用于诊断戊型肝炎病毒感染的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了，用于诊断受试者是否感染了戊型肝炎病毒(HEV)，或是否患有戊型肝炎的方法，其包括：(1)测定来自所述受试者的尿液样品中戊型肝炎病毒抗原(HEV-Ag)的存在；和(2)确定所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊型肝炎；其中，HEV-Ag在所述受试者的尿液样品中的存在表示，受试者感染了HEV或者患有戊型肝炎；以及用于所述方法的试剂盒。此外，本发明还公开了用于筛选能够抗戊型肝炎病毒感染或治疗戊型肝炎的候选药物的方法，以及用于所述方法的试剂盒。

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域、病毒学领域和免疫学领域，特别是免疫学 诊断领域。具体而言，本发明公开了，用于诊断受试者是否感染了戊 型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)，或是否患有戊型肝炎的方法， 其包括：(1)测定来自所述受试者的尿液样品中戊型肝炎病毒抗原 (HEV-Ag)的存在；和(2)确定所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊 型肝炎；其中，HEV-Ag在所述受试者的尿液样品中的存在表示，受试 者感染了HEV或者患有戊型肝炎；以及用于所述方法的试剂盒。此外， 本发明还公开了用于筛选能够抗戊型肝炎病毒感染或治疗戊型肝炎的 候选药物的方法，以及用于所述方法的试剂盒。

背景技术

戊型肝炎(Hepatitis E)主要通过粪-口途径传播，但也可通过污 染的食物、水源引起散发或暴发流行。世界卫生组织2012年7月提供 的数据显示，全世界每年约有2000万人感染戊型肝炎。戊型肝炎已经 成为流行最普遍的病毒性肝炎之一。

戊型肝炎主要由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)引起。 戊型肝炎病毒为单股正链RNA病毒，其病毒颗粒呈球形，直径27-34nm， 无囊膜，核衣壳呈二十面体立体对称。HEV基因组长7.6kb，其3'端 有poly A尾，包含三个开放阅读读框(ORF)；其中，ORF1位于5'端(约 2kb)，为非结构蛋白基因，包含依赖RNA的RNA多聚酶序列；ORF2位 于3'端(约2kb)，为结构蛋白的主要部分，编码核衣壳蛋白；ORF3与 ORF1和ORF2有重叠(全长369bp)，为病毒结构蛋白基因，可编码病毒 特异性免疫反应抗原。

戊型肝炎病毒在感染人和动物后，在体内复制、增殖，形成病毒 血症。因此，通过检测血液(血清或血浆)中的戊型肝炎病毒核酸(HEV  RNA)或戊型肝炎病毒抗原(HEV-Ag)的存在，可以判断受试者是否感染 了HEV。目前临床急性、慢性肝炎的诊断，献血员中HEV携带者的筛 选，以及科学研究中有关人和动物HEV感染情况的调查，主要基于以 下方法：通过RT-PCR检测血清中的HEV RNA或通过ELISA检测血清中 的HEV-Ag。

然而，RT-PCR检测法的实验操作复杂、所需的实验仪器设备昂贵， 对样本的采集和保存条件要求高，并且其实验结果不稳定，易出现假 阳性或假阴性，这大大限制了其应用。ELISA检测法的实验操作简单， 但血清中抗HEV抗体(HEV-Ab)的存在影响着HEV-Ag的检测，这使得 ELISA检测法的灵敏度降低。此外，由于在HEV感染的不同阶段，血 清中HEV-Ab的水平在不断发生变化，因此，HEV-Ab对ELISA检测法 的影响也在不断发生改变，这使得ELISA检测法的检测结果不稳定。

因此，本领域需要开发操作简单、灵敏度高、并且检测结果稳定 的检测HEV感染的方法。

发明内容

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词 具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的核酸化 学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同 时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文中所使用的，术语“戊型肝炎病毒抗原”(其在本文中简称 为HEV Ag或HEV-Ag)是指，由HEV表达的具有抗原性的蛋白。如本领 域技术人员已知的，HEV基因组长7.6kb，包含3个开放阅读读框(ORF)； 其中，ORF1主要编码非结构蛋白，ORF2主要编码核衣壳蛋白，ORF3 主要编码病毒结构蛋白。因此，HEV表达的抗原蛋白主要由HEV的ORF2 和ORF3编码。因此，在本申请中，戊型肝炎病毒抗原包括，HEV ORF2 编码的抗原蛋白和/或HEV ORF3编码的抗原蛋白。HEV ORF2和ORF3 的完整基因序列可从各种公共数据库(例如NCBI)获得，参见例如 AJ272108、JQ655736、AB177373、KJ001824、JN995570等。根据这些 已知的基因序列，可容易地确定HEV ORF2和ORF3编码的抗原蛋白。 另外，有关HEV的ORF2和ORF3及其编码的蛋白的信息，还可参见例 如Khudyakov Y E,Khudyakova N S,Fields H A,et al.Epitope  mapping in proteins of hepatitis E virus[J].Virology,1993, 194(1):89-96；Yarbough P O,Tam A W,Fry K E,et al.Hepatitis  E virus:identification of type-common epitopes[J].Journal  of virology,1991,65(11):5790-7；Ahmad I,Holla R P,Jameel  S.Molecular virology of hepatitis E virus[J].Virus research, 2011,161(1):47-58；Khudyakov Y E,Favorov M O,Khudyakova N  S,et al.Artificial mosaic protein containing antigenic  epitopes of hepatitis E virus[J].Journal of virology,1994, 68(11):7067-74；和Ulanova T I,Obriadina A P,Talekar G,et  al.A new artificial antigen of the hepatitis E virus[J]. Journal of immunoassay&immunochemistry,2009,30(1):18-39。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，通常由两对多肽链(每对 具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗 体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并 且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和 重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接， 重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区 (V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域(C_H1、C_H2和C_H3) 组成。各轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。轻链恒定区由 一个结构域C_L组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因 子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第 一组分(C1q)的结合。V_H和V_L区还可被细分为具有高变性的区域(称为 互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各 V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨 基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的 可变区(V_H和V_L)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的 分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))， 或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia 等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特 定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克 隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例 如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM 抗体。

如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指全长抗体 的一个或多个部分，所述部分保持结合抗体所结合的相同抗原(例如， HEV-Ag)的能力，与完整抗体竞争对抗原的特异性结合。通常参见， Fundamental Immunology,Ch.7Paul,W.,ed.，第2版，Raven Press, N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通 过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗原结合片段。 在一些情况下，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fd、Fv、dAb 和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如，scFv)、嵌合抗体、双抗体 (diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性结合抗原能力的 抗体的至少一部分。

