一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法

摘要

本发明提供了一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法。该试剂盒为用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6.5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6.5的表达水平评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6.5的基因序列为：SEQID NO:1。临床通过精子的分子标记物长非编码RNA分子LA16c390E6.5能准确的预测胚胎发育的潜能，并对疗效检测与辅助生殖方式的选择有指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于医疗检测技术领域，具体涉及一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法。

背景技术

胚胎质量评估方法的优劣直接关系到辅助生殖临床妊娠结局的好坏。目前，在胚胎质量评估方法中，应用最广泛的是对配子胚胎各时期的形态特征进行评分的形态学评价法。主要通过观察胚胎的发育与碎片化等指标进行评价，缺乏客观的评价指标。

文献“精子RNA的研究进展”（《癌变·畸变·突变》，2011第23卷，第5期）公开了精子RNA在精子的运动、获能、受精和胚胎发育等过程中起着非常重要的作用。精子RNA可以作为衡量精子质量、预测精子受精能力的一个重要指标，同时，能够影响受精后胚胎的发育，对早期胚胎发育起到重要作用。

通过基因芯片等技术，国外文献“Human reproduction update”（Human Reprodtion Update，2013 19(6) 602-24）报导了通过检测精子中的RNA分子检测弱精子症、畸形精子症等精子形态与活动度的异常。目前已知的标记物如PRM1、TSSK6、miRNA-Let-7d等的差异表达可用于区分精子运动异常。尽管精子的转录本中可以检测到近3000个RNA分子，然而，目前还没有通过芯片筛选找到可靠的基因指标，是否有单个RNA分子可以作为胚胎发育的指标仍然不清楚，还不能从精子RNA中找到表达具体的RNA分子并证实其对胚胎发育的作用。

发明内容

针对现有的辅助生殖技术对胚胎发育缺乏客观评价指标的问题，本发明提供了一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法。临床通过精子的分子标记物长非编码RNA分子LA16c390E6.5（Ensembl数据库，基因登录号：ENSG00000261641）能准确的预测胚胎发育的潜能，并对疗效检测与辅助生殖方式的选择有指导意义。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案：

一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法，其特征在于：用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6.5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6.5的表达水平评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6.5的基因序列为：SEQID NO:1。

本发明通过在原因不明的胚胎发育停止的精子样本中通过长非编码RNA与mRNA的芯片，筛选出在胚胎发育停止的精子样本中差异表达的一个精子表达的长非编码RNA－LA16c390E6.5。在收集的胚胎质量低下的精子样本中通过检测LA16c390E6.5表达量，证实其可以有效的预测第三代试管婴儿产生的胚胎的优质胚胎的百分比。

    本发明所述的试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBR Green试剂和LA16c390E6.5特异性引物探针。

本发明所述的阳性对照品为正常精子样本的阳性RNA提取的cDNA。

优选地，所述LA16c390E6.5的特异性引物探针，

上游引物为（SEQID NO:2）：CTCAACATCACAGCACAGGG；

下游引物为（SEQID NO:3）：AGCTGCTTGGCCTCATTTTC。

上述引物为特异的针对LA16c390E6.5的荧光探针，通过荧光定量PCR的原理，特异的扩增出针对该长非编码RNA的相对于管家基因（actin）的相对表达量。

本发明所述的胚胎发育质量评估试剂盒的使用方法，步骤如下：

A、RNA提取：采用RNA抽提试剂提取精液样本中的RNA；

B、荧光定量PCR：对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，采用SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR分析，检测受试样本与对照品的Ct值；

C、结果分析：将检测值采用2-??Ct 方法换算成相对表达量。

本发明通过基因表达芯片和长非编码芯片（ArrayStar 长非编码基因芯片系统），筛选出在正常胚胎与低质量胚胎的男性精子样本中差异表达最显著的长非编码RNA分子LA16c390E6.5，并通过扩大样本得到了验证。有益效果在于：

1、目前的胚胎质量评估方法无法做到定量地对胚胎发育进行客观评价，本发明试剂盒从精子的非编码RNA的表达量入手，检测所需的样本量少，速度快，时间短，对预测胚胎的发育潜能的特异性高，检测方法标准化，易于临床推广。

2、本发明首次提出精子长非编码RNA LA16c390E6.5作为预测导致不明原因胚胎停滞发育的男性不育患者的检测指标，并通过临床样本予以进一步的证实，为临床诊断和治疗原因不明的胚胎发育停止提供明确的依据。

