一种检测口含烟制品细胞毒性的试验方法

摘要

本发明提供一种检测口含烟制品细胞毒性的试验方法，经过样品前处理、单细胞悬液的制备、细胞浓度计算、细胞接种、加入受试物、孵育受试物、染料孵育、测定吸光值、计算细胞抑制率、计算半数细胞致死剂量等步骤。本发明综合考察口含烟制品的暴露途径、作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法，根据口含烟制品作用靶细胞选取了人口腔粘膜成纤维细胞hOMF作为口含烟制品细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合口含烟制品的细胞毒性试验检测方法。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测口含烟制品细胞毒性的试验方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域。

背景技术

细胞相对增殖率（relative growth rate，RGR）是细胞毒性评价的关键指标，在新药的开发、医疗器械的安全性评价中常用于细胞毒性的分级^[1，2]。中性红法和噻唑蓝法（MTT）具有简便、快捷、灵敏等特点，是目前应用较多的两种毒理学检测细胞毒性的方法。国际烟草科学研究合作中心CORESTA组织于2002年成立了卷烟烟气体外毒理测试工作组，经过工作组大量的文献调研及研究工作，该工作组推荐采用中性红细胞毒性试验对卷烟烟气冷凝物潜在的细胞毒性进行检测，该检测方法目前已经被国内外烟草公司广泛采用。

烟草监管立法的日趋严格以及吸烟与健康研究的深入，导致了烟草公司寻求风险更低、无环境烟气的新型烟草制品。口含烟制品避免了传统卷烟制品燃烧所产生的复杂混合物所带来的危害，现阶段已成为国外烟草公司从传统卷烟制品转向的新方向之一。根据产品的组分及形态特点，口含烟制品分为传统含烟叶原料的Snus型口含烟制品和不含烟叶原料的新型口含烟制品（如烟草含片）。口含烟制品的使用方式与传统卷烟吸入式不同，口含烟制品直接经口使用，且其溶出物会随唾液进入消化系统，使用过程中不产生烟气，其暴露途径显著有别于传统卷烟，检测对象的改变导致样品前处理方法、检测用细胞、检测剂量也有所不同，用于检测传统卷烟细胞毒性的细胞毒性试验不能满足口含烟制品细胞毒性检测的需要，且目前国内外研究机构及烟草公司尚未制定口含烟制品细胞毒性试验检测的标准方法[3-5]，因此，有必要针对口含制品自身特点建立适合口含烟制品的细胞毒性试验检测方法，确保产品的安全性。

上文涉及的参考文献：

[1] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. GB 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法[S].

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[3]夭建华，陈辉敏，方力，等.国内外卷烟危害性评价方法现状和发展趋势[J].烟草科技，2007，1:50-53.

[4] Coggins CR, Ballantyne M, Curvall M.et al.The in vitro toxicology of Swedish snus[J]. Crit Rev Toxicol. 2012 Apr;42(4):304-13.

[5] JAI T.S, DELVES  S.J, FAUX S.P, et al. Use of an EpiOral^TM human tissue model for testing of substances for oral irritancy in vitro[C].2008,COREST。

发明内容

本发明的目的是为评价口含烟制品的安全性，提供一种检测口含烟制品细胞毒性的试验方法，在传统卷烟制品细胞毒性试验方法的基础上改进得到的一种适合于口含烟制品细胞毒性检测的试验方法。

本发明通过下列技术方案实现：一种检测口含烟制品细胞毒性的试验方法，经过下列各步骤：

（1）样品前处理方法：准确称取1.0g口含烟制品，加入30mL无血清培养基，于37℃下恒温水浴锅中静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；

（2）单细胞悬液的制备：将人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1～2mL浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，再加入DMEM/F12细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

（3）单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

（4）细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至1.0～1.5×10⁵个/mL，再按接种量为200μL/孔，接种到96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱内培养24h；

（5）受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；空白对照组和细胞对照组加DMEM/F12细胞培养基；阳性对照组加1400μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；检测样品组加不同剂量的步骤（1）所得待测液；