如本文中所使用的，术语“Fd片段”意指由V_H和C_H1结构域组成 的抗体片段；术语“Fv片段”意指由抗体的单臂的V_L和V_H结构域组成 的抗体片段；术语“dAb片段”意指由V_H结构域组成的抗体片段(Ward 等人,Nature 341:544-546(1989))；术语“Fab片段”意指由V_L、 V_H、C_L和C_H1结构域组成的抗体片段；术语“F(ab')₂片段”意指包含 通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的抗体片段。

在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链抗体(例如,scFv)， 其中V_L和V_H结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成 单价分子(参见，例如,Bird等人,Science 242:423-426(1988)和 Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883(1988))。 此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-V_L-接头-V_H-COOH或NH₂-V_H-接头 -V_L-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体 组成。例如，可使用具有氨基酸序列(GGGGS)₄的接头，但也可使用其 变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90: 6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)， Protein Eng.8:725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31: 94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56:3055-3061，Kipriyanov 等人(1999)，J.Mol.Biol.293:41-56和Roovers等人(2001)，Cancer  Immunol.描述。

在一些情况下，抗体是双抗体，即，双价抗体，其中V_H和V_L结构 域在单个多肽链上表达，但使用太短的连接体以致不允许在相同链的 两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一条链的互补结构域配对 并且产生两个抗原结合部位(参见，例如,Holliger P.等人,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)，和Poljak R.J.等人, Structure 2:1121-1123(1994))。

可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶 促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如，上述 抗体片段)，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗 体的抗原结合片段。

如本文中所使用的，术语“免疫学测定”是指，利用抗原-抗体之 间的特异性相互作用/结合亲和力来进行的测定，其一般可用于检测特 定抗原或者抗体在样品中的存在或水平。此类免疫学测定是本领域技 术人员公知的，包括但不限于，ELISA测定，Western印迹，表面等离 子共振法，Elispot测定等。关于免疫学测定的详细描述，可参见例 如，Fundamental Immunology,Ch.7Paul,W.,ed.，第2版，Raven  Press,N.Y.(1989)。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机 的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式 中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指， 抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M 或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。

如本文中所使用的，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解 离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常 数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常， 抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M 或10^-10M或更小的解离平衡常数(K_D)结合抗原，例如，如使用表面等 离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。

如本文中所使用的，术语“受试者”包括但不限于各种动物，特 别是哺乳动物，例如人。

如本文中所使用的，术语“尿液样品”是指，含有获自受试者的 尿液或其级分的样品。尿液样品可以包含或者是直接获自受试者的尿 液(或其级分)，也可以包含或者是经处理的尿液(例如，经分离的尿液 级分)，并且可任选地包含其他组分，例如缓冲液，抗凝剂，稀释液等。

如本文中所使用的，术语“能够测定HEV-Ag的存在或其水平的试 剂”是指，能够以定量或半定量方式确定样品中HEV-Ag的水平的试剂。 通常而言，特别优选的是，此类试剂能够通过免疫学测定来确定样品 中HEV-Ag的水平。免疫学测定的使用是特别有利的，因为其利用了抗 原-抗体之间的特异性相互作用/结合亲和力。因此，只要试剂保留了 与HEV-Ag特异性结合的反应性，那么该试剂即可以通过免疫学测定来 确定样品中HEV-Ag的水平(也即，该试剂即可用作能够测定HEV-Ag 的存在或其水平的试剂)。保留与HEV-Ag特异性结合的反应性的各种 试剂是本领域技术人员容易想到并且可容易获得的，其包括但不限于， 抗HEV-Ag的抗体或其抗原结合片段，例如抗HEV-Ag的多克隆抗体或 单克隆抗体，例如IgG抗体或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语“模型动物”是指用于实验的、模拟疾 病状况(例如戊型肝炎)的动物，其通常是非人哺乳动物，例如，小鼠， 大鼠，兔，灵长类动物。本领域技术人员可根据实验的具体需要，选 择各种合适的模型动物。

如本文中所使用的，术语“用于预处理尿液的试剂”是指，用于 处理尿液以减少、降低或避免尿液中的杂质(例如含氮废物(尿素、尿 酸)、电解质、毒素、色素、激素)、pH值或微生物对后续测定(例如 免疫学测定)的不利影响的试剂。此类试剂对尿液样品的预处理将有助 于提高后续测定(例如免疫学测定)的灵敏度、特异性、稳定性，减少 假阳性和假阴性结果的出现。此类试剂包括但不限于，用于稀释尿液 的稀释剂(例如水或缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，柠檬酸盐缓冲液)； 用于从尿液中提取蛋白质的提取试剂(例如三氯乙酸、丙酮)；用于去 除尿素和/或尿酸的试剂(例如异丁醛、镁盐和磷酸盐)；用于杀灭微生 物或抑制微生物在尿液中的生长的试剂(例如杀菌剂，抑菌剂或防腐剂， 例如氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮化钠、甲基氯基异噻唑 啉酮、甲基异噻唑啉酮)；用于稳定尿液中的抗原的试剂(例如，葡萄 糖、动物蛋白例如牛血清白蛋白、小牛血清、明胶)；用于调节尿液表 面张力和/或提高目的蛋白反应性的试剂(例如，表面活性剂，例如吐 温-20、吐温-80、Triton X-100)；用于调节尿液pH值的试剂(例如NaOH， HCl)等等。关于处理尿液的试剂的详细描述，还可参见例如《现代尿 液分析技术与临床》、《影响尿液储存稳定性的常见因素》。

本文中所使用的，术语“抗HEV的药物”是指，能够预防或治疗 HEV感染的药物，包括但不限于，HEV中和性抗体，HEV疫苗(例如治 疗性疫苗)，抗病毒药物(例如α干扰素、白细胞介素-2、核苷类似物 等)。

本申请至少部分基于发明人的下述出人意料的发现：HEV-Ag存于 在感染HEV或患有戊型肝炎的患者的尿液中，并且其在尿液中的变化 趋势与其在血液/血清中的变化趋势基本一致。

特别地，如本领域技术人员通常理解的，在一般情况下，由于肾 脏的过滤功能，血液中的蛋白质不会进入尿液中，而是会被肾小管吸 收并回到血液中。也即，在一般情况下，尿液中基本上不含蛋白质， 或者仅仅含有极微量的蛋白质。与此同时，在本申请之前，本领域中 也从未报道，HEV的抗原蛋白会进入尿液中。因此，在本申请之前， 通常通过检测HEV-Ag、HEV-RNA和/或抗HEV IgM抗体在血液/血清中 的存在来判断HEV感染的存在。

