一种微量制备型凝胶电泳装置及其使用方法

摘要

本发明涉及一种微量凝胶电泳装置及其使用方法，其特征在于：它包括制备型凝胶电泳分离装置和制备型凝胶电泳洗脱收集装置；制备型凝胶电泳分离装置包括两夹板、两制胶玻璃板、底座和制冷装置；两制胶玻璃板分别设置在两夹板内侧面设置的凹槽内，且两凹槽的深度均小于两制胶玻璃板的厚度；两夹板内侧面相对放置并通过螺钉锁紧后，插设在底座中；制冷装置包括两制冷片，两制冷片分别设置在两夹板外侧，并与两夹板的竖直面平行；制备型凝胶电泳洗脱收集装置包括两夹板、一电极盖和一收集槽；两夹板的内侧面相对放置并通过螺钉锁紧；电极盖设置在两夹板的上方，收集槽设置在两夹板下方。本发明可以广泛用于蛋白质组学分析以及药物蛋白质分离纯化中。

说明书

技术领域

本发明涉及生物分析和生物医药研究领域，特别是关于一种微量制备型凝胶电泳 装置及其使用方法。

背景技术

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术作为胶体电泳技术的一种 模式，被广泛应用于生物化学、鉴识科学、分子生物学、蛋白质组学和蛋白质药物等 研究和分析领域。SDS-PAGE技术的原理是利用蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳 的凝胶中分离。目前最常用的蛋白质分离分析和制备技术便是凝胶电泳和电泳洗脱。 其中，制备型凝胶电泳不仅可以在样品分析前降低样品的复杂程度、富集低丰度蛋白 质、去除高丰度蛋白质以及分离富集翻译后修饰蛋白质，提高蛋白质和蛋白质组质谱 分析的灵敏度、准确性和覆盖率，还可以用于一些蛋白质药物的分离纯化或整体蛋白 质从上到下(Top-down)质谱分析前的高效分离，因而受到广泛关注。

目前，制备型凝胶电泳系统多采用圆柱形或环柱形装置，以水冷解决散热问题， 在凝胶和正极之间放置半透膜，并在凝胶和半透膜之间留出一定空间，利用泵推动电 极液不断带走从凝胶中分离出的蛋白质并对其进行收集，从而达到蛋白制备的目的。 例如，陈金海发明的制备电泳系统以及日本科学家镇雄赤岩设计的多套制备电泳设备。 为了达到较高的分离度，这些设备普遍采用较长的分离部件，因而其体积一般比较庞 大，同时为了带走凝胶中产生的热量，往往需要较大体积的水冷却系统。另外，在实 际操作中，操作人员还需要每隔一段时间开关一次泵，将凝胶和正极之间分离的蛋白 馏分收集起来。以镇雄赤岩的制备电泳系统为例，制备一次血红样品蛋白需要收集至 少80次馏分，整个收集时间需要12个小时以上。这些缺点限制了大体积制备型凝胶 电泳系统在一般生物样品分离分析和蛋白质组学中的应用。最近，英国Expedeon公司 推出的商品化GELFREE 8100制备电泳仪也利用凝胶电泳技术分离和收集馏分实现电泳 制备的目的，但是其仪器本身也存在分离凝胶太短，分离度低以及洗脱时间长以及一 次性凝胶成本高等缺点。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种装置体积小、操作简便、分离和收集效 率高的微量制备型凝胶电泳装置及其使用方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种微量制备型凝胶电泳装置，其 特征在于：它包括制备型凝胶电泳分离装置和制备型凝胶电泳洗脱收集装置；所述制 备型凝胶电泳分离装置包括第一夹板、第二夹板、第一制胶玻璃板、第二制胶玻璃板、 一底座和一制冷装置；所述第一制胶玻璃板和第二制胶玻璃板分别设置在所述第一夹 板和第二夹板内侧面设置的凹槽内，且两所述凹槽的深度均小于所述第一制胶玻璃板 和第二制胶玻璃板的厚度；所述第一夹板和第二夹板内侧面相对放置并通过若干螺钉 锁紧，且所述第一夹板和第二夹板底部设置的凸台插设在所述底座中；所述制冷装置 包括两制冷片，两所述制冷片分别设置在所述第一夹板和第二夹板的外侧，并与所述 第一夹板和第二夹板的竖直面平行；所述制备型凝胶电泳洗脱收集装置包括第三夹板、 第四夹板、一电极盖和一收集槽；所述第三夹板和第四夹板的内侧面相对放置并通过 若干螺钉锁紧；所述电极盖设置在所述第三夹板和第四夹板的上方，所述收集槽设置 在所述第三夹板和第四夹板的下方。

