公开/公告号CN104789673A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-07-22
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申请/专利权人 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所;
申请/专利号CN201510174043.6
申请日2015-04-13
分类号
代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司;
代理人关畅
地址 100071 北京市丰台区东大街20号院五所四室
入库时间 2023-12-18 10:02:35
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-06-30
授权
授权
2015-08-19
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20150413
实质审查的生效
2015-07-22
公开
公开
技术领域
本发明涉及生物医学领域中rs1800818在检测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板 减少综合征中的应用。
背景技术
发热伴血小板减少综合征(Severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS),也有人称之为发热,血小板和白细胞减少综合征(Fever,Thrombocytopenia and Leukopenia Syndrome,FTLS),是出现在我国的一种新型布尼亚病毒(发热伴血小板 减少综合征布尼亚病毒,Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV,简称新布尼亚病毒)通过血液感染的新发传染病,主要临床表现为急性发热(多 在38℃以上),血小板和白细胞减少,部分病例出现牙龈出血、皮肤瘀斑等出血症状, 少数患者可因多器官损害而死亡。该病尚无有效的疫苗和治疗方法。已有研究显示, 健康人群中存在SFTSV隐性感染。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是存在于某一(些)群 体、正常个体的基因组DNA中单碱基的序列差异,是继限制性酶切长度多态性和微卫 星之后的第三代遗传标记。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何筛查新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少 综合征患者。
为解决上述技术问题,本发明首先提供了下述A1)-A6)中的任一种用途:
A1)检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型的物质在制备筛查发热伴血小 板减少综合征患者产品中的应用;
A2)检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型的物质在制备检测发热伴血小 板减少综合征易感性产品中的应用;
A3)检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型的物质在制备检测与发热伴血 小板减少综合征相关的单核苷酸多态性的产品中的应用;
A4)检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定 与发热伴血小板减少综合征相关的单核苷酸多态性的产品中的应用;
A5)人基因组中rs1800818的多态性或基因型在制备筛查发热伴血小板减少综合 征患者的产品中的应用;
A6)人基因组中rs1800818的多态性或基因型在制备检测发热伴血小板减少综合 征易感性产品中的应用。
rs1800818是人染色体上的一个二等位多态性的SNP位点,该变异是转换(A/G, 在其互补链上则为T/C)。所述rs1800818基因型是AA、AG或GG。所述AA是rs1800818 位点为A的纯合型,所述GG是rs1800818位点为G的纯合型,所述AG是rs1800818 位点为A和G的杂合型。所述检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型具体可通 过检测rs1800818的核苷酸种类确定。
上述用途中,所述检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型的物质可包括扩 增包括rs1800818在内的基因组DNA片段的PCR引物对和/或单碱基延伸引物。
上述用途中,所述GG和所述AG基因型的个体在发热伴血小板减少综合征患者群 体中的比例分别高于对应的基因型在新布尼亚病毒隐性感染者中的比例。
上述用途中,所述发热伴血小板减少综合征具体为新布尼亚病毒引起的发热伴 血小板减少综合征。
为解决上述技术问题,本发明还提供了含有检测人基因组中rs1800818的多态性 或基因型的物质的产品。
本发明所提供的含有检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型的物质的产 品,为a)-d)中的任一种:
a)检测与发热伴血小板减少综合征相关的单核苷酸多态性或基因型的产品;
b)鉴定或辅助鉴定与发热伴血小板减少综合征相关的单核苷酸多态性或基因型 的产品;
c)筛查发热伴血小板减少综合征患者产品;
d)检测发热伴血小板减少综合征易感性产品。
上述产品中,所述检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型的物质可包括扩 增包括rs1800818在内的基因组DNA片段的PCR引物对和/或单碱基延伸引物。