然而，本发明人出人意料地发现，可在感染HEV或患有戊型肝炎 的患者的尿液中检测到HEV-Ag，并且其在尿液中的变化趋势与其在血 液/血清中的变化趋势基本一致。基于这一发现，本发明人首次将尿液 中的HEV-Ag用作诊断标志物，并开发了新的诊断HEV感染或戊型肝炎 的方法。

因此，在一个方面，本发明提供了用于诊断受试者是否感染了戊 型肝炎病毒(HEV)或是否患有戊型肝炎的方法，其包括：

(1)测定来自所述受试者的尿液样品中戊型肝炎病毒抗原(HEV-Ag) 的存在；和

(2)确定所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊型肝炎；

其中，HEV-Ag在所述受试者的尿液样品中的存在表示，受试者感 染了HEV或者患有戊型肝炎。

在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，通过免疫学测定来测定所述尿液样品 中HEV-Ag的存在。在某些优选的实施方案中，所述免疫学测定选自 ELISA测定，Western印迹，表面等离子共振法，Elispot测定。

在某些优选的实施方案中，所述HEV-Ag为HEV的ORF 2和/或ORF 3编码的抗原。

在某些优选的实施方案中，使用抗HEV-Ag的抗体或其抗原结合片 段来测定HEV-Ag的存在，例如通过ELISA来进行测定。

在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为单克隆抗体或 多克隆抗体。在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为IgG 抗体或IgM抗体。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，对来自所述受试者的 尿液样品进行预处理。在某些优选的实施方案中，所述预处理包括下 列中的一项或多项：(a)稀释尿液样品；(b)调整尿液样品的pH值；(c) 从尿液样品中提取蛋白质；(d)去除尿液样品中的尿素、尿酸和/或色 素；和，(e)杀灭微生物或抑制微生物在尿液中的生长。在某些优选的 实施方案中，在步骤(2)之后，给被诊断为感染了HEV或者患有戊型肝 炎的受试者施用抗HEV的药物，以治疗所述受试者的HEV感染或戊型 肝炎。在某些优选的实施方案中，所述抗HEV的药物选自HEV中和性 抗体，HEV疫苗(例如治疗性疫苗)，抗病毒药物(例如α干扰素、白细 胞介素-2、核苷类似物)，以及其任何组合。

在另一个方面，本发明提供了能够测定HEV-Ag的存在或其水平的 第一试剂以及任选的用于预处理尿液的第二试剂用于制备试剂盒的用 途，所述试剂盒用于通过测定来自受试者的尿液样品中HEV-Ag的存在， 而诊断所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊型肝炎。

在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂通过免疫学测定来测定 所述尿液样品中HEV-Ag的存在。在某些优选的实施方案中，所述免疫 学测定选自ELISA测定，Western印迹，表面等离子共振法，Elispot 测定。

在某些优选的实施方案中，所述HEV-Ag为HEV的ORF 2和/或ORF 3编码的抗原。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂包括抗HEV-Ag的抗体或 其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，所述第一试剂通过ELISA 来测定HEV-Ag的存在。

在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为单克隆抗体或 多克隆抗体。在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为IgG 抗体或IgM抗体。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括：(i)用于收集或贮 存来自受试者的尿液样品的装置；(ii)用于进行所述测定所需的其他 试剂(例如缓冲液，稀释液，封闭液，经标记的抗抗体，和/或标准品)； 和/或，(iii)抗HEV的药物。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂包括选自下列的一种或 多种试剂：

用于稀释尿液的稀释剂(例如水或缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，柠 檬酸盐缓冲液)；

用于从尿液中提取蛋白质的提取试剂(例如三氯乙酸、丙酮)；

用于去除尿素和/或尿酸的试剂(例如异丁醛、镁盐和磷酸盐)；

用于杀灭微生物或抑制微生物在尿液中的生长的试剂(例如杀菌 剂，抑菌剂或防腐剂，例如氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮 化钠、甲基氯基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮)；

用于稳定尿液中的抗原的试剂(例如，葡萄糖、动物蛋白例如牛血 清白蛋白、小牛血清、明胶)；和

用于调节尿液表面张力和/或提高目的蛋白反应性的试剂(例如， 表面活性剂，例如吐温-20、吐温-80、Triton X-100)；用于调节尿液 pH值的试剂(例如NaOH，HCl)。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂包括选自下列的一种或 多种试剂：水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三氯乙酸、丙酮、 异丁醛、镁盐、氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮化钠、甲基 氯基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、葡萄糖、牛血清白蛋白、小牛血 清、明胶、吐温-20、吐温-80、Triton X-100、NaOH和HCl。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法 来诊断所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊型肝炎：

(1)使用第一试剂测定来自所述受试者的尿液样品中HEV-Ag的存 在；和

(2)确定所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊型肝炎；

其中，HEV-Ag在所述受试者的尿液样品中的存在表示，受试者感 染了HEV或者患有戊型肝炎。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，使用第二试剂对来自 所述受试者的尿液样品进行预处理。在某些优选的实施方案中，所述 预处理包括下列中的一项或多项：(a)稀释尿液样品；(b)调整尿液样 品的pH值；(c)从尿液样品中提取蛋白质；(d)去除尿液样品中的尿素、 尿酸和/或色素；和，(e)杀灭微生物或抑制微生物在尿液中的生长。 在某些优选的实施方案中，在步骤(2)之后，给被诊断为感染了HEV 或者患有戊型肝炎的受试者施用抗HEV的药物，以治疗所述受试者的 HEV感染或戊型肝炎。

在某些优选的实施方案中，所述抗HEV的药物选自HEV中和性抗 体，HEV疫苗(例如治疗性疫苗)，抗病毒药物(例如α干扰素、白细胞 介素-2、核苷类似物)，以及其任何组合。

在另一个方面，本发明提供了一种用于诊断受试者是否感染了 HEV或是否患有戊型肝炎的试剂盒，其包括：能够测定HEV-Ag的存在 或其水平的第一试剂，和，用于预处理尿液的第二试剂。

任选地，所述试剂盒还包括使用所述试剂盒来测定来自受试者的 尿液样品中HEV-Ag的存在从而诊断所述受试者是否感染了HEV或是否 患有戊型肝炎的说明书。

在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂通过免疫学测定来测定 所述尿液样品中HEV-Ag的存在。在某些优选的实施方案中，所述免疫 学测定选自ELISA测定，Western印迹，表面等离子共振法，Elispot 测定。

