镁0.75份、维生素0.01份；且每份 为1克，各组份混匀后，定容至1升。

对与该液体培养基的获取，本实施例提供了以下5种液体培养 基并与对比麸皮液体培养基；通过观察不同配方的菌种菌丝球生长 状况进而获取该麸皮液体培养基。具体的，5种常见的液体培养基 (A、B、C、E、F)为：

A：豆饼粉250g、玉米浆20g、糊精25g、VB10.6g、磷酸二氢 钾3g；

B：马铃薯200g、麸皮20g、蔗糖20g、葡萄糖10g、硫酸镁1.5g、 磷酸二氢钾3g；

C：豆饼粉10g、蚕蛹粉10g、蔗糖10g、葡萄糖20g、硫酸镁 0.75g、磷酸二氢钾1.5g；

E：玉米粉100g、麦麸80g、黄豆粉10g、蔗糖或者葡萄糖20g；

F：黄豆粉10g、花生饼粉10g、葡萄糖10g、白蔗糖20g、磷 酸二氢钾1.5g、硫酸镁0.75g。

上述培养基的各组分混合后，定容至1升；并且在对比的过程 中，每个液体配方装入500ml摇瓶中，灭菌后冷却，按照10％的接 种量接入预先准备好的一级液体菌种(来源于扩繁后的固体菌种)， 放入摇床中震荡培养7d后称量菌球干重和直径，结果请参考表2：

表2 不同配方的菌丝球生长状况

通过表2可以看出，利用麸皮液体培养基(D)，所获菌丝球直 径和菌丝球干重明显优于其与几种常见的培养基。因此，在本实施 例中，在两次暗培养的过程中均采用该麸皮液体培养基，进而获得 质量更优的二级液体菌种。

步骤105：将所述二级液体菌种接入所述麸皮液体培养基中进 行深层发酵培养，得到能够直接侵染枝条的蜜环菌菌剂。

在步骤105中，其为菌剂的制备阶段，将获得的二级液体菌种 继续接入到麸皮液体培养基中进行发酵培养，通过设定深层发酵培 养的条件，进而获得能够直接侵染枝条的蜜环菌菌剂。在深层发酵 培养的过程中，一般采用5L发酵罐，对其依次进行空消、装料、 灭菌、冷却、接种、培养、取样检验等步骤，8-12d后即可放罐， 并且获得蜜环菌菌剂。

本发明实施例提供的这种蜜环菌菌剂的制作方法，其通过探索 蜜环菌的生长条件，依次将其原菌的菌索段(一般来源于与其伴生 的猪苓或天麻专用菌株)接种到菌株保藏培养基中，该培养基含有 大量的玉米粉提取液以及碳源等，可供菌株的营养所需，接种后， 菌索段的尖端会向着培养基的内部生长，待其伸入到培养基深度的 1/2后，置于0-4的温度下保藏，使其处于休眠状态，得到待活化的 菌种，以进行后续的活化步骤。在活化的过程中，优选利用菌种活 化培养基，该培养基的组份配比最适于菌种的生长，一般而言， 25-28℃仅需7-10天即可布满整个培养基。得到活化菌种后，为了 保证后续菌材的质量，需要将其利用优选的培养基(菌种活化培养 基)进行扩繁，该培养基会使得活化后的固体菌种的菌丝球生长状 况非常好(萌发天数、满皿天数短、菌索干重量大)。扩繁之后，再 将扩繁后的固体菌种利用液体培养基进行培养，进而得到二级液体 菌种；最后再通过深层发酵培养之后即可获得能够直接侵染枝条的 蜜环菌菌剂。通过实验测定，该蜜环菌菌剂可直接侵染枝条，接种 枝条约30天之后即可形成栽培用的菌枝。

通过本发明实施例提供的这种方法可获得用于直接侵染枝条的 蜜环菌菌剂，该菌剂接种到枝条后约30天即可用于人工栽培，与现 有技术相比，缩短了菌材的获取时间(不经过原种阶段)，进而使得 蜜环菌菌材的产量得到保障，可为医药业获取其药用成分提供充足 的物质来源。

为了使得本发明上述实施例的蜜环菌菌剂的制备方法得到更好 的应用，更加有效地实现蜜环菌菌剂的制备过程，本发明还在上述 实施例的基础之上提供了实施例二，实施例二给是上述实施例的蜜 环菌菌剂的制备方法的制作方法的进一步限定和增加，现做详细的 阐述和解释：

实施例二

在本实施例中，蜜环菌菌剂的制备方法的制备方法包括以下步 骤：

S1：与步骤101一致，在此步骤赘述。

S2：将所述待活化菌种常温放置46-50小时后，挑选其菌索尖 端的白色或淡黄色的生长点并转接至活化培养基中培养7-10天，得 到活化后菌种；

具体的，在S2中，为了使得保藏的菌种的理化性能以及活力 不受影响，在得到待活化菌种后，优选常温放置46-50小时后。然 后再挑选其菌索尖端的白色或淡黄色的生长点(非常易于培养和转 接，)并转接至活化培养基中培养7-10天，得到活化后菌种。另外， 在该步骤中，由于活化培养基的优选设定，活化的过程仅需7-10天 即可完成。