所述第一夹板顶部设置有第一负极电极液槽，所述第一负极电极液槽底部设置有 两第一导线柱，两所述第一导线柱上缠绕有第一铂电极丝，且所述第一铂电极丝与设 置在所述第一夹板上表面的第一负极电极柱相连；所述第一负极电极液槽的内侧面设 置有第一开口，所述第一开口外围设置有第一“U”型硅橡胶条；所述第一“U”型硅 橡胶条部分嵌入于所述第一夹板的内侧面，且所述第一“U”型硅橡胶条所围面积略大 于所述第一开口；所述第一制胶玻璃板上端设置有一与所述第一负极电极液槽上所述 第一开口相应的第二开口。

所述底座为封闭箱体结构，其内部设置有两第二导线柱，两所述第二导线柱上缠 绕有第二铂电极丝，且所述第二铂电极丝与设置在所述底座上表面的第一正极电极柱 相连；所述底座的上表面还设置有第三开口，所述第三开口的宽度应满足能够放下所 述第一夹板、第二夹板、第一制胶玻璃板和第二制胶玻璃板。

所述第三夹板顶部并排设置有若干洗脱室，各所述洗脱室的内侧面均设置有第四 开口；每一所述洗脱室下方均设置有一直通所述第三夹板底部的纵向圆柱形通道；且 各所述洗脱室下方还设置有一横向圆柱形的收集槽开关，所述收集槽开关上设置有与 各所述纵向圆柱形通道匹配的孔洞，用于控制各所述洗脱室内液体的排出；所述第三 夹板内还设置有第三铂电极丝，所述第三铂电极丝贯穿所有所述洗脱室，并与设置在 所述第三夹板表面的第二正极电极柱相连。

所述第四夹板顶部设置有第二负极电极液槽，所述第二负极电极液槽底部设置有 第四铂电极丝，且所述第四铂电极丝与设置在所述第四夹板表面的第二负极电极柱相 连；所述第二负极电极液槽的内侧面上设置有若干第五开口，且各第五开口分别与所 述第三夹板的各所述洗脱室内侧面的所述第四开口相对应；所述第二负极电极液槽的 内侧面还设置有第二“U”型硅橡胶条，所述第二“U”型硅橡胶条部分嵌入于所述第 四夹板内侧面，且所述第二“U”型硅橡胶条所围面积略大于所述第二负极电极液槽； 所述电极盖上设置有两个分别与所述第三夹板和第四夹板上的所述第二正、负极电极 柱相匹配的母件；所述收集槽上设置有与所述第三夹板中各所述洗脱室相匹配的凹槽， 用于对各所述洗脱室内洗脱的蛋白馏分进行收集。