在某些优选的实施方案中，所述HEV-Ag为HEV的ORF 2和/或ORF  3编码的抗原。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂包括抗HEV-Ag的抗体或 其抗原结合片段。在某些优选的实施方案中，所述第一试剂通过ELISA 来测定HEV-Ag的存在。

在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为单克隆抗体或 多克隆抗体。在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为IgG 抗体或IgM抗体。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括：(i)用于收集或贮 存来自受试者的尿液样品的装置；(ii)用于进行所述测定所需的其他 试剂(例如缓冲液，稀释液，封闭液，经标记的抗抗体，和/或标准品)； 和/或，(iii)抗HEV的药物。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂包括选自下列的一种或 多种试剂：

用于稀释尿液的稀释剂(例如水或缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，柠 檬酸盐缓冲液)；

用于从尿液中提取蛋白质的提取试剂(例如三氯乙酸、丙酮)；

用于去除尿素和/或尿酸的试剂(例如异丁醛、镁盐和磷酸盐)；

用于杀灭微生物或抑制微生物在尿液中的生长的试剂(例如杀菌 剂，抑菌剂或防腐剂，例如氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮 化钠、甲基氯基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮)；

用于稳定尿液中的抗原的试剂(例如，葡萄糖、动物蛋白例如牛血 清白蛋白、小牛血清、明胶)；和

用于调节尿液表面张力和/或提高目的蛋白反应性的试剂(例如， 表面活性剂，例如吐温-20、吐温-80、Triton X-100)；用于调节尿液 pH值的试剂(例如NaOH，HCl)。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂包括选自下列的一种或 多种试剂：水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三氯乙酸、丙酮、 异丁醛、镁盐、氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮化钠、甲基 氯基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、葡萄糖、牛血清白蛋白、小牛血 清、明胶、吐温-20、吐温-80、Triton X-100、NaOH和HCl。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法 来诊断所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊型肝炎：

(1)使用第一试剂测定来自所述受试者的尿液样品中HEV-Ag的存 在；和

(2)确定所述受试者是否感染了HEV或是否患有戊型肝炎；

其中，HEV-Ag在所述受试者的尿液样品中的存在表示，受试者感 染了HEV或者患有戊型肝炎。

在某些优选的实施方案中，在步骤(1)之前，使用所述第二试剂对 来自所述受试者的尿液样品进行预处理。在某些优选的实施方案中， 所述预处理包括下列中的一项或多项：(a)稀释尿液样品；(b)调整尿 液样品的pH值；(c)从尿液样品中提取蛋白质；(d)去除尿液样品中的 尿素、尿酸和/或色素；和，(e)杀灭微生物或抑制微生物在尿液中的 生长。在某些优选的实施方案中，在步骤(2)之后，给被诊断为感染了 HEV或者患有戊型肝炎的受试者施用抗HEV的药物，以治疗所述受试 者的HEV感染或戊型肝炎。

在某些优选的实施方案中，所述抗HEV的药物选自HEV中和性抗 体，HEV疫苗(例如治疗性疫苗)，抗病毒药物(例如α干扰素、白细胞 介素-2、核苷类似物)，以及其任何组合。

在另一个方面，本发明提供了用于筛选能够治疗受试者的HEV感 染或戊型肝炎的候选药物的方法，其包括下述步骤：

(1)在给患有HEV的模型动物施用候选药物之前，测定来自所述动 物的尿液样品中HEV-Ag的第一水平；

(2)给所述动物施用候选药物；

(3)在给所述动物施用候选药物之后，测定来自所述动物的尿液样 品中HEV-Ag的第二水平；和

(4)将所述第一水平与第二水平进行比较，其中，如果所述第一水 平高于所述第二水平的话，则判断所述候选药物为能够治疗受试者的 HEV感染或戊型肝炎的候选药物。

在某些优选的实施方案中，所述测试动物是非人哺乳动物，例如 灵长类动物，例如食蟹猴或黑猩猩。

在某些优选的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，通过免疫学测定来测定所述尿液样品 中HEV-Ag的水平。在某些优选的实施方案中，所述免疫学测定选自 ELISA测定，Western印迹，表面等离子共振法，Elispot测定。

在某些优选的实施方案中，所述HEV-Ag为HEV的ORF 2和/或ORF 3编码的抗原。

在某些优选的实施方案中，使用抗HEV-Ag的抗体或其抗原结合片 段来测定HEV-Ag的水平，例如通过ELISA来进行测定。

在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为单克隆抗体或 多克隆抗体。在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为IgG 抗体或IgM抗体。

在某些优选的实施方案中，在进行步骤(1)和/或(3)之前，对来自 所述动物的尿液样品进行预处理。在某些优选的实施方案中，所述预 处理包括下列中的一项或多项：(a)稀释尿液样品；(b)调整尿液样品 的pH值；(c)从尿液样品中提取蛋白质；(d)去除尿液样品中的尿素、 尿酸和/或色素；和，(e)杀灭微生物或抑制微生物在尿液中的生长。

在另一个方面，本发明提供了能够测定HEV-Ag的存在或其水平的 第一试剂以及任选的用于预处理尿液的第二试剂用于制备试剂盒的用 途，所述试剂盒用于筛选能够治疗受试者的HEV感染或戊型肝炎的候 选药物。

在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂通过免疫学测定来测定 所述尿液样品中HEV-Ag的存在或其水平。进一步，在某些优选的实施 方案中，所述免疫学测定选自ELISA测定，Western印迹，表面等离 子共振法，Elispot测定。

在某些优选的实施方案中，所述HEV-Ag为HEV的ORF 2和/或ORF 3编码的抗原。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂包括抗HEV-Ag的抗体或 其抗原结合片段。进一步，在某些优选的实施方案中，所述第一试剂 通过ELISA来测定HEV-Ag的存在。

在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为单克隆抗体或 多克隆抗体。在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为IgG 抗体或IgM抗体。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括：(i)用于收集或贮 存尿液样品的装置；和/或(ii)用于进行所述测定所需的其他试剂(例 如缓冲液，稀释液，封闭液，经标记的抗抗体，和/或标准品)。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂包括选自下列的一种或 多种试剂：

用于稀释尿液的稀释剂(例如水或缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，柠 檬酸盐缓冲液)；

用于从尿液中提取蛋白质的提取试剂(例如三氯乙酸、丙酮)；

用于去除尿素和/或尿酸的试剂(例如异丁醛、镁盐和磷酸盐)；

用于杀灭微生物或抑制微生物在尿液中的生长的试剂(例如杀菌 剂，抑菌剂或防腐剂，例如氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮 化钠、甲基氯基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮)；