（6）剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置9个非零剂量：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL、1200μg/mL、1400μg/mL；

（7）加入受试物：移除步骤（4）中96孔细胞培养板内的培养基，再按步骤（5）进行分组，在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加1400μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入步骤（1）所得待测液，使终浓度分别为步骤（6）设定的剂量；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；

（8）孵育受试物：将步骤（7）加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中孵育24h；

（9）染料孵育：

方案1采用中性红法：在步骤（8）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组去除细胞培养基，加入浓度为100μg/mL的中性红溶液200μL/孔，再置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中孵育4h后移除中性红溶液，加入浓度为1%（v/v）的甲醛溶液200μL/孔固定1min后移除甲醛溶液，加入中性红萃取液200μL/孔，置于微板振荡器内振荡10min；

或者，方案2采用MTT法：在步骤（8）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组中加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL/孔，再置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中孵育4h后移除96孔培养板中溶液，加入DMSO溶液200μL/孔，置于微板振荡器内振荡10min；

（10）测定吸光值：将步骤（9）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在540nm（中性红法）或490nm（MTT法）波长下检测吸光值；

（11）计算细胞抑制率：根据步骤（10）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：

式中：

X——细胞抑制率；

OD_n——步骤（10）所得检测样品组多孔平均的吸光值；

OD_o——步骤（10）所得空白对照组多孔平均的吸光值；

OD_c——步骤（10）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；

（12）计算半数细胞致死剂量（IC₅₀）：根据9个非零剂量对应的细胞抑制率绘制曲线，再进而计算IC₅₀。

所述步骤（1）的无血清培养基为市购产品。

所述步骤（2）中汇合率是通过倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况。

所述步骤（5）中的空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组均做8孔平行，为了避免边缘效应，数据统计时去除边缘2孔采用中间6孔的数据。

所述步骤（9）的中性红萃取液于使用当天配制，是使用无水乙醇、冰醋酸和无菌去离子水按体积比50:1:49的混合液进行配制。

所述步骤（12）的IC₅₀通过SPSS软件计算。

本发明方法与现有技术方法相比，优点在于：综合考察口含烟制品的暴露途径、作用方式，建立了口含烟制品样品前处理方法，根据口含烟制品作用靶细胞选取了人口腔粘膜成纤维细胞hOMF作为口含烟制品细胞毒性试验检测用细胞，并确定了样品检测剂量，形成了适合口含烟制品的细胞毒性试验检测方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测口含烟制品的细胞毒性。

具体实施方式

下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。

实施例1

用于骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品细胞毒性的检测。

（1）样品前处理方法：准确称取1.0g骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品，加入30mL市购无血清培养基，于37℃下恒温水浴锅中静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；

（2）单细胞悬液的制备：将人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中培养，通过倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率为90%时移除培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1～2mL浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，再加入DMEM/F12细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

（3）单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

（4）细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至1.0～1.5×10⁵个/mL，再按接种量为200μL/孔，接种到96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱内培养24h；

（5）受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；空白对照组和细胞对照组加DMEM/F12细胞培养基；阳性对照组加1400μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；检测样品组加不同剂量的步骤（1）所得待测液；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组均做8孔平行，为了避免边缘效应，数据统计时去除边缘2孔采用中间6孔的数据；

（6）剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置9个非零剂量：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL、1200μg/mL、1400μg/mL；

（7）加入受试物：移除步骤（4）中96孔细胞培养板内的培养基，再按步骤（5）进行分组，在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加1400μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入步骤（1）所得待测液，使终浓度分别为步骤（6）设定的剂量；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；

（8）孵育受试物：将步骤（7）加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中孵育24h；

（9）染料孵育：

采用中性红法：在步骤（8）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组去除细胞培养基，加入浓度为100μg/mL的中性红溶液200μL/孔，再置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中孵育4h后移除中性红溶液，加入浓度为1%（v/v）的甲醛溶液200μL/孔固定1min后移除甲醛溶液，加入中性红萃取液200μL/孔（当天配制，使用无水乙醇、冰醋酸和无菌去离子水按体积比50:1:49的混合液进行配制），置于微板振荡器内振荡10min；