一种微量制备型凝胶电泳装置的使用方法，包括以下步骤：

1)将第一、第二制胶玻璃板分别插入到第一夹板和第二夹板对应的凹槽后，用螺 钉锁紧；2)配制所需浓度的相应溶液，并将其灌入制备型凝胶电泳分离装置的第一制 胶玻璃板和第二制胶玻璃板之间，静置片刻后形成固态的凝胶；3)从底座表面的第三 开口向底座内加入电极缓冲液，并将第一夹板、第一制胶玻璃板、第二制胶玻璃板和 第二夹板插入第三开口内；4)向第一负极电极液槽中加入电极缓冲液，直到电极缓冲 液通过第一制胶玻璃板上方的开口浸入到第一制胶玻璃板和第二制胶玻璃板之间；向 第一制胶玻璃板和第二制胶玻璃板之间加入样品蛋白；5)通过导线将第一正极电极柱 和第一负极电极柱与电源的正负极连接，根据具体实验要求，确定合适的电源参数完 成样品蛋白在凝胶上的分离；分离完成后，关闭电源，取出凝胶；6)将取出的凝胶平 铺在制备型凝胶电泳洗脱收集装置的第三夹板的内侧面上，然后将第四夹板的内侧面 向下，盖在第三夹板上，并用螺钉锁紧；7)分别向各洗脱室和第二负极电极液槽内加 入电极缓冲液，盖上电极盖，并关闭收集槽开关；通过导线将第二正极电极柱和第二 负极电极柱与电源的正负极连接，选择合适的电源参数，使得凝胶中的蛋白在垂直于 凝胶厚度方向上被洗脱至各洗脱室中；8)洗脱完毕后，关闭电源并打开收集槽开关， 使得各洗脱室内的溶液分别进入到下方的收集槽内，采用移液枪将收集槽内的溶液吸 至样品管中即可完成收集，以待后续分析和使用。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明由于制备型凝胶电泳 分离装置中正、负电极液槽分别位于凝胶的上、下方，正、负电极缓冲液与凝胶形成 垂直电泳，分离所需时间短，具有更高的分离效率。2、本发明由于制备型凝胶电泳洗 脱收集装置中负极电极液槽和各洗脱室分别位于凝胶的两侧，收集时是基于凝胶厚度 方向上的电洗脱来完成，由于凝胶厚度远远小于凝胶长度和宽度，因此本发明在收集 时所需时间短，相比传统制备电泳更加高效。3、本发明由于制备型凝胶电泳分离装置 的两夹板采用长方形结构，制冷装置的两个制冷片分别位于两夹板外侧，对凝胶进行 散热，体积小巧，而且散热性能好。4、本发明操作简单，实验者只需完成配胶、上样、 取胶、加洗脱液以及电源设置的操作即可完成制备过程，相比传统制备电泳需要长时 间频繁取出洗脱产物，操作更加简便和人性化。5、本发明由于是在两制胶玻璃板之间 配制所需凝胶，针对不同样本可自由选择凝胶的配制，灵活性更强，相比传统制备电 泳每次实验都需要商品化的凝胶柱，降低了成本。6、本发明由于各部件都可以反复拆 卸，成本低，易于重复使用。本发明结构简单，操作方便，可以广泛应用于蛋白质组 学研究领域中。

附图说明

图1是本发明制备型凝胶电泳分离装置原理图

图2是本发明制备型凝胶电泳洗脱收集装置原理图

图3是本发明底座结构示意图

图4是本发明底座剖面图

图5是本发明制备型凝胶电泳洗脱收集装置中一夹板示意图

图6是本发明制备型凝胶电泳洗脱收集装置中另一夹板示意图

图7是本发明制备型凝胶电泳洗脱收集装置中电极盖示意图

图8是本发明制备型凝胶电泳洗脱收集装置中收集槽示意图

图9是采用本发明对样品蛋白进行分离后的凝胶染色扫描图

图10是采用本发明收集样品蛋白后，取出其中的凝胶并进行染色的图

图11是采用本发明对图9中的样品蛋白进行收集后的凝胶染色扫描图

图12是采用本发明对样品蛋白进行分离后的凝胶染色扫描图

图13是采用本发明对图12中的样品蛋白进行收集后的凝胶染色扫描图

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细的描述。

如图1、图2所示，本发明微量制备型凝胶电泳装置包括制备型凝胶电泳分离装 置1和制备型凝胶电泳洗脱收集装置2。制备型凝胶电泳分离装置1完成样品蛋白在 凝胶上的分离，制备型凝胶电泳洗脱收集装置2对凝胶上已分离的样品蛋白进行洗脱 收集。其中，制备型凝胶电泳分离装置1包括两夹板11、12、两制胶玻璃板13、14、 一底座15和一制冷装置。两制胶玻璃板13、14分别设置在两夹板11、12内侧面设置 的凹槽内，且凹槽的深度小于两制胶玻璃板13、14的厚度。夹板11、12内侧面相对 放置并通过若干螺钉锁紧，且两夹板11、12底部设置的凸台插设在底座15中。制冷 装置包括两制冷片，分别设置在夹板11和夹板12的外侧，并与夹板11、12的竖直面 平行。制备型凝胶电泳洗脱收集装置2包括两夹板21、22、一电极盖23和一收集槽 24。两夹板21、22的内侧面相对放置并通过若干螺钉锁紧。电极盖23设置在两夹板 21、22的上方，收集槽24设置在两夹板21、22的下方。