用于稳定尿液中的抗原的试剂(例如，葡萄糖、动物蛋白例如牛血 清白蛋白、小牛血清、明胶)；和

用于调节尿液表面张力和/或提高目的蛋白反应性的试剂(例如， 表面活性剂，例如吐温-20、吐温-80、Triton X-100)；用于调节尿液 pH值的试剂(例如NaOH，HCl)。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂包括选自下列的一种或 多种试剂：水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三氯乙酸、丙酮、 异丁醛、镁盐、氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮化钠、甲基 氯基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、葡萄糖、牛血清白蛋白、小牛血 清、明胶、吐温-20、吐温-80、Triton X-100、NaOH和HCl。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法 来筛选能够治疗受试者的HEV感染或戊型肝炎的候选药物:

(1)在给患有HEV的模型动物施用候选药物之前，使用第一试剂测 定来自所述动物的尿液样品中HEV-Ag的第一水平；

(2)给所述动物施用候选药物；

(3)在给所述动物施用候选药物之后，使用第一试剂测定来自所述 动物的尿液样品中HEV-Ag的第二水平；和

(4)将所述第一水平与第二水平进行比较，其中，如果所述第一水 平高于所述第二水平的话，则判断所述候选药物为能够治疗受试者的 HEV感染或戊型肝炎的候选药物。

在某些优选的实施方案中，所述测试动物是非人哺乳动物，例如 灵长类动物，例如食蟹猴或黑猩猩。

在某些优选的实施方案中，在进行步骤(1)和/或(3)之前，使用所 述第二试剂对来自所述动物的尿液样品进行预处理。在某些优选的实 施方案中，所述预处理包括下列中的一项或多项：(a)稀释尿液样品； (b)调整尿液样品的pH值；(c)从尿液样品中提取蛋白质；(d)去除尿 液样品中的尿素、尿酸和/或色素；和，(e)杀灭微生物或抑制微生物 在尿液中的生长。

在另一个方面，本发明提供了一种用于筛选能够治疗受试者的 HEV感染或戊型肝炎的候选药物的试剂盒，其包括：能够测定HEV-Ag 的存在或其水平的第一试剂，和，用于预处理尿液的第二试剂。

任选地，所述试剂盒还包括使用所述试剂盒来筛选能够治疗受试 者的HEV感染或戊型肝炎的候选药物的说明书。

在某些优选的实施方案中，所述受试者为哺乳动物，例如人。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂通过免疫学测定来测定 所述尿液样品中HEV-Ag的存在或其水平。进一步，在某些优选的实施 方案中，所述免疫学测定选自ELISA测定，Western印迹，表面等离 子共振法，Elispot测定。

在某些优选的实施方案中，所述HEV-Ag为HEV的ORF 2和/或ORF  3编码的抗原。

在某些优选的实施方案中，所述第一试剂包括抗HEV-Ag的抗体或 其抗原结合片段。进一步，在某些优选的实施方案中，所述第一试剂 通过ELISA来测定HEV-Ag的存在。

在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为单克隆抗体或 多克隆抗体。在某些优选的实施方案中，所述抗HEV-Ag的抗体为IgG 抗体或IgM抗体。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括：(i)用于收集或贮 存尿液样品的装置；和/或(ii)用于进行所述测定所需的其他试剂(例 如缓冲液，稀释液，封闭液，经标记的抗抗体，和/或标准品)。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂包括选自下列的一种或 多种试剂：

用于稀释尿液的稀释剂(例如水或缓冲液，例如磷酸盐缓冲液，柠 檬酸盐缓冲液)；

用于从尿液中提取蛋白质的提取试剂(例如三氯乙酸、丙酮)；

用于去除尿素和/或尿酸的试剂(例如异丁醛、镁盐和磷酸盐)；

用于杀灭微生物或抑制微生物在尿液中的生长的试剂(例如杀菌 剂，抑菌剂或防腐剂，例如氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮 化钠、甲基氯基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮)；

用于稳定尿液中的抗原的试剂(例如，葡萄糖、动物蛋白例如牛血 清白蛋白、小牛血清、明胶)；和

用于调节尿液表面张力和/或提高目的蛋白反应性的试剂(例如， 表面活性剂，例如吐温-20、吐温-80、Triton X-100)；用于调节尿液 pH值的试剂(例如NaOH，HCl)。

在某些优选的实施方案中，所述第二试剂包括选自下列的一种或 多种试剂：水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、三氯乙酸、丙酮、 异丁醛、镁盐、氯化物、EDTA、三羟甲基氨基甲烷、叠氮化钠、甲基 氯基异噻唑啉酮、甲基异噻唑啉酮、葡萄糖、牛血清白蛋白、小牛血 清、明胶、吐温-20、吐温-80、Triton X-100、NaOH和HCl。

在某些优选的实施方案中，所述试剂盒通过包括下述步骤的方法 来筛选能够治疗受试者的HEV感染或戊型肝炎的候选药物:

(1)在给患有HEV的模型动物施用候选药物之前，使用第一试剂测 定来自所述动物的尿液样品中HEV-Ag的第一水平；

(2)给所述动物施用候选药物；

(3)在给所述动物施用候选药物之后，使用第一试剂测定来自所述 动物的尿液样品中HEV-Ag的第二水平；和

(4)将所述第一水平与第二水平进行比较，其中，如果所述第一水 平高于所述第二水平的话，则判断所述候选药物为能够治疗受试者的 HEV感染或戊型肝炎的候选药物。

在某些优选的实施方案中，所述测试动物是非人哺乳动物，例如 灵长类动物，例如食蟹猴或黑猩猩。

在某些优选的实施方案中，在进行步骤(1)和/或(3)之前，使用所 述第二试剂对来自所述动物的尿液样品进行预处理。在某些优选的实 施方案中，所述预处理包括下列中的一项或多项：(a)稀释尿液样品； (b)调整尿液样品的pH值；(c)从尿液样品中提取蛋白质；(d)去除尿 液样品中的尿素、尿酸和/或色素；和，(e)杀灭微生物或抑制微生物 在尿液中的生长。

发明的有益效果

与现有技术相比，本发明的技术方案具有显著的有益技术效果， 这至少体现在以下方面：

(1)本发明方法所使用的样品为尿液。因此，与需要从受试者采 集血液的现有技术方法相比，本发明方法所涉及的样品收集、保存、 处理更加简便、快捷；

(2)本发明方法无须从受试者采集血液，无侵入性，其患者依从 性更好；

(3)本发明方法的特异性和灵敏度比使用血液/血清的现有技术 方法更高，这可能是因为与尿液相比，血液/血清中所包含的成分更加 复杂，导致检测的特异性和灵敏度下降。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但 是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而 不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描 述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显 然。