3、对于精子中长非编码RNA LA16c390E6.5指标检测异常的男性病人，可以通过治疗与干预后，通过检测该指标的变化指导是否适合做辅助生殖技术的周期。

附图说明

图1为胚胎发育质量高和低的精子样本分别经试剂盒检测得到的长非编码RNA分子LA16c390E6.5相对表达量的分布图。

其中，ctl为高胚胎质量组，p为低胚胎质量组。

图2为精子长非编码RNA LA16c390E6.5 的表达变化与胚胎质量的生存曲线的分析结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的实质性内容作进一步详细的描述。

实施例1

一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6.5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6.5的表达水平评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6.5的基因序列为：SEQID NO:1。

实施例2

一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6.5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6.5的表达水平评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6.5的基因序列为：SEQID NO:1。

试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBR Green试剂和LA16c390E6.5特异性引物探针。

实施例3

一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6.5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6.5的表达水平评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6.5的基因序列为：SEQID NO:1。

试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBR Green试剂和LA16c390E6.5特异性引物探针。

所述的阳性对照品为正常精子样本的RNA提取的cDNA。

实施例4

一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒，用于测定精子长非编码RNA分子LA16c390E6.5的不同表达水平的生物标志物检测试剂，通过LA16c390E6.5的表达水平评估胚胎发育质量；所述LA16c390E6.5的基因序列为：SEQID NO:1。

试剂盒包括阳性对照品、反转录体系、荧光定量PCR反应体系、SYBR Green试剂和LA16c390E6.5特异性引物探针。

所述的阳性对照品为正常精子样本的RNA提取的cDNA。

所述LA16c390E6.5的特异性引物探针，

上游引物为：CTCAACATCACAGCACAGGG；

下游引物为：AGCTGCTTGGCCTCATTTTC。

实施例5

本发明所述的胚胎发育质量评估试剂盒的使用方法，步骤如下：

A、RNA提取：采用RNA抽提试剂提取精液样本中的RNA；

B、荧光定量PCR：对提取到的RNA进行反转录成cDNA，取cDNA为模板，采用SYBR Green染料法进行实时荧光定量PCR分析，检测受试样本与对照品的Ct值；

C、结果分析：将检测值采用2-??Ct 方法换算成相对表达量。

具体实验操作如下：

1、RNA提取：把3ml精液样本收集到15ml离心管中，加入5mlPBS，1000g，5min洗涤两次，弃上清，收集沉淀，加入1ml Trizol Reagent（life technologies，REF15596026）提取RNA。

2、反转录：反转录体系采用的引物来自于PrimeScript RT Reagent kit(TAKARA，RR037A)。

按表1顺序配制反转录反应体系

表1

试剂体积/用量5×Prime Script buffer2ulPrimeScript RT Enzyme mixI0.5ulOligo dt primer0.5ulRandom 6 mers0.5ulRNA 500ngRANfree H₂OUp to 10ul

37℃ 反应15min，85℃ 反应5s，4℃ 保存。

3、荧光定量PCR：采用SYBR Green染料法检测受试样本与阳性对照品中miR-15b的表达，PCR扩增反应体系的引物为本发明LA16c390E6.5的特异性引物。SYBR Green试剂来自于life technologies，REF4472897。

按表2配制PCR反应体系

表2

试剂体积/用量SYBR Green mix5ulRT product3ulPrimer(forward and reverse)2ul

50℃ 反应2min，（95℃ 反应10min，95℃ 反应15s ，60℃ 反应60s ）40cycles，检测受试样本与阳性对照品的Ct值，并采用2-??Ct 方法换算成相对表达量。

临床实验

在临床实验中，按胚胎发育的质量分为高质量与低质量组，高胚胎质量组12例（即正常生育者），低胚胎质量组14例。

胚胎质量评分参考1999年Gardner对囊胚的评分标准 （Gardner DK，Sakkas D. Assessment of embryo viability: the ability to select a single embryo for transfer-a review.Placetna，2003 24(suppl B):S5）。

优质胚胎是指：加精后或ICSI后66－68小时卵裂期胚胎的观察：a. 卵裂期数目大于或等于8个；b. 碎片小于20％；c.没有多核的卵裂球；加精后或ICSI后106－108小时囊胚期胚胎的观察：a. 囊腔扩张充满；b.内细胞团致密，细胞数多；c:滋养层细胞数目多。