如图1所示，夹板11顶部设置有一负极电极液槽111，负极电极液槽111底部设 置有两导线柱112，两导线柱112上缠绕有铂电极丝113，且该铂电极丝113与设置在 夹板11上表面的负极电极柱114相连。负极电极液槽111的内侧面设置有一开口115， 开口115外围设置有一“U”型硅橡胶条116，“U”型硅橡胶条116部分嵌入于夹板 11的内侧面，且“U”型硅橡胶条116所围面积略大于开口115。制胶玻璃板13上端 也设置有一与负极电极液槽111上开口115相应的开口131。

如图3、图4所示，底座15为封闭箱体结构，其内部设置有两导线柱151，两导 线柱151上缠绕有铂电极丝152，且该铂电极丝152与设置在底座15上表面的正极电 极柱153相连。底座15的上表面还设置有一开口154，开口154的宽度应满足能够放 置下两夹板11、12以及两制胶玻璃板13、14。

如图5所示，夹板21顶部并排设置有若干洗脱室211，且各洗脱室211的内侧面 均设置有一开口212。每一洗脱室211底部均设置有一直通夹板21底部的纵向圆柱形 通道213，且各洗脱室211下方还设置有一横向圆柱形收集槽开关214，收集槽开关 214上设置有与各纵向圆柱形通道213匹配的孔洞，用于控制各洗脱室211内液体的 排出。夹板21内部还设置有一铂电极丝215，铂电极丝215贯穿所有洗脱室211，并 与设置在夹板21表面的正极电极柱216相连。

如图6所示，夹板22顶部设置有一负极电极液槽221，负极电极液槽221底部设 置有一铂电极丝222，且铂电极丝222与设置在夹板22表面的负极电极柱223相连。 负极电极液槽221的内侧面上设置有若干开口224，且各开口224分别与夹板21的各 洗脱室211内侧面的开口212相对应。负极电极液槽221的内侧面还设置有一“U”型 硅橡胶条225，“U”型硅橡胶条225部分嵌入于夹板22内，且“U”型硅橡胶条225 所围面积略大于负极电极液槽221。

如图7、图8所示，电极盖23上设置有两个分别与夹板21、22上的正、负极电 极柱216、223相匹配的母件231。收集槽24上设置有与夹板21中各洗脱室211相匹 配的凹槽241，用于对各洗脱室211内洗脱的蛋白馏分进行收集。

上述实施例中，制备型凝胶电泳分离装置1中的夹板11下部还设置有一矩形孔洞， 且矩形孔洞位于负极电极液槽111的下方。夹板12上也设置有一与夹板11相对称的 矩形孔洞，用于使得制冷装置16更好的为两制胶玻璃板13、14之间的凝胶散热。

上述实施例中，制备型凝胶电泳洗脱收集装置2中的夹板22顶部的负极电极液槽 221内设置有若干支撑226，用于防止夹板22的侧面在实验过程中弯曲。

基于本发明微量制备型凝胶电泳装置，本发明的使用方法包括以下步骤：

1)首先将两制胶玻璃板13、14分别插入到夹板11、12对应的凹槽内，用螺钉依 次将夹板11、两制胶玻璃板13、14和夹板12锁紧。其中，“U”型硅橡胶条116为制 胶玻璃板13提供缓冲。

