一种微量制备型凝胶电泳装置的研制

摘要

蛋白质混合物的高效分离对蛋白质以及蛋白质组的定性和定量分析及应用具有重要意义，但由于蛋白质种类多，动态范围宽，其分离和制备面临巨大挑战。目前，蛋白质组学中常用的蛋白质混合物高效分离技术主要包括高效液相色谱和电泳技术。电泳技术相较于高效液相色谱，其优势是分离度高，并且可以得到等电点、相对分子质量信息，其劣势是费时费力，自动化程度低，且难以用于蛋白质的制备。制备电泳技术是在制备电泳装置中对目标物质进行分离、纯化和收集制备的一种技术。在过去的几十年里，制备电泳技术和制备型电泳装置取得了很大的进展，其制备量也从毫克级的蛋白质逐渐减少到微克级的蛋白质，可满足蛋白质组学研究需求。现已商品化的制备型电泳装置分为毫克级制备型电泳装置和微克级制备型电泳装置。毫克级制备型电泳装置多为早期的装置，其不足是样品分离和收集的耗时很长（通常在10 h以上），回收率低，收集的过程中需不断补充洗脱液，实验过程较为繁琐，且只能用于毫克级以上的蛋白质样品的制备；近年来，微克级制备型电泳装置的发展较为迅速，但也存在诸如实验过程繁琐、样品分离度不够高等问题。为此，我们设计制作了一套微量级制备型凝胶电泳装置，用于实验室的微量级快速、简便的蛋白质分离与制备，其制备过程为：首先将微克级的蛋白质按照分子量大小进行分离，然后转移凝胶至洗脱收集装置中对蛋白质进行洗脱收集。对此套制备型凝胶电泳装置的性能测试结果表明，该装置可以简便、高效、高回收率地完成蛋白质样品的分离制备。
　　本论文由三章组成。第一章介绍了现有的分离分析技术在蛋白质组学中的发展与现状，尤其是对制备型电泳方法与技术做了详细的概述。同时，第一章还包括本研究的内容、所要解决的具体问题以及研究意义。
　　在第二章，介绍了我们设计并制作的一套制备型凝胶电泳与紫外检测联用装置。该装置通过将改进的平板凝胶电泳装置与外部气体压缩泵、高压储液罐、紫外检测器、电脑以及馏分收集器相连，实现了在线完成蛋白样品组分的分离、检测与回收的目标。在对装置的性能测试与评价实验中，采用马心肌红蛋白和牛血清白蛋白作为标准蛋白混合物，考察了该装置分离性能，紫外吸收光谱结果表明成功分离了这两个蛋白。尽管如此，在实验中我们发现该装置存在有许多问题：整个实验过程耗时过长，装置漏液现象严重，正极处产生气泡现象对检测和收集产生影响，而且装置在加工中成型慢，加工周期长，这些都是我们进一步改进备型凝胶电泳设计时需要解决的问题。
　　在第三章，介绍了在制备型凝胶电泳与紫外检测联用装置基础上的一种新型制备型凝胶电泳装置。为了解决制备型凝胶电泳与紫外检测联用装置存在的诸多问题，我们将装置由在线检测改为了离线检测，并基于3D打印技术和数字控制加工技术，设计了制作简单，成型快，周期短，精度高的制备型凝胶电泳分离-洗脱联用装置。按照蛋白质分离与洗脱方向的不同，可分为横向洗脱和垂直洗脱制备型凝胶电泳分离-洗脱联用两种装置。通过对设计制作的制备型凝胶电泳分离-洗脱联用装置的机械强度、防漏液与操作性能测试，对符合要求的装置进一步进行了蛋白样本分离、洗脱回收、分离度、回收率、洗脱时间以及洗脱样本的液相色谱-质谱分析等测试。在优化设计和性能测试的基础上，确定定型的制备型凝胶电泳装置为垂直洗脱的制备型凝胶电泳分离-洗脱联用装置。蛋白混合物分离实验结果表明制备型凝胶电泳分离装置不仅能够对蛋白质样本进行高效分离，而且具有高的重复性；在采用制备型凝胶电泳洗脱装置进行的洗脱实验中，由于蛋白样本垂直于凝胶厚度方向洗脱，因此，在最佳洗脱条件下，洗脱时间少于20分钟，碳酸酐酶的回收率高达91.8％，实现了快速、高回收率的洗脱，优于同类型的商品化的制备型凝胶电泳装置。将垂直洗脱的制备型凝胶电泳分离-洗脱联用装置用于标准蛋白混合物以及酵母全蛋白的分离与制备，其分离度和分离效率均优于商品化的制备型凝胶电泳装置。将该装置作为预分离手段，与液相色谱-质谱联用，对10μg的牛血清白蛋白进行分离、洗脱后进行FASP（ filter aided proteome preparation）酶解与经过该分离装置分离后进行胶内酶解做了对比，结果表明，经该装置分离、洗脱和FASP酶解的方法最多鉴定到94个特异性肽段，平均蛋白质序列覆盖率为90.12%；经该分离装置分离后进行胶内酶解，最多鉴定到70个特异性肽段，平均蛋白质序列覆盖率为86%。同样地，我们对20μg的酵母蛋白提取物也做了上述对比实验，结果表明，相同条件下使用该装置分离、洗脱和FASP酶解的方法鉴定到的肽段数目、序列覆盖率大于50%的蛋白数目以及打分值大于1000的蛋白数目均远远多于利用该装置分离后进行胶内酶解所鉴定到的相应的肽段数目和蛋白数目。以上实验说明使用该装置进行分离、洗脱后进行FASP酶解的方法更有利于蛋白质样品的鉴定，可有效解决凝胶电泳分离后胶上酶切时蛋白质提取效率低的问题。
　　我们在垂直洗脱的制备型凝胶电泳分离-洗脱联用装置的基础上，加入了半导体制冷片等部件，完成了一整套制备型凝胶电泳系统的制作。该系统可作为蛋白质样品预分离手段，大大降低蛋白质样本的复杂度，也可帮助去除高丰度蛋白，发现低丰度蛋白。另外，该装置也有助于“自上而下”（“Top-down”）的蛋白质组学研究策略的应用。

目录

缩略词表

第一章 前言

1.1 蛋白质组学及其主要研究方法

1.2 分离分析技术的进展

1.3 蛋白质预分离技术

1.4 制备型电泳方法与技术

1.5 本论文的选题背景及研究内容

第二章 制备型凝胶电泳与紫外检测联用装置

2.1 设计思路与装置原理

2.2 制作与加工

2.3 实验部分

2.4 结论

第三章 微量制备型凝胶电泳分离-洗脱装置

3.1 设计工具与加工方式

3.2制备型凝胶电泳分离-洗脱装置设计、制作、性能验证与评价

3.3 结论

第四章 结论

参考文献

发表论文

个人简历

致谢