达不到以上标准则为低质量胚胎。

本发明分别对胚胎高质量与低质量组的男方精液参数进行了统计分析，表3的结果显示低质量组的精液体积和A级运动精子的均值与高质量组相比有显著差异（P<0，001），说明男性弱精子症是可能的影响胚胎质量的因素之一。

表3：正常生育与低质量胚胎病人的精液参数

进一步地，通过本发明试剂盒分别检测胚胎高质量与低质量组的男方精子中长非编码RNA分子LA16c390E6.5的Ct值，并采用2-??Ct 方法换算成相对表达量。目的基因（LA16c390E6.5）－Ct内参基因(β-actin)。

图1显示胚胎发育低质量组的精子LA16c390E6.5基因的表达量相对于高质量组的表达量明显下降，胚胎发育指标通过检测LA16c390E6.5的相对表达量予以了证实。

通过相对表达量的比值，以高质量组的平均值为1，利用ABI－7500分析软件计算出低质量组相对于高质量组的平均值为1的相对表达量，以相对表达量0.3726为临界值，低于该临界值的即为异常的表达量。

利用Graphpad Prism 5统计软件进行生存曲线分析，采用临界值（0.3726）绘制生存曲线，得到应用该分子靶标的相对表达量对于预测胚胎发育质量的效果图（见图2）。得出本试剂盒的敏感性与特异性分别为100%与100%，具有良好的检测效能（敏感性是指胚胎发育差的受试者的LA16c390E6.5相对表达量低于临界值的比例；特异性是指胚胎发育正常的受试者LA16c390E6.5相对表达量高于临界值的比例）。

序列表

 

<110>  四川大学华西第二医院

 

<120>  一种用于胚胎发育质量评估的试剂盒和使用方法

 

<130>  2015

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1124

<212>  RNA

<213>  LA16c390E6.5

 

<400>  1

tgagaggatt tctttatttc gcgttcagac ccaacacact cggacacctt ggggccctgt     60

 

gagggctaag cagggtggtg gcgtcagctc ccggggaggc cccactccct ggggaggaaa    120

 

tacacggcag ggggccgcac ccagcccccc acggagggac ccgtgttgct ctaacaggga    180

 

cactgaagtt gcctctgccg ccccgtgagg ggcctgtggc ggccccagac ccagcccagc    240

 

caggccagag gagcctccca ggggccctca ggtggtgagg tgggggcttc ccggccccgg    300

 

tgcccaccgg cccttctagc tgcctgtgct gggccaggtg tcctctgagg ccggcaggag    360

 

tctggccccc gctgcacctg cgcttggtgg ctggcagggg cggggtaggg aggtcaccct    420

 

cgaggccggg gtccccatgt gctaggggaa gacctgcctt cccagccagt gtccacaggg    480

 

cagcaattcc acgctctgag gctcagggac caaggcaggg ctgggcatgg ggctcagggc    540

 

cttggaggtt tttctcagct ctcaacatca cagcacaggg cccgtgagtc accccagtcc    600

 

tctgggcctg tgtacccaag ccggatgcag gccggggagt gcacgtgggg ctcctctgtg    660

 

gcgccagtgt gaagctgctc tccggggcgg tcgcagcctc caaaccctgg tgctacgagt    720

 

ccgtgcctca ggcccaggga ccacaggccg tctgctcatg gctgaaaatg aggccaagca    780

 

gctcccaagt ctcgaagact ccactggtgt ggaggcagag gggcccttcc agggcagggc    840

 

agccctcggg gcagcagcag gggcaagggc tctgtctcac gcacacgggc acaggcacgc    900

 

aggtgccggc cctgccgctg gctcccaaga ggccgatagc ccggtaggga ggtcacacac    960

 

acacagctga tccctggagg taaagaaacc tagacgagga gagtggaggc tgggcctgcg   1020

 

caaggaggcg ccaagggggg agaccactgc ccacaacagg gtcagtcccg cgagagggtc   1080

 

agttccgcgc ctgccgcctg cccgcccagc tgcagggtgc tcgc                    1124

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  特异性上游引物

 

<400>  2

ctcaacatca cagcacaggg                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  20

<212>  DNA

<213>  特异性下游引物

 

<400>  3

agctgcttgg cctcattttc                                                 20