（10）测定吸光值：将步骤（9）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在540nm波长下检测吸光值；

（11）计算细胞抑制率：根据步骤（10）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：

式中：

X——细胞抑制率；

OD_n——步骤（10）所得检测样品组多孔平均的吸光值；

OD_o——步骤（10）所得空白对照组多孔平均的吸光值；

OD_c——步骤（10）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；

（12）计算半数细胞致死剂量（IC₅₀）：根据9个非零剂量对应的细胞抑制率绘制曲线，再进而计算IC₅₀，见表1。

实施例2

用于骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品细胞毒性的检测。

（1）样品前处理方法：准确称取1.0g骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品，加入30mL市购无血清培养基，于37℃下恒温水浴锅中静置24h进行萃取，萃取后先用定性滤纸进行初滤除渣处理，再用0.45μm有机滤膜过滤除菌，得到待测液；

（2）单细胞悬液的制备：将人口腔粘膜成纤维细胞hOMF细胞于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中培养，通过倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞汇合率为80%时移除培养基，用磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入1～2mL浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，再加入DMEM/F12细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；

（3）单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

（4）细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用DMEM/F12细胞培养基稀释至1.0～1.5×10⁵个/mL，再按接种量为200μL/孔，接种到96孔细胞培养板中，将96孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱内培养24h；

（5）受试物分为四组：空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组；空白对照组和细胞对照组加DMEM/F12细胞培养基；阳性对照组加1400μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；检测样品组加不同剂量的步骤（1）所得待测液；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组均做8孔平行，为了避免边缘效应，数据统计时去除边缘2孔采用中间6孔的数据；

（6）剂量设定：以样品烟碱量作为检测剂量划分指标，设置9个非零剂量：50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL、1200μg/mL、1400μg/mL；

（7）加入受试物：移除步骤（4）中96孔细胞培养板内的培养基，再按步骤（5）进行分组，在空白对照组和细胞对照组相应的孔内加入DMEM/F12细胞培养基；在阳性对照组相应的孔内加1400μg/mL的十二烷基硫酸钠溶液；在检测样品组相应的孔内加入步骤（1）所得待测液，使终浓度分别为步骤（6）设定的剂量；空白对照组、细胞对照组、阳性对照组和检测样品组的终体积为200μl/孔；

（8）孵育受试物：将步骤（7）加样后的96孔细胞培养板置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中孵育24h；

（9）染料孵育：

采用MTT法：在步骤（8）孵育后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组中加入浓度为5mg/mL的MTT溶液20μL/孔，再置于37℃、5%CO₂、95%RH（空气相对湿度）培养箱中孵育4h后移除96孔培养板中溶液，加入DMSO溶液200μL/孔，置于微板振荡器内振荡10min；

（10）测定吸光值：将步骤（9）处理后的检测样品组、空白对照组、细胞对照组和阳性对照组，用酶标仪在490nm波长下检测吸光值；

（11）计算细胞抑制率：根据步骤（10）所得吸光值，按照下列公式计算细胞抑制率：

式中：

X——细胞抑制率；

OD_n——步骤（10）所得检测样品组多孔平均的吸光值；

OD_o——步骤（10）所得空白对照组多孔平均的吸光值；

OD_c——步骤（10）所得细胞对照组多孔平均的吸光值；

（12）计算半数细胞致死剂量（IC₅₀）：根据9个非零剂量对应的细胞抑制率绘制曲线，再进而计算IC₅₀，见表1。

经过改进样品前处理方法、检测用细胞、检测剂量后对骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品的细胞毒性进行了检测，结果见表1：

表1 骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品细胞毒性试验检测结果

由上表结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测用细胞、检测剂量条件下，骆驼（Camel）品牌薄荷口味Snus型口含烟制品细胞抑制率与检测剂量间具有剂量效应关系，阳性对照细胞抑制率大于90%，证明本次试验体系正常，检测数据有效。中性红法和MTT法均能用于口含烟制品的细胞毒性检测。