2)配制所需浓度的相应溶液，并将其灌入制备型凝胶电泳分离装置1的两块制胶 玻璃板13、14内，静置片刻后形成固态的凝胶。

3)从底座15表面的开口154向底座15内加入电极缓冲液，并将夹板11、两制 胶玻璃板13、14和夹板12插入开口154内。

4)向负极电极液槽111中加入电极缓冲液，直到电极缓冲液通过制胶玻璃板13 上方的开口浸入到两制胶玻璃板13、14之间，“U”型硅橡胶条116可以防止负极电极 液槽111与制胶玻璃板13之间漏液。之后，向两制胶玻璃板13、14之间加入样品蛋 白，由于样品蛋白密度较大，其会由电极缓冲液下降至凝胶上方的上样槽(即凝胶配 制后在凝胶上方形成的凹槽)中。

5)通过导线分别将正、负极电极柱153、114与电源的正负极连接，根据具体实 验要求，确定合适的电源参数完成样品蛋白在凝胶上的分离，此时，凝胶上的样品蛋 白会按照分子量大小分离成带状(如图9所示)。关闭电源，拧开螺钉从两夹板11、 12中取出两制胶玻璃板13、14，并从两制胶玻璃板13、14中取出凝胶。

6)将取出的凝胶小心地平铺在制备型凝胶电泳洗脱收集装置2的夹板22的内侧 面上，然后将夹板21的内侧面向下，盖在夹板22的内侧面上，并用螺钉25锁紧。“U” 型硅橡胶条225用于为凝胶提供缓冲，既不使凝胶出现较大幅度变形，也不使凝胶于 夹板21、22之间存在太大空隙，同时防止漏液。

7)分别向各洗脱室211和负极电极液槽221内加入电极缓冲液后，盖上电极盖 23，并确保收集槽开关214处于关闭状态。通过导线分别将正、负极电极柱216、223 与电源的正负极连接，选择合适的电源参数，如电压50V-70V，电流10mA-50mA，使得 蛋白在垂直于凝胶厚度方向上被洗脱至各洗脱室211中。

8)洗脱完毕后，关闭电源并打开收集槽开关214，使得各洗脱室211内的溶液分 别进入到下方对应的收集槽24内，采用移液枪将收集槽24内的溶液吸至样品管中即 可完成收集，以待后续分析和使用。

本发明制备型凝胶电泳分离装置1可以实现一个生物样品在凝胶上的分离。当灌 注的凝胶为SDS-PAGE凝胶时，则样品蛋白中的蛋白会按其分子量由大到小分布在 SDS-PAGE凝胶的负极端到正极端；当灌注的凝胶是非变性聚丙烯酰胺(Native-PAGE) 凝胶时，则样品中的蛋白会依据它们的分子量大小以及所带电荷进行分离。当样品蛋 白在相应凝胶上分离后，将其放置在制备型凝胶电泳洗脱收集装置2中。在一定的电 压和电流条件下，凝胶中的蛋白会从凝胶厚度方向、根据各自的分子量对应的不同蛋 白条带进入相应的蛋白分子量区间所在的洗脱室211，实现对不同蛋白馏分的洗脱和 收集。收集后的蛋白馏分可进行质谱、液相色谱检测或满足其他制备需要。下面结合 具体实施例，对本发明做进一步介绍。

实施例1

采用本发明对牛血清白蛋白、β-酪蛋白、马心肌红蛋白和α-乳白蛋白混合物(以 下简称样品蛋白)进行分离和洗脱收集，并对其性能进行研究。其中，样品蛋白的制 备方法为：称取牛血清白蛋白、β-酪蛋白、马心肌红蛋白和α-乳白蛋白各500μg 左右，混合后，加入纯净水、5×SDS-PAGE上样缓冲液(250mM三羟甲基氨基甲烷盐酸 (Tris-HCl)(pH＝6.8)，10％(w/v)SDS，0.5％(w/v)溴酚蓝，50％(v/v)甘油)和β-巯 基乙醇，配制成10μg/μL的标准蛋白混合物溶液，其中含有1×SDS-PAGE上样缓冲 液和1％的β-巯基乙醇，在沸水浴中加热变性10分钟，置于-20℃备用。