附图说明

图1显示了对食蟹猴7036的一系列尿液、血清、粪便样本中的 HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、肝肾指标进行检测的结果。

图2显示了对用人源4型HEV(WQ株)攻击的食蟹猴7004的一系 列尿液、血清、粪便样本中的HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、肝 肾指标进行检测的结果。

图3显示了对用人源1型HEV(W2-1株)攻击的食蟹猴7008的一 系列尿液、血清、粪便样本中的HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、 肝肾指标进行检测的结果。

图4显示了对用人源4型HEV(W2-4株)攻击的食蟹猴8007的一 系列尿液、血清、粪便样本中的HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、 肝肾指标进行检测的结果。

图5显示了对用食蟹猴7004的尿液攻击的食蟹猴1063的一系列 尿液、血清、粪便样本中的HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、肝肾 指标进行检测的结果。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描 述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检 测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2 版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分 子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所 述的方法进行。实施例中使用的、未注明其来源的仪器和试剂均为市 场上商购可得的常规仪器和试剂。本领域技术人员知晓，实施例以举 例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

下列实施例中主要涉及以下试剂：

戊型肝炎病毒抗原检测试剂盒(北京万泰生物药业股份有限公司， 货号HEV-0396)，按照制造商的说明书进行操作；

戊型肝炎病毒抗体IgG和IgM抗体检测试剂盒(北京万泰生物药业 股份有限公司，货号：HEV-0196和货号：HEV-0296)，按照制造商的 说明书进行操作；

RNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号：52906)，按照制造商的说明 书进行操作；

戊型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒(北京金豪制药股份有限 公司，货号：D0111)，按照制造商的说明书进行操作；

检测血清样品中的丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酸的水平的试剂 盒(日本和光纯药工业株式会社，货号：KH695)，按照制造商的说明书 进行操作。

实施例1.戊型肝炎病毒抗原(HEV-Ag)在尿液中的检出

在患者知情同意的情况下，从一位35岁慢性戊型肝炎患者(河北 省保定市传染病医院)收集同时间点的尿液样品和血清样品。然后根据 制造商的说明书，使用商购可得的试剂盒(见上文)，对尿液样品和血 清样品中的HEV抗原(ORF2抗原)、核酸、IgM和IgG抗体进行检测。 血清样品中的丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酸的水平使用常规试剂盒 (日本和光纯药工业株式会社，货号：KH695)，进行检测。检测前，血 清样品和尿液样品均保存于－80℃冰箱中。检测结果示于表1中。

表1：1位慢性戊型肝炎患者的尿液样品和血清样品的检测结果

注：ALT,丙氨酸转氨酶；AST,天冬氨酸转氨酸；NA,无法获得； “-”,阴性；“+”,阳性。

表1的检测结果显示：(1)尿液中的HEV抗原水平的变化趋势与 血清中的变化趋势基本上一致；(2)尿液中的HEV RNA水平的变化趋 势与血清中的变化趋势基本上一致；(3)在同一时间点，尿液中的抗 原水平(S/CO)显著高于血清中的抗原水平；(4)血清中能够检测到抗 HEV的IgM和IgG抗体，然而，尿液中无法检测到抗HEV抗体；(5)在 对该患者进行药物治疗后，尿液和血清中的核酸水平和抗原水平均开 始显著下降，直至转变为弱阳性或阴性。

为了确定HEV的核酸和抗原是否存在于其他戊型肝炎患者的尿液 中，并且不存在于非戊肝患者的尿液中，在知情同意的情况下，从传 染病医院收集15位受试者的尿液样品和血清样品，其中，5位受试者 为急性戊肝患者，5位受试者为慢性乙肝患者，且5位受试者为正常 献血员。使用与上述相同的方法和试剂盒，对尿液样品和血清样品中 的HEV抗原(ORF2抗原)、核酸、IgM和IgG抗体，以及血清样品中的 丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酸的水平进行检测。检测前，血清样品 和尿液样品均保存于－80℃冰箱中。检测结果示于表2-3中。

表2：5位急性戊肝患者的尿液样品和血清样品的检测结果

表3：其他10位受试者的尿液样品和血清样品的检测结果

注：ALT,丙氨酸转氨酶；AST,天冬氨酸转氨酸；“-”,阴性； “+”,阳性。

表2-3的检测结果显示：(1)在所有的急性戊肝患者的血清和尿 液中，HEV抗原的检测结果均为阳性(100％)；(2)在所有的急性戊肝 患者的血清中，HEV RNA的检测结果均为阳性(100％)；而仅60％的急性 戊肝患者的尿液中，HEV RNA的检测结果为阳性；(3)在所有非戊肝 患者(5位慢性乙肝患者，5位正常献血员)的血清和尿液中，HEV的核 酸、抗原、和IgM抗体的检测结果均为阴性；但是，在4份血清样品 中检测到了anti-HEV IgG抗体，这可能是因为这4个受试者存在既往 HEV感染。

表1-3的结果表明，HEV抗原特异性地存在于戊肝患者的血清和 尿液中，而不存在于非戊肝患者中。因此，尿液中的HEV抗原可用作 特异性诊断标志物，用于诊断HEV感染和戊型肝炎的存在。此外，表 1-3的结果还显示，对于同一时间点的同一患者，尿液中的HEV抗原 的水平显著高于血清中的HEV抗原的水平。因此，利用尿液中的HEV 抗原来诊断HEV感染和戊型肝炎的方法，与检测血液的方法相比，具 有更高的灵敏度。

实施例2.尿液中的HEV抗原与其它类型样本中HEV抗原的关系

为了研究尿液中HEV抗原在机体感染HEV后出现的时间点，以及 尿液中HEV抗原与其它类型样本中HEV抗原的关系等，建立了食蟹猴 感染HEV的灵长类动物模型。一共使用了5只食蟹猴(北京协尔鑫生物 资源研究所)，其中，编号为13C07004(以下简称7004)的食蟹猴用人 源4型HEV(毒株WQ)进行攻击；编号为13C07008(以下简称7008) 的食蟹猴用人源1型HEV(毒株W2-1)进行攻击；编号为13C08007(以 下简称8007)的食蟹猴用W2-4进行攻击；编号为13C01063(以下简称 1063)的食蟹猴用7004食蟹猴感染HEV后的尿液进行攻击；编号为 13C07036(以下简称7036)食蟹猴用作对照组，用病毒稀释液进行攻 击。所使用的HEV毒株WQ来源于北京佑安医院急性戊型肝炎患者粪便； HEV毒株W2-1来源于新疆戊型肝炎散发病例感染者粪便；HEV毒株 W2-4来源于北京佑安医院急性戊型肝炎患者粪便。攻击方案如下：实 验组4只猴，通过后肢静脉注射用HEV进行攻击，每只每次2.0mL， 连续两天。另设实验对照猴1只，后肢静脉注射PBS缓冲液，每次2.0mL， 连续两天。