上述产品中,所述GG和所述AG基因型的个体在发热伴血小板减少综合征患者群 体中的比例分别高于对应的基因型在新布尼亚病毒隐性感染者中的比例。
上述产品中,所述发热伴血小板减少综合征具体为新布尼亚病毒引起的发热伴 血小板减少综合征。
在本发明的实施例中,所述发热伴血小板减少综合征具体为中国人群发热伴血小 板减少综合征。
本发明中,所述扩增包括rs1800818在内的基因组DNA片段的PCR引物对可由序 列表中SEQ ID No.1所示的单链DNA和序列表中SEQ ID No.2所示的单链DNA组成; 所述单碱基延伸引物的核苷酸序列可如序列表中SEQ ID No.3所示。
实验证明,rs1800818的G等位在病例组中的比例高于该等位在对照组中的比例, 具有统计学差异,说明rs1800818的G等位为发热伴血小板减少综合征的风险等位。 rs1800818的三个基因型中,GG基因型和AG基因型在病例组中的比例高于这两个基 因型在对照组中的比例;AA基因型在病例组中的比例低于在对照组中的比例。与携 带rs1800818位点AA基因型的个体相比,携带rs1800818位点GG基因型以及AG基 因型的个体发热伴血小板减少综合征发病风险增加,比值比(Odds ratio,OR)为 3.85,P<0.001,说明rs1800818多态性位点与发热伴血小板减少综合征的发生显 著关联。
在实际应用中,可将检测rs1800818的多态性或基因型的物质与其它物质(如检 测其它的与发热伴血小板减少综合征相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在 一起制备筛查发热伴血小板减少综合征患者的产品。
其中,检测人基因组中rs1800818的多态性或基因型的物质可为通过下述至少一 种方法确定rs1800818的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器:DNA测序、限制性酶 切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片、TaqMan探针技 术和Sequenom MassArray技术。其中,利用Sequenom MassArray技术确定rs1800818 的多态性或基因型所需的试剂和/或仪器包括PCR引物对、基于单碱基延伸反应的延伸 引物、磷酸酶(如虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP))、树脂、 芯片、MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization–time of fligh, 基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱)以及Sequenom MassArray技术所需要的其他 试剂和仪器;利用TaqMan探针技术确定rs1800818的多态性或基因型所需的试剂和/ 或仪器包括TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的软件(如7500 System SDS software)以及TaqMan探针技术所需要的其他试剂;SNP芯片包括基于 核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反 应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切 酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片,及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
所述产品可为试剂或试剂盒,还可为由试剂或试剂盒与仪器组成的系统,如由引 物和DNA测序仪组成的系统,由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的系统, 由TaqMan探针、PCR引物对、定量PCR仪和进行基因分型的软件以及TaqMan探针技 术所需要的其他试剂组成的系统,由PCR引物对、单碱基延伸引物、芯片、PCR仪和 进行基因分型的软件以及Sequenom MassArray技术所需要的其他试剂和仪器组成的系 统。
本发明的一个实施例中,采用Sequenom MassArray技术确定rs1800818的多态性 和基因型。所述PCR引物对在序列上没有特殊要求,只要能扩增出包括rs1800818在 内的基因组DNA片段即可,具体可为序列表中SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的单 链DNA。所述单碱基延伸引物具体可为序列表中SEQ ID No.3所示的单链DNA。Sequenom MassArray技术所需要的其他仪器为MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪 (SEQUENOM公司)。Sequenom MassArray技术所需要的芯片为SpectroCHIP(Sequenom) 芯片。所述进行基因分型的软件具体为MALDI-TOF和TYPER 4.0软件(sequenom)。
本发明在一个来自中国人群的样本(430个发热伴血小板减少综合征患者和633 个新布尼亚病毒隐性感染者)中发现rs1800818是与发热伴血小板减少综合征相关的 单核苷酸多态性。可将检测rs1800818的多态性或基因型的物质与其它物质(如检测 其它的与发热伴血小板减少综合征相关的单核苷酸多态性或基因型的物质)联合在一 起制备筛查中国人群中发热伴血小板减少综合征患者的产品。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了 阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1 检测PDGF-B基因rs1800818位点基因型方法的建立