如图9所示，采用制备型凝胶电泳分离装置对样品蛋白进行分离。分别配制12％ 的聚丙烯酰胺凝胶分离胶和4％的聚丙烯酰胺凝胶浓缩胶，将其灌入两制胶玻璃板13 之间。待凝胶凝固后，分别向正极电极液槽141和负极电极液槽111中加入电极缓冲 液，向上样槽中加入15μL(150μg)以上的标准蛋白混合物溶液。接通电源，旋转电 压为90V-160V，对样品蛋白进行分离。待蓝色的溴酚蓝条带移动至接近制备型凝胶电 泳分离装置的下沿时停止分离。取出凝胶，用考马斯亮蓝染色。从图中可以看出，本 发明实现了对4种标准蛋白的高效分离，且经多次试验后均有很好的分离效果，说明 本发明具有很好的重复性。

如图10所示，采用本发明制备型凝胶电泳洗脱收集装置2对分离出的凝胶进行洗 脱收集，并对洗脱收集后的凝胶用考马斯亮蓝进行染色。从图中可以看出，收集后的 凝胶中除了收集槽24边缘和收集槽24间隔所对应的位置外，其余部分均无蛋白残留， 说明本发明可以达到完全洗脱的目的。

如图11所示，将收集到的样品管内的样品进行冻干浓缩，并进行SDS-PAGE实验。 可以看出，收集的样品在SDS-PAGE上的蛋白质条带按分子量大小排列，说明本发明可 以按照蛋白质分子量大小不同对其进行分离。

实施例2

如图12所示，采用本发明制备型凝胶电泳分离装置1对Bacillus subtilis LM 4-2 真菌细胞中蛋白质进行分离。利用超声仪破碎Bacillus subtilis LM 4-2真菌细胞， 提取真菌全蛋白，将蛋白浓度浓缩至10-20μg/μL后，对蛋白进行热变性，然后在制 备型凝胶电泳分离装置中上样，方法同实施例1。可以看出，本发明可以按照蛋白质 分子量大小不同对生物实际样本进行分离。

如图13所示，采用本发明制备型凝胶电泳洗脱收集装置2对分离出的凝胶进行洗 脱和收集。可以看出，真菌全蛋白各组分在SDS-PAGE上的蛋白条带按分子量大小排列， 说明本发明可以达到对复杂生物样本中蛋白质进行高效分离的目的。

实施例3

采用本发明对样品蛋白进行分离和洗脱收集，并计算其回收率。首先称取牛血清 白蛋白(BSA)55μg，加入纯净水、5×SDS-PAGE上样缓冲液(250mMTris-HCl(pH＝6.8)， 10％(w/v)SDS，0.5％(w/v)溴酚蓝，50％(v/v)甘油)和β-巯基乙醇，配制成5μg/μL 的标准蛋白溶液，其中含有1×SDS-PAGE上样缓冲液和1％的β-巯基乙醇。将标准蛋 白溶液在沸水浴中加热变性10分钟后，分别采用制备型凝胶电泳分离装置1和制备型 凝胶电泳洗脱收集装置2对其进行分离和洗脱收集。收集完成后，将各组分冻干重溶 至200μL。

然后，配制标准浓度为0.1μg/μL和0.5μg/μL的BSA水溶液各200μL，分别 在液相色谱中上样(色谱柱：C18反相色谱柱；流动相A：98％H₂O,2％ACN；流动相B： 98％ACN，2％H₂O；0-20min，5％流动相B-95％流动相B；20-30min，95％流动相B)。观察 样品在液相中的出峰时间和峰面积，得到：0.1μg/μL的BSA水溶液出峰时间为 12.8-13.2min，峰面积为419.98；0.5μg/μL的BSA水溶液出峰时间为12.8-13.2min， 峰面积为2428.42。之后，将收集到的各组分(组分1-组分15)依次在液相色谱中上 样，观察各组分在12.8-13.2min时的出峰面积，利用夹心法，根据标准浓度的BSA 在液相色谱中上样的峰面积计算出收集到的BSA总量，可得本发明的回收率为70.9％。

上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、连接方式和制作工艺等都 是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应 排除在本发明的保护范围之外。