使用实施例1中描述的方法，对感染前后的食蟹猴的尿液、血清 和粪便样本进行抗原、抗体、核酸、肝肾指标等标志物的检测。检测 结果示于图1-5中。

图1显示了对食蟹猴7036的一系列尿液、血清、粪便样本中的 HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、肝肾指标进行检测的结果。结果显 示，在整个实验过程中，尿液、血清、粪便样本中的HEV抗原和HEV 核酸的检测结果均为阴性；血清中的抗HEV抗体的检测结果均为阴性； 血清中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的水平保持正常。

图2显示了对食蟹猴7004的一系列尿液、血清、粪便样本中的 HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、肝肾指标进行检测的结果。食蟹猴 7004用人源4型HEV(WQ株)进行攻击。为了观察HEV病毒在全身组 织器官尤其是泌尿系统的分布，在感染后第4周处死了食蟹猴7004， 并对其组织进行了电镜、免疫组化、病理等观察。因此，该只食蟹猴 的尿液、血清、粪便样本中的病毒标志物的动态变化监测只进行了4 周。

图2的结果显示，在HEV攻击后1.5周，血清中的ALT和AST的 水平开始升高；其中，ALT水平在第2.5周达到峰值(314U/L)，AST 水平在第3周达到峰值(453U/L)；随后，ALT和AST的水平开始下降， 但在第4周仍未恢复正常(约80U/L)。

此外，在HEV攻击后1.5周，即可在尿液、血清和粪便中检测到 HEV抗原。其中，尿液中的HEV抗原水平在第1.5周明显升高(S/CO 值为15.1)，而后在第2.5周达到峰值(S/CO值高达19.3)；并且，在 第4周，尿液中的抗原仍然维持在高水平(S/CO值大于10.0)。血清中 的抗原水平在1.5周即达到峰值(S/CO值高达15.0)，此后略有降低， 但S/CO值也维持在10.0以上；在第3.5周，血清中的抗原水平开始 明显下降(S/CO值为4.0)，并且在第4周，血清中的抗原水平降至 CUTOFF值附近。粪便中的HEV抗原水平在第1.5周明显升高，在第2.5 周达到峰值(S/CO值为13.5)，并且此较高水平一直维持至第4周。

此外，尿液、血清和粪便中的HEV核酸的检测结果在第1.5周即 为阳性，并且该阳性结果一直持续至第4周。

此外，在尿液和粪便中未检测到抗HEV IgM和IgG抗体。血清中 的抗HEV IgM抗体的检测结果在第3周开始呈阳性，并且在第4周处 死食蟹猴之前，抗体S/CO值达到9.0。血清中的抗HEV IgG抗体的检 测结果在第2.5周开始呈阳性，并且高水平的抗体滴度一直持续第4 周。

图2的结果显示：在攻毒后1.5周，ALT、AST等肝功能指标开始 升高，同时尿液、血清、粪便中均能检测到HEV抗原和核酸，并且该 阳性结果一直持续至第4周。血清中的IgM和IgG抗体在攻毒后2.5 周产生，并且随着抗体的维持，ALT和AST等肝功能指标开始下降， 血清中的抗原水平也明显下降；然而，尿液和粪便中的抗原水平仍旧 维持在较高水平。与此同时，血清、尿液和粪便中HEV核酸的检测结 果仍为阳性，这表明食蟹猴7004仍在排毒，仍具感染性。

图3显示了对用人源1型HEV(W2-1株)攻击的食蟹猴7008的一 系列尿液、血清、粪便样本中的HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、 肝肾指标进行检测的结果。

图3的结果显示，在HEV攻击后2.5周，血清中的ALT和AST的 水平开始升高，并且在第3周达到峰值(ALT为483U/L，AST为120U/L)； 随后，ALT和AST的水平开始下降，并且在4周以后基本恢复正常。

此外，在HEV攻击后1周，即可在血清中检测到HEV抗原，但抗 原滴度不高。血清中的抗原水平在第3.5周达到峰值(S/CO值为4.1)， 且在第7周以后转为阴性。尿液中的HEV抗原水平在第1.5周明显升 高，而后在第4.5周达到峰值(此过程中，抗原一直维持在较高的水平， S/CO值平均在14.4左右)；随后，在第7周以后转为阴性。粪便中的 HEV抗原水平在第1.5周明显升高，在第2周达到峰值(S/CO值为12.9)， 并且在第3.5周以后转为阴性。

此外，血清和粪便中的HEV核酸的检测结果在第1周即为阳性， 但尿液中的HEV核酸的检测结果在第1.5周才转为阳性。尿液和粪便 中的HEV核酸阳性持续到4周，血清中的HEV核酸阳性持续到4.5周。

此外，在尿液和粪便中未检测到抗HEV IgM和IgG抗体。血清中 的抗HEV IgM抗体的检测结果在第2周开始呈阳性，并在第5.5周转 变为阴性。血清中的抗HEV IgG抗体的检测结果在第2.5周开始呈阳 性，并且高水平的抗体滴度一直持续第8周。

图4显示了对用人源4型HEV(W2-4株)攻击的食蟹猴8007的一 系列尿液、血清、粪便样本中的HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、 肝肾指标进行检测的结果。

图4的结果显示，在HEV攻击后3周，血清中的ALT开始升高并 达到峰值，AST也轻微升高；肝功能异常的情况持续1周，随之恢复 正常。

此外，在HEV攻击后1.5周，即可在尿液、血清和粪便中检测到 HEV抗原，并且抗原滴度很高(S/CO大于10.0)。抗原滴度在第2周达 到峰值(S/CO约为18.0～20.0)，之后尿液、血清和粪便中的抗原水平 开始下降。尿液中的抗原水平在第4周转变为阴性；血清中的抗原水 平在第3周转变为阴性；粪便中的抗原水平在第4.5周转变为阴性。