1、基因组DNA的提取
提取待测样品基因组DNA,以其为模板进行基因型检测。
2、引物的设计与合成
使用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design软件设计待 测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物,并交由生物公司合成。检测PDGF-B 基因rs1800818位点基因型的特异性引物对的序列为:正向引物 5’-ACGTTGGATGCCGCAGAGGACGCCCAGAG-3’(序列表中的SEQ ID No.1);反向引物 5’-ACGTTGGATGACAGGTGGACGCGGCGCGA-3’(序列表中的SEQ ID No.2)。用于单 碱基扩增反应的延伸引物序列为5’-ccCGGTCCGTCTGCCCGCC-3’(序列表中的SEQ ID No.3)。
3、检测PDGF-B基因rs1800818位点基因型方法的建立
3.1PCR扩增:PCR扩增在384孔板中进行,每个反应体系总体积为5μL,按 表1配制PCR反应体系。
表1 每个PCR反应体系的组分
PCR反应程序为:94℃4分钟;94℃20秒,56℃30秒,72℃1分钟,45个 循环;72℃3分钟;4℃保持。
3.2PCR产物碱性磷酸酶处理:在PCR反应结束后,将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase,虾碱性磷酸酶)处理,以去除体系中游离的dNTPs,按表 2配制SAP反应体系。
表2 SAP反应体系
反应条件为:37℃40分钟;85℃5分钟;4℃维持。
3.3单碱基延伸:在碱性磷酸酶处理结束后利用10×单碱基延伸反应缓冲液、 单碱基延伸反应酶(1.7U/μl)和SEQ ID No.3所示的单碱基扩增反应的延伸引物进 行单碱基延伸反应。
反应条件为:
I.94℃30秒
II.94℃5秒
III.52℃5秒
IV.80℃5秒
V.回到III,4次循环
VI.回到II,39次循环
VII.72℃3分钟
VII.4℃
3.4树脂纯化:将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中;加16μl水到延 伸产物的对应孔内;将干燥后的树脂倒入延伸产物板中,封膜,低速垂直旋转30 分钟,使树脂与反应物充分接触;离心使树脂沉入孔底部。
3.5芯片点样:启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪(SEQUENOM公 司),将树脂纯化后的延伸产物移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片(SEQUENOM 公司)上。
3.6质谱检测:将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析,检测结果 使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
实施例2 PDGF-B基因rs1800818位点与新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少 综合征易感性的分析
用实施例1建立起来的方法,对中国人群(430例新布尼亚病毒引起的发热伴血 小板减少综合征患者和633例对照)的PDGF-B基因的rs1800818位点基因型进行了分 析。
1、研究对象
病例组:430例新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者,且均符合 新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征患者临床诊断标准并经过新布尼亚 病毒核酸检测确认。
对照组:633例血清检测新布尼亚病毒IgM抗体阴性但新布尼亚病毒IgG抗体 阳性的新布尼亚病毒隐性感染者。
所有研究对象均为无血缘关系的中国汉族人。所有研究对象均签署了知情同意 书,通过结构化的问卷来收集个人的人口统计学资料和病史。本研究得到解放军154 医院伦理委员会的批准。
2、PDGF-B基因rs1800818位点基因型的确定
人群中PDGF-B基因rs1800818位点的基因型和等位的频率分布如表3所示。结果 显示,病例组中A等位的频率为78.3%,G等位的频率为21.7%;对照组中A等位的 频率为92.3%,G等位的频率为7.7%。G等位在病例组中的频率比在对照组中的频 率高,具有统计学差异(P<0.001),表明rs1800818位点的G等位为新布尼亚 病毒引起的发热伴血小板减少综合征的风险等位。
rs1800818位点的三个基因型中,GG和AG基因型的个体在病例组中的比例分 别高于对应基因型在对照组中的比例,AA基因型的个体在病例组中的比例低于对应 基因型在对照组中的比例。与携带AA基因型的个体相比,携带AG和GG基因型的 个体发热伴血小板减少综合征发病风险增加,OR值为3.85[95%置信区间(95% CI)=2.86-5.26;P<0.001]。
结果表明,可以利用rs1800818位点筛查新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减 少综合征患者。
机译: 可以被抗人免疫缺陷病毒(hiv)逆转录病毒诱导的抗体识别的肽及其在诊断由某些病毒引起的感染中的应用,以及在必要时在辅助疫苗接种中的应用
机译: 人类免疫缺陷病毒(hiv)的逆转录病毒特征肽及其在诊断由其中一些病毒引起的感染中的应用,以及在必要时在辅助疫苗接种中的应用
机译: 来自HIV病毒包膜糖蛋白的肽,其在检测由这些病毒引起的感染和预防AIDS疫苗中的应用