S3：与步骤103一致，在此不作赘述。

S4：将所述扩繁后的固体菌种接入至所述麸皮液体培养基中， 暗培养8-12天，得到一级液体菌种；

在步骤S4中，优选的，暗培养的温度为28-30℃、转速为140-160 转/分钟。另外，培养时间以7天为最宜。

S5：将所述一级液体菌种按照8-12％的接种量转接至另一新的 麸皮液体培养基继续暗培养，得到二级液体菌种；

在步骤S5中，其培养条件与S4一致。

S6：将所述二级液体菌种接入所述麸皮液体培养基中进行深层 发酵培养，得到能够直接侵染枝条的蜜环菌菌剂；

一般而言，按照上述的培养条件操作后，深层发酵培养8-12天 即可获得蜜环菌菌剂，另外，优选的，所述深层发酵培养的过程中， 溶氧量为48-52％、pH为7、温度为28-30℃、消泡剂体积浓度2‰ 在该条件下，培养10天后，其菌丝的产率可以达到3.635g/L，该菌 剂完全具备侵染枝条的能力。

蜜环菌菌剂颜色为深红棕色，颜色深浅略有不同、清澈透明， 发酵液上方有微量泡沫。发酵过程中，菌球边缘有星状分支、外形 清晰可见，在整个发酵过程，发酵液不会转色变而呈现黄色、黑色、 绿色等，取样时，有“榛蘑”的清香；无酸、霉、臭等刺激味道。 镜检发现蜜环菌菌丝片段条带状，且无点状细菌感染。

S7：将所述蜜环菌菌剂接种到枝条上，培养28-32天，得到能 够人工栽培的菌枝。

为了验证该实施例制备的蜜环菌菌剂其浸染枝条的能力以及所 能侵染优选的治疗，本实施例采用了山楂树、柳树、海棠树、樱桃 树、橡树、柿子树、榛树、杏树、榆树、小叶杨、山丁子树、桦树、 苦栎、板栗等进行了接种蜜环菌菌剂的实验。

具体的，选择直径在1.0-1.5cm的供试枝条，截成长3.0-5.0cm 短棒，置于250ml广口瓶中，每瓶装枝条约55克，水加至瓶肩处， 121-123℃灭菌2h，自然冷却。然后，在无菌条件下，将蜜环菌菌 剂5.5ml接种到枝条，接种需在冷却完成的当天全部结束，以防止 枝条的营养被其他杂菌利用，每树种设3次重复，25℃黑暗条件培 养。最后，定期对菌索进行形态学观察并借助刻度尺测量菌索长速， 并在菌索长满整个枝条后用手术刀及小镊子将韧皮部内侧的菌索刮 取干净，于80℃烘干24小时称重。表3-表5分别为实验条件下的 菌索干重比较、菌索生长速度的比较以及不同树种菌索粗壮程度比 较结果，具体请参考表3-表5：

表3 菌剂接种后菌索干重比较

通过表3可以看出，所举的14种枝条均能够被蜜环菌菌剂侵染， 其中，山丁子枝条的菌索获得量最高，而且板栗、柳树以及苦栎等 枝条的菌索获得量均较高，达到了1.0g以上，预示着可以采用该几 种枝条作为优选的接种枝条。

表4 菌剂接种后菌索生长速度的比较

通过表4可以看出，不同的树种枝条，接种蜜环菌菌剂后，其 菌索的生长速度是存在明显差异的。其中，柿子树的菌索生长速度 最大，可达到0.428±0.054cm，现对而言，杏树和榛树的接种生长速 度则较慢；因此，在要求菌索较快生长的实际需求中，可以优选将 蜜环菌菌剂接种到柿子树或者板栗的枝条上。

表5 不同树种菌索粗壮程度比较

注：“⁺”表示程度较大，“+”表示程度较小。

通过表5可以看出，对于菌索粗壮程度，山丁子，苦栎以及榛 树的生长状况明显优于其他几种树种，而且其接种后开始萌芽的天 数也较短，3天后即可；但是，上述所有的树种均可实现蜜环菌菌 剂的接种，将其培养预定时间后，可直接进行人工栽培菌枝，进而 实现了蜜环菌的人工栽培。

综上，本发明实施例提供的这种蜜环菌菌剂的制作方法其充分 考虑了各环节彼此之间的相关性，建立起适用从菌种保藏、活化到 蜜环菌菌剂活性鉴定的全套技术体系，获得的该蜜环菌菌剂可直接 侵染枝条，接种枝条约30天之后即可形成栽培用的菌枝，为人工栽 培奠定了基础，进而使得蜜环菌菌材的产量得到保障，可为医药业 获取其药用成分提供充足的物质来源。另外，本发明实施例提供的 蜜环菌菌剂的制备方法，具有工艺操作简便、所产的菌剂活性高、 性能稳定、发菌点多，菌材表面菌索浓密等优点。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在 本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。