粪便中核酸的检出时间为1.5周-4周；血清中核酸的检出时间为 1.5周-3.5周；尿液中核酸的检出时间为1.5周-4周。

此外，在尿液和粪便中未检测到抗HEV IgM和IgG抗体。血清中 的抗HEV IgM抗体的检测结果在第3周开始呈阳性，但滴度不高，并 在第8周转变为阴性。血清中的抗HEV IgG抗体的检测结果在第3周 开始呈阳性，并且高水平的抗体滴度一直持续第8周。

图4的结果显示：尿液、血清、粪便中HEV抗原的检出要早于肝 功指标，其在第1.5周即可被检测到；然而，ALT和AST的异常出现 在攻毒后2.5周以后，并且随着抗体在第3周的产生，ALT和AST开 始恢复正常，尿液、血清、粪便中的抗原水平也明显下降，直至转为 阴性。

图5显示了对用食蟹猴7004的尿液攻击的食蟹猴1063的一系列 尿液、血清、粪便样本中的HEV抗原、HEV核酸、抗HEV抗体、肝肾 指标进行检测的结果。

用人源4型HEV(WQ株)攻击食蟹猴7004后1.5周-4.5周，尿液、 血清和粪便中持续检出抗原和核酸。选择2.5周和3周的尿液样本(这 两个时间点的尿液样本的抗原S/CO值均大于15.0，核酸荧光PCR检 测Ct值约22.0左右)，用于进行新一轮攻毒试验。

图5的结果显示，攻毒后2周-3周，HEV抗原最先在食蟹猴1063 的血清中被检测到，随后在尿液和粪便中被检测到。HEV抗原水平在 第4周-5周达到峰值，并在第9周趋于阴性。

此外，血清中的HEV核酸的检出时间与抗原的检出时间一致，均 是2周～7周；尿液中核酸的检出时间与抗原相比，晚1周；对于粪 便样品，在抗原阳性期间，核酸检测结果也为阳性。

此外，在尿液和粪便中未检测到抗HEV IgM和IgG抗体。血清中 的抗HEV IgM抗体和IgG抗体的检测结果均在第5周开始呈阳性，并 在第9周，IgM抗体转变为阴性，而IgG抗体继续维持。ALT和AST 的升高时间与IgM抗体的存在时间较一致，均为第5周-9周。

1063食蟹猴样品中各病毒标志物的动态变化关系符合HEV病毒感 染的特点：即，首先出现粪便和血清排毒，持续6-7周；同时，抗原 的检测结果转变为阳性，持续时间同核酸的检测结果基本一致；随后， 血液中出现IgM抗体，并持续到抗原和ALT均转为正常；在ALT升高 的同时，IgG抗体也随之升高，并持续很长时间。图5的实验结果表 明，戊型肝炎患者的尿液具有感染性。

图1-5的实验结果再次表明，尿液中的HEV抗原可用作诊断标志 物，用于诊断HEV感染和戊型肝炎的存在；并且，尿液中的HEV抗原 的水平显著高于血清中的HEV抗原的水平。因此，利用尿液中的HEV 抗原来诊断HEV感染和戊型肝炎的方法，与检测血液的方法相比，具 有更高的灵敏度。

实施例3.经预处理试剂处理的尿液样品的检测

取3份HEV-Ag阳性尿液样品，用含磷酸盐、小牛血清和Triton X-100的预处理试剂以1:1稀释，得经预处理的尿液样品。对经预处 理的尿液样品与未经预处理的原尿液样品进行平行的HEV-Ag检测。检 测结果示于表4中。

表4：经预处理与未经预处理的尿液样品的HEV-Ag检测结果

表4的检测结果显示：(1)在用预处理试剂处理1#样品后，本发 明方法的灵敏度提高，检测结果由假阴性转变为真阳性；(2)在用预 处理试剂处理2#和3#样品后，检测结果(HEV-Ag检测值)未发生明显 变化；但是，考虑到预处理试剂对样品的稀释作用，未发生明显变化 的HEV-Ag检测值事实上表明，在经过预处理后，对样品中的HEV-Ag 的检测灵敏度得到提高(即，能够检测更低浓度/含量的HEV-Ag，具有 更低的检测极限浓度)。因此，这些检测结果表明，可通过用预处理试 剂对尿液样品进行预处理，来进一步提高本发明方法检测尿液样品中 的HEV-Ag的检测灵敏度。因此，特别优选的是，本发明的试剂盒还包 含用于预处理尿液样品的预处理试剂。

取5份HEV-Ag阳性尿液样品，用阴性尿液或者含磷酸盐、小牛血 清和Triton X-100的预处理试剂进行稀释，随后在经历相同的保存条 件后，平行检测经稀释的尿液样品中的HEV-Ag。其中用阴性尿液稀释 的样品用作对照。检测结果示于表5中。

表5：用不同稀释液稀释的尿液样品的HEV-Ag检测结果

分析表5的检测结果，可得出以下结论：

(1)在经历相同的保存条件后，用预处理试剂稀释的样品的 HEV-Ag检测值均显著高于用阴性尿液稀释的相同样品。这表明，预处 理试剂的稀释/处理有助于提高本发明方法检测样品中的HEV-Ag的灵 敏度。

(2)与非破坏性保存条件(例如-15℃以下保存6天)相比，用阴性 尿液稀释的样品经历破坏性保存条件(例如37℃保存6天，或者冻融5 次)后，HEV-Ag检测值显著下降。其中，2#样品在37℃保存6天或者 冻融5次后灵敏度下降80％以上；3#样品在37℃保存6天后灵敏度下 降50％以上；4#样品在各破坏性条件下灵敏度下降30％-85％。这表明， 经历各种保存条件的尿液样品仍然可以通过本发明的方法进行检测； 然而，由于尿液样品中的HEV-Ag不是十分稳定(例如，其可由于不适 当的保存条件而遭受降解或破坏)，因此，经历不适当保存条件的尿液 样品的检测灵敏度可能会有所下降。

(3)与非破坏性保存条件(例如-15℃以下保存6天)相比，用预处 理试剂稀释的样品经历破坏性保存条件(例如37℃保存6天，或者冻 融5次)后，HEV-Ag检测值未发生明显变化，甚至略有上升。这表明， 预处理试剂有助于尿液样品抵抗各种不良保存条件的影响，能够稳定 尿液样品中的HEV-Ag。

因此，这些检测结果表明，可通过用预处理试剂对尿液样品进行 预处理，来进一步提高本发明方法检测尿液样品中的HEV-Ag的检测灵 敏度，提高尿液样品中的HEV-Ag的稳定性。因此，特别优选的是，本 发明的试剂盒还包含用于预处理尿液样品的预处理试剂。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术 人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和 变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。